专利名称：用于诱导免疫的脂质体组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用被覆低聚糖的脂质体的、用于诱导免疫的脂质体组
合物。更具体地说，本发明涉及的被覆低聚糖的脂质体的特征在于在 腹腔内施用时被腹腔内的巨噬细胞摄取，抗原肽呈递在MHC I类分子和 II类分子上。
背景技术：
在癌症死亡人数中，胃癌死亡人数仅次于肺癌，其主要原因是向腹 腔内各器官播散性转移。因此，为了克服该问题，必须开发可以控制腹 膜转移及其发展的免疫疗法。
通过免疫系统来排斥癌的主要效应细胞是细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocytes: CTL)，为了发挥其功能，辅助T细胞(Th)的辅 助发挥了很大的作用。因此，同时活化两种细胞群对于诱发有效的免疫 反应是必须的，使用辅助细胞(Th)表位和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表 位两者作为抗原的癌症的免疫疗法正在进行深入研究。
如上所述，为了获得效率好的免疫反应，必须同时活化辅助T细胞 (Th)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL),为此，最理想的是用含有Th表位 (MHCII类)和CTL表位(MHCI类)两者的抗原进行免疫。但是，已知如 果只是用蛋白质直接免疫，则CTL难以,皮有效活化。通常已知内源性抗 原呈递在MHCI类上，外源性抗原呈递在MHCII类上。但是，被象巨 噬细胞这样的抗原呈递细胞摄取的外源性抗原容易通过MHC II类呈 递。即，在单独接种抗原作为疫苗进行免疫时，与通过MHCI类分子的 抗原呈递有关的CTL难以有效活化。
通过免疫系统来排斥癌症的主要效应细胞是CTL,因此，人们进行 了使外源性抗原在I类分子上呈递的尝试。作为免疫疗法，采取了(l)从 患者采集抗原呈递细胞并培养，添加抗原肽，再返回到患者体内的方 法；或者(2)向抗原呈递细胞中导入抗原基因等方法。上述方法在技术、 伦理、成本等方面均存在很多问题，还必须要进行免疫所适合的癌症抗 原的鉴定。并且，在上述(l)的方法为了同时活化多个Th/CTL,必须鉴
定Th/CTL的两个表位。
结合多糖的脂质体中，已知(普鲁兰和甘露聚糖)可被巨噬细胞摄 取，并且显示在MHCI类分子上呈递。免疫疗法中尝试了将抗原结合在 这些多糖上进行施用的方法。但是，这些多糖结构存在抗原性或毒性， 对人4吏用未必安全。并且还未见可在MHC II类分子上呈递的证明。
发明内容
本发明是以解决上述以往技术的问题作为要解决的课题。即，本发 明要解决的课题是提供可以使抗原物质在作为抗原呈递细胞的MHC I 类分子和II类分子上有效呈递的脂质体组合物。
本发明人为解决上述课题进行了深入的研究，结果发现通过将抗 原包封于被覆有低聚甘露糖的脂质体(MCL)来施用，可以将抗原送达至 巨噬细胞。这是巨噬细胞经所表达的甘露糖受体介导的反应，因此巨噬 细胞特异性、且主动地摄取施用到腹腔内的脂质体并活化。继而引发的 免疫反应中，在自身的MHC I类和II类分子上呈递包封的抗原，并游 走至胃网膜与肠系膜的结外淋巴组织中，活化细胞性免疫。此时，巨噬 细胞中，可在自身的MHC I类和II类两种分子上呈递来自包封抗原的 肽，并游走至区域淋巴结中。在使用小鼠进行实验中，摄取了腹腔内施 用的MCL的巨噬细胞活化，并到达区域淋巴组织中，同时，在MHCI 类分子和MHC II类分子两者上呈递来自包封抗原的肽，活化Th和CTL 两种细胞群，可以生成IFN-y。本发明4艮据上述i人识完成。
