专利名称：基于Isthmin基因的免疫脂质体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫脂质体，特别涉及一种基于Isthmin基因的免疫脂质体，还涉及该免疫脂质体的制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤是发病率高、预后差的恶性疾病，严重威胁着人类健康。继手术、放疗、化疗后，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的重要手段。当前，肿瘤生物治疗策略主要有肿瘤相 关基因或肿瘤抑制基因的靶向治疗、肿瘤相关抗原的免疫治疗等，但这些方法由于技术的 成熟性、有效性、经济性及伴随的副作用等问题，在实际应用中受到一定限制。研究表明，所有人类肿瘤中90%以上为实体瘤，而实体瘤的生长和转移需要新生血管形成，抑制肿瘤血管形成能够有效阻断肿瘤细胞的营养支持，抑制肿瘤的生长和转移， 因此是肿瘤生物治疗中的一个重要补充策略。该策略不仅具有良好的肿瘤特异性，而且不 受肿瘤类型的限制，更重要的是新生血管内皮细胞是一种基因稳定的细胞。过去十年中，人 们在抑制肿瘤血管生成方面主要致力于各种血管生成抑制剂的研究，但至今尚未取得令人 满意的疗效。Isthmin是从后脑组织中鉴定出的一种分子量约60kDa的分泌性蛋白，目前功能未知。在神经元发育阶段，Isthmin在中脑到后脑的分界峡部组织高度表达，此外在轴旁的 中胚叶神经褶发育的晚期阶段也有表达。Isthmin的中部具有凝血栓蛋白-II型重复序列 (thrombospondin-1 type 1 repeat, TSR)，羧基末段具有黏附相关蛋白区域。TSR由3组 重复的备解素序列组成，最初被证明是凝血栓蛋白-I(TSP-I)的重要结构域，在TSP-I抑制 血管生成中发挥重要作用；随后的研究发现，TSR在分泌性或跨膜性蛋白中存在，功能与细 胞黏附、通讯和组织重建相关。脂质体是由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的球状体，可以包裹多种物质(如药物、核酸等)并将其转入多种类型的细胞中，具有延长包裹物的作用时间、增加细 胞对包裹物的摄取量、提高疗效、减少毒副作用等特点，但其缺乏主动靶向性。免疫脂质体 则是一种表面结合有抗体或抗体片段等物质的脂质体，其借助抗体或抗体片段与靶细胞表 面抗原的特异性结合，可以特异性识别并结合靶细胞，使脂质体在靶区释放包裹物，具有主 动靶向功能。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于Isthmin基因的免疫脂质体，可以主动靶向肿瘤新生血管内皮细胞，在细胞中释放出Isthmin重组真核表达载体并表达 Isthmin，从而发挥抗肿瘤血管生成的作用，具有高效、低毒等优点；目的之二在于提供所述 基于Isthmin基因的免疫脂质体的制备方法，操作简便易行；目的之三在于提供所述基于 Isthmin基因的免疫脂质体在医药方面的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
1、基于Isthmin基因的免疫脂质体，由包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质 体与抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体共价结合而成。进一步，所述Isthmin重组真核表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的 Isthmin基因插入真核表达载体p3xFLAG-CMV-14的多克隆位点中而得到；进一步，所述脂质体由卵磷脂和胆固醇组成。2、所述基于Isthmin基因的免疫脂质体的制备方法，包括以下步骤a、Isthmin重组真核表达载体的制备提取小鼠脾脏组织血管内皮细胞总RNA， 逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3 所示的上、下游引物进行PCR扩增，所得PCR产物经纯化后，用Not I和Xba I双酶切，再 与同样经Not I和Xba I双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14在T4DNA连接酶的作用 下连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性 克隆，提取质粒进行鉴定，在p3xFLAG-CMV-14的Not I和Xba I位点之间插入了核苷酸序 列如SEQID No. 1所示的Isthmin基因的阳性克隆质粒即为Isthmin基因重组真核表达 载体 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；将含有 p3xFLAG-CMV_14/Isthmin 的大肠杆菌 DH5 α 接种 于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行增菌培养，大量抽提质粒，用超纯水溶解，即得 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 