专利名称：一个小分子非编码RNA基因hsa-miR-101及其抗肿瘤用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个与原发性肝癌相关的小分子非编码RNA基因hsa-miR-101，以及该基因在 辅助诊断与治疗原发性肝细胞癌方面的用途。该发明属于生物技术领域。技术背景原发性肝细胞癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的主要发生地，肝癌 的发生率高达十万分子三十五。近年来肝癌发病率有明显上升的趋势，严重危害人类的健康 与生命安全。微小RNA (microRNA)是广泛存在于各种生物物种内的一类小分子非编码的核糖核酸， 其长度约为20-22个碱基。它不编码蛋白质或多肽，而是通过与靶基因的mRNA(信使RNA) 的3'UTR (3'端非翻译区)的特异性结合，促进其降解或抑制其翻译过程来实现对基因表达 的调控。许多证据表明，microRNA参与了细胞的多种生物学过程，其自身调控的异常直接 影响着恶性肿瘤的发病及恶化。由于microRNA与肿瘤发生的密切关系，它们在肿瘤诊断和 治疗中可能具有极为广阔的应用前景。我们首先利用cDNA芯片技术高通量检测了 HCC与对照标本中存在的miRNA表达改 变。通过比较癌与非癌肝组织中miRNA表达谱的差异，我们鉴定了41个在肝癌中表达发生 显著改变的miRNA，并选取了其中的hsa-miR-101进行较深入的功能探讨。结果发现 hsa-miR-101在70%以上的HCC病例中以及所有肝癌细胞株中均低表达，提示hsa-miR-101 可能具有抑癌基因活性。进一步的实验结果表明，过表达hsa-miR-101可提高肿瘤细胞对血 清饥饿和多种化疗药物包括curcumin、 etoposide和doxorubicin的敏感性。我们还发现， hsa-miR-101可有效抑制肿瘤细胞体外的集落形成能力以及体内的成瘤能力。这些结果表明 hsa-miR-101不仅可作为临床上肝癌诊断的辅助指标，而且在肝癌治疗中有着非常广阔的应 用前景。经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有关hsa-miR-101与原发性肝癌的研究报道。 发明内容本发明公开了一种能有效抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡的小分子RNA基因 hsa-miR-101，及其在原发性肝癌诊断和治疗方面的用途。该基因成熟体序列有以下核苷酸组成5， -AUGUCAUUUAAUUACUUAAGC-3，首先，本发明的小分子RNA基因hsa-miR-101在大多数肝癌组织中下调明显，因此在肝 癌的临床诊断及预后判断方面，有重要的参考意义；其次，本发明的小分子RNA基因可以有效降低肝癌细胞的增殖及成瘤能力，可有效促进 肝癌细胞对血清饥饿及各种化疗药物的敏感性，因此是一种全新作用机制的抗肿瘤药物，在 肝癌治疗中有极为重要的应用前景。
图I: Northern blot检测hsa-miR-l 01的表达水平。A, hsa-miR-101在不同细胞株，人非肝癌组织(N699) 以及成年小鼠正常肝(mLiv)中的表达水平；B， hsa-miR-101在成对的肝癌(T)与癌旁(P)组织中表 达水平的比较。图2: hsa-iniR-101能提高细胞对凋亡刺激的敏感性。A，在血清饥饿环境下，过表达hsa-miR-101促进 HepG2细胞的凋亡；B，过表达hsa-miR-101后HepG2在血清饥饿时的细胞活力明显下降；C，在血清饥 饿环境下，过表达hsa-miR-101导致HepG2细胞caspase-3/7活性提高，此作用可被hsa-miR-101的抑制 剂回复，D， hsa-miR-101导致不同肝癌细胞株对血清饥饿诱导的凋亡敏感；E， hsa-miR-101促进HepG2 细胞在不同化疗药物刺激下的凋亡，其中用etoposide, curcumin及doxorubicin的处理浓度和时间分别为 1.5ng/ml, 48 hrs; 12.5nM， 48hrs; 0.2吗/ml， 36hrs。