即，本发明可提供含有被覆低聚糖的脂质体和抗原物质、在抗原呈 递细胞的MHC I类分子和II类分子上呈递抗原肽的脂质体组合物。
优选低聚糖为低聚甘露糖。
优选低聚糖为甘露五糖或甘露三糖。
优选抗原物质为癌抗原。
优选本发明的脂质体组合物腹腔内、皮下或鼻腔粘膜内施用，被巨 噬细胞等抗原呈递细胞摄取，抗原肽在MHC I类分子和II类分子上呈递。
优选本发明的脂质体组合物用于诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。 实施发明的最佳方式
以下，对本发明的实施方案进行具体说明。
本发明人使用卵清蛋白(OVA)作为模型抗原，在将外源性抗原蛋白 质包封入被覆低聚甘露糖的脂质体(MCL)中并施用时，明确了抗原不仅 在MHCII类上、也可在MHCI类上呈递。卯清蛋白(OVA)或OVA肽包 封于被覆甘露糖的脂质体中，直接施用腹腔，则可顺畅地被巨噬细胞摄 取。之后，从腹腔内回收巨噬细胞，培养24小时，与来自小鼠OT-I的 脾CD8阳性T淋巴细胞混合培养，从将OVA溶解于PBS并注入腹腔的 小鼠体内回收时，几乎未见IFN-y的生成，但是在包封于被覆低聚甘露 糖的脂质体中时，则可见IFN-y的生成，其中，所述小鼠中导入了在I 类分子上呈递的OVA肽特异性T细胞受体基因(Tg)。该结果明确了 包封入MCL中的OVA被巨噬细胞摄取后，OVA肽在MHC I类分子上 呈递。另一方面，如果直接施用OVA,也同样被巨噬细胞摄取，但未见 IFN-y的生成，因此，可以认为并未在MHCI类分子上呈递。由此证实 通过将抗原蛋白质或抗原肽包封入MCL中并施用，可以在抗原呈递细 胞MHC I类分子上有效地呈递抗原。
另一方面，与来自小鼠OT-2的脾CD4阳性T淋巴细胞混合培养， 该小鼠中导入了在MHC II类分子上呈递的OVA肽特性异T细胞受体基 因(Tg),则诱导生成在MHC II类分子上呈递的OVA肽特异性IFN-y, 包封于被覆低聚甘露糖的脂质体中时、直接接种时均显示可效率良好地 呈递。
将包封了小鼠EL4淋巴瘤可溶性蛋白的MCL皮下施用于同系小鼠 时，观察到在直接施用可溶解物时几乎没有见过的、对EL4的强烈的 CTL活性，即，这显示皮下施用时也寻皮抗原呈递细胞摄取，抗原肽在 MHCI类分子上有效呈递。并且，该结果显示即使抗原蛋白未知或者 未纯化，通过将癌细胞的提取液包封于被覆甘露糖的脂质体中进行施 用，也可以在MHC I类分子上呈递例如可诱导CTL的肽，由此显示可 有效地作为获得癌症疫苗效果的手段。
本发明的脂质体组合物可以作为药物递送系统使用。这里，药物递 送系统是指药剂送达系统。通常，施用药时，药物在全身扩散，该系统 是指防止扩散并将药物有效地送达目标组织或细胞的技术。药物递送系 统可以降低副作用，提高药效。
本发明中所述的脂质体是指由磷脂构成的双层膜的人工小泡。膜的
内侧分布亲水性部分，外侧分布疏水性部分。内腔可包封亲水性的化合 物，可用作抗癌药等的药物递送系统。
本发明的脂质体组合物的特征在于含有被覆低聚糖的脂质体和抗 原物质，用于使来自抗原物质的抗原肽在抗原呈递细胞的MHC I类分子 和II类分子上呈递。更具体地说，本发明的脂质体组合物于腹腔内施用 时，被腹腔内巨噬细胞等抗原呈递细胞摄取，抗原肽在MHCI类分子和 II类分子上呈递。
巨噬细胞是具有吞噬作用的细胞，识别体内不存在的外来物质、或 者已经不能认为是构成生物体的细胞的死亡细胞(编程性细胞死亡)、癌 细胞等并将其摄取、消化。被消化的蛋白质、特别是作为免疫系统攻击 对象的标志肽片段在细胞表面呈递，发挥向免疫网络通知攻击对象的司 令塔的作用。