溶液；b、Isthmin重组真核表达载体的脂质体包封将卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中， 减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声，再加入p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，在42°C水浴和 干冰中反复冻融并通过孔径为IOOnm的薄膜挤出器，未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解，再用琼脂糖凝胶CL-4B柱分离除去被 核酸酶降解的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；C、包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质体与抗第VIII因子相关抗原单克隆 抗体的连接将抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体经巯基化修饰后，与包裹Isthmin基因 重组真核表达载体的脂质体在室温下振摇连接过夜，再用琼脂糖凝胶柱分离除去游离的抗 第VIII因子相关抗原单克隆抗体，即得基于Isthmin基因的免疫脂质体。进一步，步骤a中PCR扩增的循环条件参数为95°C预变性10分钟，然后94°C变 性1分钟、58 °C退火1分钟、72 °C延伸4分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。3、所述基于Isthmin基因的免疫脂质体在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。进一步，所述肿瘤为结肠癌。本发明的有益效果在于本发明将Isthmin重组真核表达载体有效地包封在脂 质体中形成纳米级颗粒，并且与抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体相连接，制成免疫脂质 体。第VIII因子相关抗原(VWF)主要表达于血管内皮细胞，是血管生成标志性抗原。因此， 本发明的免疫脂质体可以主动靶向肿瘤新生血管内皮细胞，在细胞中释放出Isthmin重组 真核表达载体并表达Isthmin，从而发挥抗肿瘤血管生成的作用，具有高效、低毒、制备方法 简单等优点，可以用于制备抗肿瘤血管生成的药物，在抑制肿瘤血管生成方面具有良好的 应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为琼脂糖凝胶电泳检测Isthmin基因的PCR产物；图2为Western blot检测包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质体；图3为透射电子显微镜观察基于Isthmin基因的免疫脂质体；
图4为各组细胞的增殖抑制率；图5为各组荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线；图6为各组荷瘤裸鼠的平均生存率；图7为免疫组化法检测各组荷瘤裸鼠的肿瘤新生血管密度。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、基于Isthmin基因的免疫脂质体(Anti-vWF-Lip-Isthmin)的制备1、Isthmin重组真核表达载体的制备与检测(1) Isthmin重组真核表达载体的制备取小鼠脾脏组织，加入液氮充分研磨后，称取IOOmg置无RNA酶的离心管中，采用 RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取血管内皮细胞总RNA，按照试剂盒说明书操作。根据GenBank登录号为NM_001126490的Isthmin基因序列设计1对特异性引物， 在每条引物的5’端加上保护碱基，再在其后引入限制性内切酶识别序列，引物序列如下 上游引物5，-gcggccgcatggtgcgcctggctgc-3，(SEQ ID No. 2)，下划线部分为 Not I 酶切 位点；下游引物5，-tctagattagtactctctggcttcttgg-3，(SEQ IDNo. 3)，下划线部分为 Xba I酶切位点；设计的引物委托上海生工公司进行合成。采用RT-PCR逆转录扩增试剂盒(TaKaRa公司)将血管内皮细胞总RNA逆转录 为cDNA，再以该cDNA为模板，采用上述特异性引物进行PCR扩增，按照试剂盒说明书操作； PCR扩增的循环条件参数为95°C预变性10分钟，然后94°C变性1分钟、58°C退火1分钟、 72°C延伸4分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物用浓度为10g/L的琼脂糖 凝胶电泳进行鉴定(如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见1 泳道在约1400bp处有一特异性条带，与目的片段的分子量大小相符)，再用胶回收试剂盒 (TIANGEN公司)切胶回收纯化目的片段，按照试剂盒说明书操作，即得两端带有Not I和 Xba I酶切位点的Isthmin基因。