关于实验组组间差异的比较，除图中用"门"明 确标识的比较组别外，其余均是对hsa-miR-101与平行的细胞组或NC进行的比较。数据来自三次独立实验。*: P<0.05; **: P<0.01; ***: P<0.001。图3:过表达hsa-miR-101显著抑制了H邻G2细胞在裸鼠的皮下成瘤能力，图示4周后肿瘤的形成情况 代表图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，来进一步说明本发明。需要注意的是，以下实施例只用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的hsa-miR-101可以采用常规的化学合成方式 合成。实施例1: hsa-miR-101在肝癌组织标本中表达水平的检测从肝癌及非癌肝组织中提取总RNA， RNA样品与RNA上样缓冲液按3:1比例混合后， 80'C变性10min，然后置于冰上5min;用微量加热器迅速上样后，在10W的电功率下，用15% 的变性聚丙烯酰胺凝胶进行约40min电泳分离；电泳完成后凝胶切角做好标记，将凝胶和膜 按顺序组装到半干转印槽里，恒流8mA/cii^转膜l小时；取下HybondN+尼龙膜并切角做好 标记，70,00(HJ/cmSuV交联，再真空8(TC干烤2h;用2X SSC润湿尼龙膜后，平铺到杂交管 内壁，并赶走膜与管壁间的气泡，加入预杂交液，放入杂交箱，37'C最低速旋转过夜；然后 加入50ul标记好的探针( lX107cpm/ml)杂交过夜；杂交完毕后用洗膜液洗膜三次，每次 5min，对于microRNA的检测要用非严谨的洗膜液，对于U6的检测则用严谨洗膜液；用保鲜 膜把洗完的膜包好，压磷屏和扫描。各样品中目的条带的强度用GeneTools software (version3.03, SynGene, Cambridge, UK)进行分析。通过Northemblot方法我们检测了多种肝癌细胞株及肝癌组织标本中hsa-miR-101的表达 情况，结果发现在多种肝癌组织及肝癌细胞株中，hsa-miR-101的表达均明显降低(附图1)。实施例2: hsa-miR-101过表达把hsa-miR-101的小分子RNA导入细胞是通过釆用Invitrogen公司的转染试剂 Lipofectamine RNAi MAX来进行反转而实现的，以24孔板为例，其他孔板可根据孔的大小 按比例放大或者縮小胰蛋白酶消化细胞，重悬于含有10%FBS的无双抗DMEM培养基中， 使得细胞密度为3Xl(^个细胞/ml;将小分子RNA稀释于lOOpl opti-MEM中，轻敲管壁混 匀；每管加入lpl Lipofectamine RNAi MAX,轻敲管壁混匀，室温放置15min;将RNAi MAX/siRNA稀释液加入24孔板中，然后再加入50(^1细胞稀释液(使细胞密度在转染24h 后大约为30-50%汇合)，混匀后培养箱中培养一定时间后进行相关功能检测。实施例3:细胞凋亡检测按需要处理细胞后吸去培养上清，用4X多聚甲醛室温固定15min后，用lpg/ml (终浓 度)的DAPI染液室温染色5min，再于莱卡荧光显微镜下观察细胞核形态。染色质固縮和 DNA发生断裂的细胞均认为是发生凋亡的细胞，细胞凋亡率按以下的方法计算细胞凋亡率(％)=凋亡细胞数/总细胞数(总细胞数2500个)我们检测了在血清饥饿及化疗药物处理条件下hsa-miR-101对肿瘤细胞凋亡的影响，结 果发现在HepG2细胞(美国ATCC)中过表达hsa-miR-101实验组在血清饥饿48h后凋亡率是 阴性对照(NC)组或平行的HepG2组的 2倍，而饥饿72h后凋亡率差异进一步上升，过 表达hsa-miR-101使得细胞凋亡率提高了接近3倍(图2A)。