本发明中使用的被覆低聚糖的脂质体例如可使用日本专利第 2828391号公报所述的脂质体。构成低聚糖的糖成分的种类没有特别限 定，例如有D-甘露糖(D-Man)、 L-岩藻糖(L-Fuc)、 D-乙酰葡糖胺(D-GlcNAc)、 D-葡萄糖(D画Glc)、 D-半乳糖(D-Gal)、 D漏乙酰半乳糖胺(D画 GalNAc)、 D-鼠李糖(D-Rha)等。
j氐聚糖中，各构成糖可以通过a1—2 4建、al—3 4建、a1—4 4定、a1—6 键或(31—4键等或它们的组合结合。例如，甘露糖可以通过上述键构成 单链，或者通过al—3键与al—6键的组合构成分支结构。低聚糖中的 单糖数目优选为2-11个。具体的低聚糖例如有甘露二糖(Man2)、甘露三 糖(Man3)、甘露四糖(Man4)、甘露五糖(Man5)、甘露六糖(Man6)、甘露 七糖(Man7)、各种混合低聚糖、例如下式M5 (化l)和RN(化2)等。
<formula>formula see original document page 6</formula>[化2]<formula>formula see original document page 7</formula>
(式中，al—2键合得到的Man各自独立，可以存在也可以不存在)。
含有葡萄糖的低聚糖可以是具有[化3]表示的结构的低聚糖，也可 以是化4所示的、含有N-乙酰葡糖胺的低聚糖形式，还可以是化5所示 的、含有岩藻糖的低聚糖形式。
<formula>formula see original document page 7</formula><formula>complex formula see original document page 8</formula>(p为0或1, n各自独立，为0-3,式中右侧的4GlcNAc卩1—4GlcNAc 表示的两个GlcANc残基可以各自独立也可以不独立，由(GlcNAc(31—)n 表示的GlcNAc均与右侧相邻的Man的空羟基某一位置形成配糖体)。
<formula>complex formula see original document page 8</formula>
(p为0或1, n各自独立，为0-3, (GlcNAc卩1—)n表示的GlcNAc 均与右侧相邻的Man的空羟基某一位置形成配糖体)。
<formula>complex formula see original document page 8</formula>
(k为l-5， p各自独立，为O或l,箭头的先端没有编号的可以与《
羟基的某一位置形成配糖体)。
<formula>formula see original document page 9</formula>(p各自独立，为O或l, n各自独立，为0-3,箭头的先端没有编号 的可以与空羟基的某 一 位置形成配糖体，式中右侧的以 4GlcNAc卩1—4GlcNAc表示的两个GlcNAc残基可以分别独立或不独立)。
<formula>formula see original document page 9</formula>
(p各自独立，为O或l, n各自独立，为0-3，箭头的先端没有编号 的可以与空羟基的某 一 位置形成配糖体，式中右侧的以 4GlcNAc卩1—4GlcNAc表示的两个GlcNAc残基可以分别独立或不独
本发明中使用的低聚糖优选低聚甘露糖，特别优选甘露五糖或甘露三糖。
上述低聚糖均具有一个还原末端醛基。从而可以将该醛基作为将低 聚糖导入到脂质体表面的手段使用。即，通过该醛基与具有氨基的脂质 之间的反应形成席夫碱，接着将该席夫碱按照常规方法进行还原、优选