将两端带有Not I和Xba I酶切位点的Isthmin基因用Not I和Xba I (TaKaRa 公司)双酶切，双酶切产物经纯化后，与同样经Not I和Xba I双酶切的真核表达载体 p3xFLAG-CMV-14 (Sigma-Aldrich公司)在T4DNA连接酶(TaKaRa公司)的作用下连接，连接 产物转化大肠杆菌DH5 α (TIANGEN公司)感受态细胞，用含有氨苄青霉素(AMP)的LB平板 筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基中，温度37°C振摇培 养12小时，用质粒小量提取试剂盒(TIANGEN公司)提取质粒，按照试剂盒说明书操作，所 得质粒采用双酶切法和PCR法鉴定并委托上海生工公司进行测序验证，在p3xFLAG-CMV-14 的Not I和Xba I位点之间插入有与SEQ ID No. 1所示核苷酸序列完全一致的DNA片段的阳性克隆质粒即为Isthmin重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/Isthmin。取含有p3xFLAG-CMV_14/Isthmin的大肠杆菌DH5 α (阳性克隆)，接种于含有AMP的LB液体培养基中，温度37°C振摇培养过夜，待培养液的光吸收值0D490nm达到1 1.5 时，采用超纯质粒抽提试剂盒(TIANGEN公司)大量抽提质粒，按照试剂盒说明书操作，所得质粒用超纯水溶解，即得p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，用紫外分光光度计测定其A260值和A280值，根据A260/A280值估算其纯度约1. 0，根据A260值计算其质量浓度约1. Omg/
mLo(2) Isthmin重组真核表达载体的检测Western blot检测将cos_7细胞接种于6孔板中，用PRIM 1640培养基在温度为37°C、CO2气体体积分数为5 %的条件下培养24小时，待细胞融合率达到约80 %时，采用脂质体转染试剂 Lipofectamine 2000 将 p3xFLAG_CMV_14/Isthmin 转染入 cos_7 细胞，按照试剂说明书操作，同时设空载体对照，转染4小时后，将培养液更换为I3RIM 1640培养基，继续培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，超声裂解细胞，离心收集上清液，采用His Bind融合蛋白纯化试剂盒纯化带有His标签的Isthmin，按照试剂盒说明书操作。取纯化蛋白溶液，采用质量百分浓度为5%的浓缩胶、质量百分浓度为12.5%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后电转印PVDF膜，用脱脂奶封闭1小时后，加入兔抗小鼠Isthmin多克隆抗体，37°C孵育1小时，PBST洗膜后，再加入羊抗兔IgG，37°C孵育1小时，PBST洗膜后，再加入发光底物，37°C孵育1分钟，暗室中用X光片曝光，显影，定影，观察p3XFLAG-CMV-14/Isthmin在真核细胞中的表达。结果见图2，其中1泳道为从p3xFLAG-CMV-14/Isthmin转染的cos-7细胞中提取并纯化的蛋白溶液，2泳道为从p3xFLAG-CMV-14转染的cos-7细胞中提取并纯化的蛋白溶液；从图可知，1泳道有一特异的蛋白质条带，与Isthmin的预期分子量大小一致，而2泳道无相应条带，表明p3xFLAG-CMV-14/Isthmin可以在真核细胞中正确表达Isthmin。2、包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质体(Lip-Isthmin)的制备与检测(I)Lip-Isthmin 的制备采用逆向蒸发法制备将卵磷脂2g和胆固醇0. 4g溶解于乙醚60mL中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声5分钟，再加入浓度为0. 5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液20mL，在42°C水浴和干冰中反复冻融，并连续数次通过孔径为IOOnm的薄膜挤出器(上海光健公司)，未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III (上海亚培公司)于37°C作用1小时后用乙二胺四乙酸终止反应，用琼脂糖凝胶CL-4B柱(北方伟业公司)分离Lip-Isthmin和被核酸酶降解的p3xFLAG-CMV-14/Isthmin(由于脂质体比p3xFLAG-CMV-14/Isthmin大，因此可通过凝胶过滤色谱将二者分离)。(2) Lip-Isthmin 的检测透射电镜观察将Lip-Isthmin用浓度为3g/L的磷钨酸溶液负染后，滴至专用铜网上，自然风干，置透射电子显微镜下观察脂质体的形态结构和粒径分布。结果如图3所示，所得Lip-Isthmin为球形或近球形小囊泡，粒径分布范围为50 120nm，平均粒径低于 IOOnm0琼脂糖凝胶电泳检测将相同质量的p3XFLAG-CMV-14/ISthmin、经反复冻融的脂质体、通过IOOnm薄膜挤出器的脂质体以及经核酸酶消化的脂质体同时进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，可见经核酸酶Dnase I和exonuclease III处理后，未包封入脂质体的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin已经被降解，而脂质体能够抵抗核酸酶的降解。