结果提示hsa-miR-101可增加HepG2细胞对血清饥饿诱导的凋亡反应的敏感性。用Alamar Blue检测血清饥饿后HepG2的 生长状况发现在血清饥饿下hsa-miR-101组的生长活力大幅度下降(图2B),提示了 hsa-miR-101具有使细胞对血清饥饿更敏感的作用。通过检测caspase-3/7的活性也可以进一 步说明我们结果的可靠性(图2C)。对其他肝癌细胞株QGY-7703(美国ATCC)和 SMMC-7721(美国ATCC)进行血清饥饿的处理，同样也观察到了 hsa-miR-101的促凋亡效呆 (图2D)。进一步研究发现hsa-miR-101过表达可显著提高HepG2细胞对etoposide、 M curcumin和doxorubicin等化疗药物的敏感性(图2E)，提示hsa-miR-101可以逆转肿瘤细胞 对某些化疗药物的耐药性，可以作为未来肿瘤治疗的潜在药物。实施例4:裸鼠成瘤实验利用RNAiMAX反转50nM的hsa-miR-101或NC到HepG2细胞，培养48h后用胰酶消 化并计数后按lXl()S个/ml的浓度用PBS悬浮。选用9只5周龄的BALB/c裸鼠，在其两只 后腿部分别皮下注射1 X 105或5X 104过表达hsa-miR-101或NC的H印G2细胞。连续观察 并测量肿瘤的生长及大小至1个月以上。小鼠体内成瘤实验结果表明，过表达hsa-miR-101可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能 力，提示hsa-miR-101具有类似肿瘤抑癌因子的基因活性(图3和4)。由此可见，本发明中的hsa-miR-101不仅在体外实验中可有效促进肝癌细胞的凋亡，逆转 肝癌细胞的耐药，而且在体内实验中也可有效抑制肝癌肿瘤的形成。因此hsa-miR-101可以 作为未来肿瘤治疗的潜在药物。本发明具有实用性的例证(1) 本发明所提供的小分子RNA基因hsa-miR-101可用于肝癌患者，特别是耐药肝癌患 者的辅助治疗；(2) 可以利用本发明所介绍的研究该类小分子非编码RNA基因功能的方法，筛选鉴定其 它肿瘤相关miRNA基因，促进新的抗肝癌药物的发现；(3) 可以筛选鉴定有效调控hsa-miR-101的药物，寻找具有调节hsa-miR-101分子加工表 达的活性分子药物；(4) hsa-miR-101分子很可能还参与了其他类型肿瘤的发生发展过程。因此，本发明对今 后深入研究hsa-miR-101分子与其他肿瘤的关系提供了经验和应用基础。序列表<110>中山大学<120> —个小分子非编码RNA基因hsa-miR-101及其抗肿瘤用途<160> 1<210> 1 <211> 11 <212> RNA<400> 1augucauuua auuacuuaag c
权利要求
1.一种分离核酸，具有SEQ ID NO1所示的序列。
2. 权利要求l所述的核酸作为治疗肿瘤的药物的应用。
3. 根据权利要求2所述的核酸作为治疗肿瘤的药物的应用，其特征在于所述的肿瘤为原发 性肝细胞癌。
4. 权利要求1所述的核酸作为促进肿瘤细胞凋亡的药物的应用。
5. 权利要求1所述的核酸作为逆转肿瘤细胞的耐药的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种与原发性肝细胞癌相关的小分子RNA基因hsa-miR-101及其应用。本发明还提供了一种分析小分子RNA基因与肿瘤发生发展相关性的方法，以及小分子RNA基因hsa-miR-101在原发性肝癌治疗方面的用途。本发明的目的是提供小分子RNA基因hsa-miR-101作为肿瘤治疗性药物的应用，本发明在医学和生物制药领域有较大的实际意义和广阔的应用前景。
文档编号A61P35/00GK101333524SQ20081002901
公开日2008年12月31日 申请日期2008年6月25日 优先权日2008年6月25日
发明者庄诗美, 杨建荣, 杨金娥, 程家森, 杭 苏 申请人:中山大学