化学还原，例如通过NaBH3CN进行还原，可以使低聚糖与脂质结合(水
落次男、糖质工学、224-232页、产业调查会生物学信息中心、1992)。
上述的具有氨基的脂质优选为具有氨基的磷脂，例如可使用磷脂酰 胺、例如二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE) 等。上述得到的低聚糖与脂质的结合物在本发明中可以称为人工糖脂。
构成脂质体的脂质可以将已知的构成脂质体的任意常用脂质单独 或多种组合使用。例如，天然产物可以使用例如卯黄、大豆或其它由动 植物得到的脂质、将这些脂质进行修饰得到，例如通过氢化使不饱和度 降低、或者化学合成品。具体来说，例如有甾醇类例如胆甾醇(CHol); 磷脂酰乙醇胺类例如二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、 二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺(DSPE);磷脂酰胆碱类例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰 磷脂酰胆碱(DSPC);磷脂酰丝氨酸类例如二棕榈酰磷脂酰丝氨酸 (DPPS)、 二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS);磷脂酸类例如二棕榈酰磷脂酸 (DPPA)、 二硬脂酰磷脂酸(DSPA)等。
脂质体的制备可采用公知的方法[D.W.Deeamer, P.S.Uster, ，，Liposome"ed. By M丄Ostro, Marcel Dekker Inc., N.Y. Basel, 1983,p27]进行。通常是漩涡搅拌和超声波法，除此之外也可以使用乙醇 注入法、醚法或逆相蒸发法等，也可以将它们组合4吏用。
例如在漩涡搅拌和超声波法中，可以将规定的脂质溶解于有机溶剂 例如甲醇、乙醇、氯仿、或它们的混合物例如甲醇与氯仿的混合物中，
然后通过蒸发除去该有机溶剂，获得脂质的薄层。接着，向该脂质的薄 层中加入水性介质，通过旋涡搅拌或超声波处理形成脂质体。此时，可 以向上述水性介质中混入药物、标记或造影剂等待施用物质，例如溶解 或悬浮，可以将该待施用物质封于脂质体中。
为了将低聚糖导入到脂质体的表面，例如可以使用以下两种方法的 任意一种。上述人工糖脂为水溶性、无法充分溶解于有机溶剂时，例如 在使用上述的M5与DPPE的结合物(M5-DPPE)、 RN与DPPE的结合物 (RN-DPPE)时，制备它们的水性溶液，将其与形成的脂质体混合，例如 在4。C-室温下温育24-120小时，例如约72小时。
人工糖脂溶解于有机溶剂时，将该人工糖脂质与用于构成脂质体的 脂质一起在脂质体制造过程中溶解于上述有机溶剂，之后可按照常规方 法形成脂质体。低聚糖的量相对于脂质体的量根据低聚糖的种类、待包 封的抗原种类、脂质体的组合结构等而不同，通常相对于1 mg构成脂
质体的脂质为5 ^g。
本发明中使用的脂质体可以是多层型(多层脂质体)，也可以是单层 型(单层脂质体)。它们可按照已知的常规方法制备，还可按照常规方法，
将一种类型转换为另一种类型，例如将多层型的脂质体转换为单层型的 脂质体。本发明中使用的脂质体的粒径没有特别限定，可根据需要、按 照常规方法例如通过所需孔径的滤器过滤来使粒径均匀。