同时通过Gel pro analyzer 4. O software软件比较凝胶图中DNA的条带亮度，计算总DNA量和未包封入脂 质体的DNA量，再根据公式包封率=[(总DNA量-未包封入脂质体的DNA量)/总DNA 量]X 100%，计算得到 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 的包封率约为 82. 3%。3, Anti-vffF-Lip-Isthmin 的制备与检测(l)Anti-vffF-Lip-Isthmin 的制备将小鼠抗人vWF单克隆抗体(SantaCruz公司)经巯基化修饰后，与Lip-Isthmin 在室温下轻摇连接过夜，用琼脂糖凝胶CL-4B柱分离Anti-vWF-Lip-Isthmin和未连接的抗 vWF单克隆抗体(由于免疫脂质体比抗体大，因此可通过凝胶过滤色谱将二者分离)。(2)Anti-vWF-Lip-Isthmin 的检测琼脂糖凝胶电泳检测分别向收集到的Anti-vWF-Lip-Isthmin和未连接的抗 vWF单克隆抗体中，加入浓度为5g/L的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液(SDS能破坏脂质体 的膜表面结构，从而使脂质体释放内部的包裹物)，同时设置不加入SDS的空白对照，混 勻静置，取上清液进行浓度为5g/L的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，可见加入SDS的 Anti-vWF-Lip-Isthmin有一明亮的DNA条带，而加入SDS的抗vWF单克隆抗体无相应条带 出现。酶联免疫吸附(ELISA)检测将收集到的Anti-vWF-Lip-Isthmin和未连接的抗 vWF单克隆抗体分别包被96孔板，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG为一抗做 直接ELISA实验，以确定脂质体表面是否已连接上抗体，结果Anti-vWF-Lip-Isthmin和未 连接的抗vWF单克隆抗体都呈阳性反应，说明脂质体表面已连接上抗体。二、基于Isthmin基因的免疫脂质体抗肿瘤血管生成作用检测1、体外抗血管生成作用MTT比色法检测分别将处于指数生长期的正常细胞DC2. 4和人脐静脉血管内皮 细胞HUVEC用含有浓度为100g/L的新生牛血清的完全培养基制成细胞密度为1 X 106/mL的 悬液，接种至96孔板，每孔100 μ L，分成两组对照组和实验组，每组设3个复孔，对照组每 孔加入完全培养液100 μ L ；实验组每孔加入终浓度为1 μ g/mL的基于Isthmin基因的免疫 脂质体100 μ L ；在温度为37°C、C02气体体积分数为5%的条件下培养72小时，每孔再加入 浓度为5g/L的MTT 20 μ L，继续培养4小时，吸去上清，每孔再加入二甲基亚砜150 μ L，轻 摇10分钟，用酶标仪在波长490nm处测定各孔OD值，计算细胞增殖抑制率。结果如图4所示，基于Isthmin基因的免疫脂质体对DC2. 4细胞的增殖抑制率为 9%，对HUVEC细胞的增殖抑制率为74%，表明本发明的免疫脂质体能够有效抑制血管内皮 细胞的增殖。2、体内抗血管生成作用将荷瘤(结肠癌细胞CT-26)裸鼠随机分为三组对照组I、对照组II和实验组， 对照组I尾静脉注射生理盐水；对照组II尾静脉注射包封有P3XFLAG-CMV-14的免疫脂质 体；实验组尾静脉注射基于Isthmin基因的免疫脂质体；每次100 μ L，每周1次，连续给药 3次；观察60天内各组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；同时，取小鼠体内肿 瘤组织，用免疫组化法检测肿瘤新生血管密度(以抗⑶31单克隆抗体为一抗)。
各组荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线如图5所示，第30天时，对照组I和对照组II 的小鼠肿瘤体积分别为2000mm3和1800mm3，而实验组小鼠肿瘤生长缓慢，肿瘤体积仅为 1200mm3 ；各组荷瘤裸鼠的生存率如图6所示，对照组I和对照组II的小鼠分别于第30天 和第35天全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为60%，与对照组I和对照组II相比，实 验组小鼠生存率高；各组荷瘤裸鼠的肿瘤新生血管密度检测结果如图7所示，第30天时，对 照组I和对照组II的小鼠⑶31阳性细胞数为35个，而实验组小鼠的⑶31阳性细胞数为 12个，与对照组I和对照组II相比，实验组小鼠的肿瘤新生血管密度低。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
基于Isthmin基因的免疫脂质体，其特征在于由包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质体与抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体共价结合而成。
