人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是采用基因分子生物学技术及基因工程蛋白 技术，获得一种修饰后的，具有高度组装成病毒样颗粒(VLPs)能力的，病毒衣 壳蛋白基因；及其表达出来的重组蛋白，即病毒样颗粒。本发明还涉及该病毒样 颗粒的疫苗及其用途。发明背景人乳头瘤病毒是一类无胞膜的小DNA病毒，现已发现100多型，主要感染人 的粘膜上皮，引起上皮组织的良恶性增生。研究发现有十五种HPV亚型的感染可 引起宫颈癌前病变及宫颈癌，这些亚型被定义为高危型如HPV16， 18， 31, 33, 45,等。大量的研究结果表明慢性持续性高危型人乳头瘤病毒感染是妇女宫颈癌 的明确诱因，其中由HPV16感染诱发的宫颈癌占宫颈癌发病总数的50X以上。研 究发现我国宫颈癌患者HPV16的阳性率高达79.6% (Wu Y， et.al. Association of high-risk HPV types and viral load with cervical cancer in China. J Clin. Virol.2006;35(3):264-269)。动物实验及临床试验结果表明，利用基因工程重组技术 表达的病毒外壳蛋白LI或LI及L2，体外可自组装成空的病毒颗粒(ViruS"like particles, VLPs) ，VLPs除了不含病毒核酸，不具致病性之外，但可经病毒的感染相 关受体髙效率的进入宿主细胞，包括抗原递呈细胞，其它特性如外形、空间构象 以及免疫原性几乎与天然病毒颗粒完全一样，VLPs免疫后可诱发机体产生高滴度 的中和抗体，保护机体免受同一型别病毒的攻击或自然感染。目前国际上VLPs 疫苗的表达体系主要有两种杆状病毒-昆虫细胞表达体系及啤酒酵母表达体系， 两种表达体系生产的VLPs均在欧美等地区进行了临床试验，结果表明VLPs疫苗 安全性好，在性活跃期及性活跃期前妇女接种HPV16及HPV18VLPs疫苗三次后， 通过迄今5—6年随访观察发现，接种疫苗可以明确高效的预防宫颈HPV感染、 宫颈管内上皮不典型增生及早期宫颈癌的发病率。现有技术中，人们研制的利 用酵母表达体系获得的HPV16、 HPV18、 HPV6、 HPVllLlVLPs宫颈癌预防疫苗 "Gardasil"已经上市。还有人利用杆状病毒-昆虫细胞表达体系获得的 HPV16LlVLPs、 HPV18LlVLPs疫苗也在世界许多国家及地区进行临床试验，结 果表明疫苗接种3次后对宫颈HPV16、 18病毒感染、宫颈癌前病变及宫颈癌的预 防保护效果在5年期以上(Harper DM,et.al. Efficacy of a bivalent LI virus-like particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women:a randomised controlled trial.Lancet.2004;364:1757-1765; Haiper DM et.al. Sustained efiicacy up to 4.5 years of a bivalent LI virus-like particle vaccine against human papillomavirus 16 and 18:follow-up from a randomised control trial.The lancet.2006;Internet:l-9.)。因此病毒样颗粒疫苗市场开发前景广阔。特别是广大的 贫困落后地区是宫颈癌的高发区，急需研发具有使用价值的VLPs疫苗，降低疫苗 的成本，提髙人群的免疫保护效率。目前，现有技术中开发的LIVLPs疫苗釆用的LI基因均为源自病人标本的野 生型LI基因。Collier B等的研究结果表明HPV16野生型LI基因N端点存在RNA 转录抑制元件，同意突变改造HPV16L1基因编码区N端前514bp后可以消除其转 录抑制元件。研究发现与野生型基因相比，以N端改造后的HPV16L1基因构建的 真核表达质粒瞬时转染细胞后，LI基因的转录和表达水平显著加强，以该基因的 表达质粒作为DNA疫苗，免疫小鼠后，诱发产生的免疫反应较野生型LI基因疫 苗诱发的免疫反应显著增强。(Collier B， et.al. Specific inactivation of inhibitory sequences in the 5' end of the human papillomavirus type 16 LI open reading frame results in production of high levels of LI protein in human epithelial cells. J Virol 2002， 76:2739-2752; Rollman E， et.al. HPV-16 LI genes with inactivated negative RNA elements induce potent immune responses. Virology 2004, 322:182-189.)<>目前尚无以 消除HPV16L1N端RNA抑制元件的HPV16L1基因用于体外表达生产基因工程重 组蛋白疫苗的研究。发明内容为了克服现有技术中存在的缺陷， 一方面，本发明涉及一种病毒样颗粒，该 病毒样颗粒由选自序列为SEQ ID NO. 1的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因 或核苷酸序列为SEQ ID NO. 2的HPV16L1N/L2-LTK63嵌合基因所编码，该病毒 样颗粒由下列歩骤获得1 ) 使用 pFastBacDual-HPV16LlN 、 pFastBacDual-HPV16LlN/L2或 pFastBacDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkB重组质粒分别转化感受态大肠杆菌 DH10Bac;2) 筛选鉴定获得分别重组有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组Bacmid;3) 将所述重组Bacmid转染对数生长期的昆虫细胞，转染后收集上清，获得 含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的 重组杆状病毒；4) 用所述含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，使重组杆状病毒在感