本发明中，特别优选使用被覆低聚甘露糖的脂质体。被覆低聚甘露 糖的脂质体是将广泛地保存于由酵母至人的生物中的、糖链结构之一的 多个甘露糖糖链(低聚甘露糖)进行脂化，并纯化，然后与脂质体结合(抱 合)。被覆低聚甘露糖的脂质体是使用人所原本具有的结构，因此没有 毒性。如果存在于巨噬细胞的受体特异性地识别低聚甘露糖，则被覆低 聚甘露糖的脂质体可通过吞噬作用迅速地摄取到细胞内。
本发明中使用的抗原物质的种类没有特别限定，例如有存活蛋白 (廿"4匕、、》)、卩匕、、7 、氨曱环酸(Rikavarin卩力乂《'J > ) 、 gpl 10、 MART-1、 NY-ESO-l、 SSX、 PBF、 HER2 、 SYT-SSX、 CEA、 MUC-1 等。抗原物质优选癌抗原。
抗原物质相对于脂质体的量只要是可得到所施用的脂质体组合物 被腹腔内的巨噬细胞摄取、抗原肽在抗原呈递细胞的MHC I类分子和/ 或II类分子上呈递的本发明的效果即可，没有特别限定，可以通过施用 物质的种类或脂质体的组成或结构等适当设定。通常，施用物质的量是 每1 mg构成脂质体的脂质为1险100 |ig。
本发明的脂质体组合物可以根据需要含有药学上可接受的载体。载 体可以使用无菌水、緩沖液或食盐水。本发明的脂质体组合物可以根据 需要含有盐类、糖类、蛋白质、淀粉、明胶、植物油和聚乙二醇等。
本发明的脂质体组合物的施用途径没有特别限定，优选腹腔内、腹 腔内、皮下或鼻腔内黏膜施用。本发明的脂质体组合物的施用量根据所 施用的物质的种类、施用途径、症状的严重程度、患者的年龄和状态、 副作用程度等而不同，通常为0.1-100 mg/kg/天的范围。
通过以下实施例进一步具体说明本发明，本发明并不受这些实施例 的限定。
实施例
实施例1:被覆低聚糖的脂质体的制备方法和抗原的包封方法
按照以下方法，使具有甘露三糖(M3) (Manal—6 (Manal—3)Man 结构的甘露三糖(Man3))和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)通过还原氨基 化反应化学结合，合成M3-DPPE。
首先，向2.5 mg甘露三糖(M3)中加入600 pi蒸馏水，搅拌溶解， 制备低聚糖溶液。接着以5mg/ml的浓度溶解于氯仿/曱醇(l:l、体积比) 混合液中，制备DPPE溶液。还以10 mg/ml的浓度在甲醇中溶解 NaBH3CN,制备NaBH3CN溶液。向600 pl上述低聚糖的各溶液中加入 9.4 ml上述DPPE溶液和1 ml上述NaBH3CN溶液，搅拌混合。将该反 应混合液在60。C下温育16小时，生成人工糖脂。合成的人工糖脂质使 用HPLC纯化成高纯度。
包封抗原蛋白(卵清蛋白(OVA)或EL4抗原)的脂质体如下制备。 首先，将二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、月旦甾醇和人工糖脂(M3-DPPE) 以1:1:0.1混合，制成氯仿/甲醇溶液或乙醇溶液，将该溶液装入茄形烧 瓶，通过旋转蒸发器进行减压干燥固化，制备脂质膜。接着，将0.3ml 含有抗原蛋白的PBS溶液(5 mg/ml)加入到脂质膜中，用漩涡搅拌器剧烈 搅拌，制备被覆M3-DPPE的脂质体。
然后用PBS洗涤脂质体多次，通过离心除去未包封到脂质体中的可 溶性物质。再用1 pm的滤器使该脂质体的粒径均匀化。包封蛋白质量 通过蛋白质进行定量，脂质体的脂质组成比以及药物通过HPLC进行定 量。
实施例2:在MHC I类和MHC II类分子上进行的抗原呈递的确认