2.根据权利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂质体，其特征在于所述Isthmin 重组真核表达载体是将核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的Isthmin基因插入真核表达载体 p3xFLAG-CMV-14的多克隆位点中而得到。
3.根据权利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂质体，其特征在于所述脂质体 由卵磷脂和胆固醇组成。
4.权利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂质体的制备方法，其特征在于包括 以下步骤a、Isthmin重组真核表达载体的制备提取小鼠脾脏组织血管内皮细胞总RNA，逆转 录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ IDNo. 2和SEQ ID No. 3所示 的上、下游引物进行PCR扩增，所得PCR产物经纯化后，用Not I和Xba I双酶切，再与同 样经Not I和Xba I双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14在T4DNA连接酶的作用下连 接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克 隆，提取质粒进行鉴定，在p3xFLAG-CMV-14的Not I和Xba I位点之间插入了核苷酸序 列如SEQID No. 1所示的Isthmin基因的阳性克隆质粒即为Isthmin基因重组真核表达 载体 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；将含有 p3xFLAG-CMV_14/Isthmin 的大肠杆菌 DH5 α 接种 于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行增菌培养，大量抽提质粒，用超纯水溶解，即得 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin 溶液；b、Isthmin重组真核表达载体的脂质体包封将卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压 蒸馏除去有机溶剂，水浴超声，再加入p3xFLAG-CMV-14/Isthmin溶液，在42°C水浴和干 冰中反复冻融并通过孔径为IOOnm的薄膜挤出器，未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ Isthmin用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解，再用琼脂糖凝胶CL-4B柱分离除去被 核酸酶降解的 p3xFLAG-CMV-14/Isthmin ；c、包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质体与抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体 的连接将抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体经巯基化修饰后，与包裹Isthmin基因重组 真核表达载体的脂质体在室温下振摇连接过夜，再用琼脂糖凝胶柱分离除去未连接的抗第 VIII因子相关抗原单克隆抗体，即得基于Isthmin基因的免疫脂质体。
5.根据权利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂质体的制备方法，其特征在于 步骤a中PCR扩增的循环条件参数为95°C预变性10分钟，然后94°C变性1分钟、58°C退 火1分钟、72 °C延伸4分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。
6.权利要求1所述的基于Isthmin基因的免疫脂质体在制备抗肿瘤血管生成的药物中 的应用。
7.根据权利要求6所述的基于Isthmin基因的免疫脂质体的应用，其特征在于所述 肿瘤为结肠癌。
全文摘要
本发明公开了一种基于Isthmin基因的免疫脂质体及其制备方法和应用，该免疫脂质体由包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质体和抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体共价结合而成；其制备方法包括Isthmin重组真核表达载体的制备、Isthmin重组真核表达载体的脂质体包封、包封有Isthmin重组真核表达载体的脂质体与抗第VIII因子相关抗原单克隆抗体的连接共3个步骤；该免疫脂质体可以主动靶向肿瘤新生血管内皮细胞，在细胞中释放出Isthmin重组真核表达载体并表达Isthmin，从而发挥抗肿瘤血管生成的作用，具有高效、低毒、制备方法简单等优点，可用于制备抗肿瘤血管生成的药物。
文档编号A61K9/127GK101797229SQ20101010295
公开日2010年8月11日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学