染细胞内分别表达导入的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16UN/L2-LTK63基因；5 )裂解感染有含HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒的细胞，纯化获得HPV16L1N VLPs、 HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63嵌合病毒样颗粒。另一方面，本发明还涉及同时将HPV16L2基因重组入 pFastBacDual-HPV16LlN双表达载体的P10启动子的下游，获得重组质粒 pFastBacDual-HPV16LlN/L2。该重组质粒于2006年9月7日在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏号为CGMCCIDN0.1802。另外，本发明还涉及将L2-LTK63基因插入pFastBacDual-HPV16LlN的P10 启动子的下游，获得pFastBacDual-HPV16LlN/L2-LTK631inkB重组质粒。该重组 质粒于2006年9月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏, 保藏号别为CGMCC IDN0.1803。本发明进一歩涉及序列号为SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的HPV16L1N基 因；以及融合基因L2-LTK63,该基因由改造后大肠杆菌热不稳定毒素基因(LTK63) 与人乳头瘤病毒16型的L2基因融合而成，用于提髙人乳头瘤病毒16型病毒样颗 粒疫苗的免疫活性。该基因具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列，其编码的蛋白 质的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。本发明涉及含有位于PH启动子下游的HPV16L1N基因的 pFasfflacDual-HPV16LlN重组表达质粒；含有位于P10启动子下游的HPV16L2基 因的pFastBacDual-HPV16LlN/L2重组质粒和含有位于P10启动子下游的 L2-LTK63基因的pFas迅acDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkerB重组质粒。另外，本发明涉及含有HPV16L1N基因，HPV16L1N/L2基因和 HPV16L1N/L2-LTK63 linkerB基因的重组Bacmid。另一方面，本发明涉及含有上述重组Bacmid的大肠杆菌DH10Bac菌株。本发明涉及含有所述的重组Bacmid的昆虫Sf9细胞。另一方面，本发明还进一步涉及所述的病毒样颗粒在制备用于预防HPV16病 毒的感染以及感染诱发的宫颈或外阴部位的癌前病变及恶性肿瘤的疫苗中的应 用，特别是预防与HPV16感染相关的宫颈癌。本发明也包括利用HPV16L1N和L2-LTK63基因以DNA疫苗和其他形式用于 疫苗方面的研究最后本发明还包括将HPV16L1N和L2-LTK63基因或重组蛋白 在制备药物、药物组合物，特别是免疫治疗领域的应用。本发明具有重要的经济 及社会意义。本发明还涉及一种制备所述的病毒样颗粒的方法，其步骤包括1 ) 使用 pFastBacDual-HPV16LlN 、 pFas迅acDual-HPV16LlN/L2 或 pFastBacDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkB重组质粒分别转化感受态大肠杆菌 DH10Bac;2) 筛选鉴定获得分别重组有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组Bacmid;3) 将所述重组Bacmid转染对数生长期的昆虫细胞，转染后收集上清，获得 含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的 重组杆状病毒；4) 用所述含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，使重组杆状病毒在感 染细胞内分别表达导入的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63基因；5 )裂解感染有含HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒的细胞，纯化获得HPV16L1N VLPs、 HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63嵌合病毒样颗粒。本发明利用杆状病毒一 昆虫细胞表达系统生产的上述VLPs具有和天然病毒粒 子一样的类似的大小和结构特征，同时具有和天然病毒颗粒一样的凝集小鼠红细 胞的生物学特性。与用野生性的HPV16L1基因生产的VLPs疫苗相比，HPV16L1N 基因用于VLPs疫苗生产的优势在于，可显著提高VLPs疫苗的产量；另外用 L2-LTK63基因生产cVLPs疫苗的有益之处在于，L2C末端融合LTK63基因后不 影响L1N/L2-LTK63 cVLPs的组装及表达量，与HPV16LlN/L2VLPs疫苗相比， HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs疫苗可显著提高疫苗的免疫原性，包括显著提高 HPV16L1N/L2 VLPs特异的血清抗体滴度、淋巴细胞增殖指数及CD4+ZIL-4+及 CD4+ZIFNV的数目。