将卵清蛋白(OVA)或OVA肽包封于被覆甘露糖的脂质体中，直接 施用于C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠的腹腔，被表达MHC I类以及同时 表达达MHCI类和II类的CDllb阳性细胞顺利撮取。已知CDllb阳性 细胞发挥抗原呈递细胞的作用，因此，为了明确包封OVA的被覆低聚 甘露糖(M3)的脂质体被CD1 lb阳性细胞摄取后可在MHC I类和MHC II 类分子上任意中呈递，进行了以下实验。 (1)实"睑组
A组是将用PBS制成200 )il包封有50 jig溶解于PBS的OVA、并
被覆M3的脂质体，施用于小鼠的腹腔内。 B组是将10 pl以5 mg/ml的浓度溶解于PBS的OVA溶液用PBS 制成共200 pl，施用于小鼠腹腔内。与A组同样，施用50pg的OVA。
C组是将38 |il只包封了 PBS、并被覆M3的脂质体用PBS制成共 200 pi,施用小鼠的腹腔内。
D组是将200 )il PBS施用小鼠的腹腔。
(2) 由腹腔回收的CDllb阳性细胞的前处理
小鼠使用出生8周龄的C57BL/6或BALB/c小鼠。将腹部用浸泡在 70%乙醇中的脱脂棉消毒，然后用注射筒对各组分别施用结核菌素。施 用l小时后，施用戊巴比妥麻醉药使其安乐死，迅速向小鼠腹腔内注入 5ml的Hanks液，清洗腹腔，从腹腔内回收，回收腹腔内的游离细胞。 将各组3只小鼠用Hanks液回收的腹腔内细胞各组分别汇集在一支试管 内，然后以1,000 rpm离心5分钟。沉淀的细胞悬浮于10 ml含有10% 胎牛血清的RPMI液(RPMI-A液)，然后再用1,000 rpm离心5分钟。将 相同操作重复两次，以含有1 ]llM的2-巯基乙醇和10%胎牛血清的RPMI 液(RPMI-B液)悬浮，以100 )Lil分注到96孔板中，在C02培养箱中以37 °C、 5。/。C02培养2小时，在CDllb阳性细胞贴壁之后沖洗未贴壁细胞， 然后用100 |ul的RPMI-B液培养24小时。
(3) 在MHC I类分子和II类分子上呈递的抗原的检测 判断OVA肽是否在B6小鼠的MHC I类或II类分子上呈递，这可
以分别使用B6系统的小鼠OT-1小鼠(识别在MHC I类分子H-2Kb上呈 递的OVA257—264)和OT-2小鼠(MHC II类分子的H-2Ab/OVA32W39)进行。 从这些小鼠中取出脾脏，浸泡在5ml Hank's液中，同时用2片载玻片将 其划散。然后转移至15 ml离心管中静置5分钟，使构建脾脏组织的纤 维性组织沉淀并除去，然后使用小鼠淋巴细胞比重分离液M-SMF (日本 抗体研究所)，通过离心得到淋巴细胞。在II类分子上呈递的效率也可 使用BALB/c系统的小鼠DO11.10小鼠(识别在H-2Ad/OVA323-339上呈递 的OVA肽)进行实验。将lxl(^个淋巴细胞用1 ml RPMI-B液悬浮，分 别以100 pi混合到已准备的含有CDllb阳性细胞(2-d)的孔中进行培 养。48小时后回收培养上清，对其中所含的IFN-y值进行定量。
结果如图l和图2所示。由图l和图2的结果证实将卵清蛋白(OVA) 包封于被覆甘露糖的脂质体中并施用，则抗原在MHC I类分子和II类 分子两者上呈递，有效地诱导了 IFN-y。
实施例3:小鼠淋巴瘤EL4中CTL的诱导
将EL4细胞施用于同系小鼠C57BL/6小鼠的皮下，得到EL4的细 胞团。将该细胞团在PBS中进行匀浆，使用100,000 g上清作为EL4抗 原。将EL4抗原包封于被覆低聚甘露糖的脂质体中，将l吗蛋白质量 施用C57BL/6小鼠的皮下，进行免疫(每周三次)。
初次免疫三周后，从小鼠体内摘除脾脏，浸泡到5mlHank，s液中， 用2片载玻片划散。然后转移至15 ml离心管中静置5分钟，使构建脾 脏组织的纤维性组织沉淀并除去，用小鼠淋巴细胞比重分离液M-SMF (曰本抗体研究所)，通过离心分离淋巴细胞，作为效应细胞使用。然后 将效应细胞用可溶解的蛋白抗原(100 mg EL4/1(^个细胞)进行3天的刺 激。将效应细胞与耙细胞(EL4细胞104个细胞/孔)按照以下的比混合 (E/T比二50:l、 25:1、 12.5:1、 6.25:1、 3.125:1、 1:1)。培养8小时，通过 CytoTox96测定试剂盒(Promega)测定细胞毒性。
测定结果如图3所示。由图3的结果可知，将EL4抗原包封于被覆 低聚甘露糖的脂质体并施用，则可有效诱导CTL。
实施例4:
腹腔内施用包封了 OVA的OML (被覆低聚甘露糖的脂质体 OML/OVA)、包封了 OVA的无被覆的脂质体(BL/OVA)或只施用5昭 OVA, l小时后回收腹腔内细胞，接种于培养皿上培养1小时。除去浮 游细胞，然后向贴壁细胞中加入新鲜的RPMI1640培养基，24小时后回 收培养基，通过ELISA法测定培养基中的细胞因子。结果如图4所示。 只从OML/OVA中确认有IL12的生成。
实施例5:
与实施例4同样，腹腔内施用OML/OVA或LPS (10 ng), 1小时后 回收腹腔内细胞，测定由巨噬细胞生成的细胞因子。结果如图5所示。 在LPS刺激下,优先生成了 IL1、 TNF,在OML刺激下优先生成了 IL12。
实施例6:
从识别H-2Kb (MHC I类)上呈递的OVA257-264的TCR转基因小鼠
OT-l、和识别H-2Ab (MHC II类)上呈递的OVA323-339的TCR转基因 小鼠OT-2中分别制备CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞，作为效应 细胞。另一方面，将包封了 OVA的OML施用C57/BL6小鼠腹腔，l小 时后回收腹腔内细胞并培养，用贴壁细胞作为巨噬细胞。将上述T细胞 与巨噬细胞混合培养，24小时后回收培养液，测定培养基的细胞因子。 结果如图6所示。
实施例7:
对单独施用OVA时和将OVA包封在OML中施用时的抗原呈递效 率进行比较。方法与实施例6同样。结果如图7所示。施用2昭包封在 OML中的OVA时，细胞因子的生成量与单独施用1000 pg OVA时相 同，因此，可以认为在MHCII类上的呈递高约500倍。同样，在MHC I类上的呈递高约50倍。即，通过将抗原包封在OML中，可以以非常 高的效率呈递抗原。
实施例8:
将OVA/OML以相当于1 pg OVA的量免疫C57CL/6小鼠(以1周的 间隔皮下施用两次)。为了活化肠道免疫，免疫计划如图8所示。由最终 免疫1周后取出脾脏细胞，用抗原刺激后测定培养基中的细胞因子(图 9)。同时以EG7细胞(向EL4细胞中导入OVA基因，在自身的MHC I 类上呈递OVA肽抗原的细胞)作为靶细胞，测定细胞障碍性能(图9)。在 用包封了 OVA的OML免疫的小鼠中观察到显著的Thl细胞因子的生 成，也观察到显著的细胞障碍性能。另一方面，在以母细胞株EL4为靶 时，均未观察到细胞障碍性能。因此，可以说诱导了抗原特异性的CTL。
实施例9:
如实施例8所述，对于免疫的小鼠，在最终免疫1周后将lxl()S的 EG-7移植到背部，3周后测定胂瘤体积。结果如
图10所示。用OVA/OML 免疫的小鼠中，肿瘤的生长完全受到抑制。
实施例10:
将^106的EG-7移植到背部，第9天(肿瘤体积大约为100mmS)将
OML/OVA按照1 pgOVA接种。然后测定肿瘤体积。结果如图11所示。 在OML/OVA施用组中，所有的小鼠均观察到肺瘤缩小，至少3例中完 全缩小。接种了胂瘤的小鼠的存活率如图12所示。OVA/OML施用组的 存活率显著提高。
实施例11:
将OML/OVA按照5 pg OVA以1周的间隔鼻腔内施用于小鼠三 次，最终施用l周后，采集鼻腔相关淋巴组织(NALT)和脾脏，抗原刺激 后测定细胞因子的生成。结果如图13所示。在OML/OVA施用组中， 在NALT中可见显著的Thl细胞因子的生成。
产业实用性
本发明可提供一种脂质体组合物，该脂质体组合物可使癌抗原等抗 原肽在抗原呈递细胞的MHC I类分子和II类分子上有效呈递。根据本 发明，无需从患者中取出细胞并返回的操作，可以构建简便的免疫方 法。本发明的脂质体组合物特别可以将作为癌抗原的蛋白质包封，直接 施用患者，可用作疫苗疗法。
附图简述
图1表示来自MHC I类限制的OVA肽特异性TCR转基因小鼠的脾 脏细^^的IFN-y生成量。
图2表示摄取了 OVA的对于腹腔内巨噬细胞MHC II类限制的OVA 肽特异性TCR转基因小鼠(DOl 110)的脾脏细胞的应答。
图3表示Man3-脂质体免疫诱导细胞毒性T淋巴细胞。
图4表示腹腔内施用被覆低聚甘露糖的脂质体(OMA/OVA)等后腹 腔内细胞的细胞因子的生成量。
图5表示腹腔内施用OML/OVA或LPS后腹腔内的细胞因子的生成量。
图6表示从识别OVA257-264 (MHC I类)的TCR转基因小鼠OT-l 和识别OVA323-339 (MHC II类)的TCR转基因小鼠OT-2中分别混合培 养CD8阳性T细胞和CD4阳性T细胞与巨噬细胞时细胞因子的生成量。图7表示单独施用OVA时与将OVA包封于OML中施用时的抗原 呈递效率的比较结果。
图8表示用于活化肠道免疫的免疫计划。
图9表示肠道免疫中，由活化免疫的最终免疫1周后取出脾脏细 胞，用抗原刺激后测定培养基中细胞因子量的结果，以及以EG7细胞作 为耙细胞测定细胞障碍性能的结果。
图IO表示对肠道免疫的小鼠，在最终免疫1周后将EG-7移植到背 部，3周后测定肺瘤体积的结果。
图11表示将EG-7移植到背部第9天时接种OML/OVA,然后测定 肺瘤体积的结果。
图12表示肿瘤接种小鼠的存活率。
图13表示对小鼠鼻腔内施用OML/OVA,最终施用1周后采集鼻腔 相关淋巴组织(NALT)和脾脏，测定抗原刺激后细胞因子的生成的结果。
权利要求
1.脂质体组合物，其含有被覆低聚糖的脂质体和抗原物质，用于使抗原肽在抗原呈递细胞MHCI类分子和II类分子上呈递。
2. 权利要求1的脂质体组合物，其中，所述的低聚糖为低聚甘露糖。
3. 权利要求1或2的脂质体组合物，其中，所述的低聚糖为甘露 五糖或甘露三糖。
4. 权利要求1-3中任一项的脂质体组合物，其中，所述的抗原物质 为癌纟元原。
5. 权利要求1-4中任一项的脂质体组合物，该脂质体组合物在腹腔 内、皮下或鼻腔内粘膜施用，被巨噬细胞等抗原呈递细胞摄取，抗原肽 在MHC I类分子和II类分子上呈递。
6. 权利要求1-5中任一项的脂质体组合物，该脂质体组合物诱导细 胞毒性T淋巴细胞。
全文摘要
本发明的目的在于提供可使抗原物质在抗原呈递细胞的MHC I类分子和II类分子上有效呈递的脂质体组合物。本发明可提供含有被覆低聚糖的脂质体和抗原物质、使抗原肽在抗原呈递细胞的MHC I类分子和II类分子上呈递的脂质体组合物。
文档编号A61K9/127GK101208075SQ20068001892
公开日2008年6月25日 申请日期2006年3月29日 优先权日2005年3月29日
发明者小岛直也, 池原让, 辻村邦夫 申请人:学校法人东海大学;爱知县