图 l显示其中插入了 HPV16L1N基因的重组质粒"pFastBacDual-HPV16L1N"结构简图。图2显示其中插入了 HPV16L1N基因和HPV16L2基因的重组质粒 "pFastBacDual-HPV16LlN/L2"结构简图。图3显示其中插入了 HPV16L1N基因和HPV16L2-LTK63融合基因的重组质 粒'"pFastBacDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkerB"结构简图。图4显示了纯化后病毒样颗粒的SDS-PAGE电泳考马斯亮兰染色结果。在图 中，1代表HPV16L1N VLPs , 2代表HPV16LlN/L2VLPs ， 3代表 HPV16L跳2-LTK63 cVLPs。图5显示了纯化后HPV16LlN/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs进行western blot鉴定的结果。在图中1代表HPV16LlN/L2VLPs, 2代表HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs。图5A为用Cam-vir-l单抗杂交的结果，图5B为用抗HPV16L2兔多抗杂交的结果，图5C为用抗LTB兔多抗杂交的结果。图6显示了纯化后病毒样颗粒的透射电镜结果。其中图6A为HPV16LlN/L2VLPs透射电镜照片，图6B为HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs透射电 络昭&图7显示了 HPV16LlN/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs诱导小鼠红 细胞发生凝集反应的实验结果。图8显示了在不同时间点，用ELISA法测定的用HPV16LlN/L2VLPs或 HPV16LlN/L2-LTK63cVLPs免疫小鼠血清中和抗体的滴度。在图中，箭头表示的 是免疫的时间点，星号表示的是HPV16LlN/L2VLPs免疫小鼠血清中和抗体的滴 度与HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs的有明显的统计学差异。图9显示了 HPV16LlN/L2VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠血 清中和抗体的构象依赖特性实验结果。图10显示了在第三次免疫后3周，HPV16LlN/L2VLPs或 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠脾细胞增殖实验结果。图11显示了在第三次免疫后6周，HPV16LlN/L2VLPs或 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠0>4+/11^1+ T细胞的流式细胞检测结果。 其中图11A为PBS对照组小鼠的CD4/IFN^双染色的流式细胞图，图11B为 HPV16LlN/L2VLPs免疫组小鼠的CD4/IFN^双染色的流式细胞图，图11C为 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫组小鼠的CD4/IFN^y双染色的流式细胞图，图 IID为汇总的直方图。图12显示了在第三次免疫后6周，HPV16LlN/L2VLPs或 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠CD4+/IL4+T细胞的流式细胞检测结果。其 中图12A为PBS对照组小鼠的CD4/IL-4双染色的流式细胞图，图12B为 HPV16LlN/L2VLPs免疫组小鼠的CD4/IL4双染色的流式细胞图，图12C为 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫组小鼠的CD4/IL-4双染色的流式细胞图，图12D 为汇总的直方图。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅是说明而非 限定的作用，本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上作出改 进，但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所作出的改进都会落 入本发明的保护范围。实施例1.组织基因组DNA的提取将鲍温氏病活检标本剪碎后，加入适量抽提缓冲液(10mmol/LTris.ClpH8.0， O.lmol/LEDTApH 8.0， 20ng/ml RNA酶，0.5%SDS)，充分研磨裂解后，转入到50ml 离心管，加入蛋白酶K，终难浓度为100ng/ml，充分混匀，50"C水浴，其间不时 轻微振动试管，直至组织完全溶解(约1.5h)，以等体积酚、酚-氯仿-异戊醇、氯 仿-异戊醇各抽提一次，上清中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和两倍体积无水 乙醇，混匀，—20r沉淀过夜，12000r/min离心，弃上清，70%乙醇洗沉淀两次， 沉淀于空气中适当干燥后，溶于25^1 TE(RNase 20ng/ml)中，测OD260并计算DNA 浓度，样品贮存于4"备用。实施例2.人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白LI基因的克隆从GeneBank上检索得到人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白LI基因序列，根据 此序列设计引物，上游引物为 5'-GCACTAGATCTAATATGTCT TTTGGCTGCCTAG-3'， 下游引物为 5'-TCGAGCAGATCTTTACAGCTTA GTTTTTTGCG-3'。上下游引物中均包含BglII酶切位点。以从鲍温氏病活检组织 提取的基因组DNA为模板，用pfo高保真酶进行PCR反应，反应条件为:94"变 性60s， 58"复性60s， 72"延伸120s，循环30次，最后72匸延伸300s。 PCR产 物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约1.5kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后， 对片段进行加A处理，反应体系为PCR片段200ng， dATP20nM， Tap酶10U, 总体积为2(Hi1， 72X:反应15分钟。对加A产物进行琼脂糖凝胶电泳回收后，进行 定量。按4: 1的摩尔比加入加A处理后的PCR片段和pGEM-T载体，T4DNA连 接酶，于16C连接过夜，连接物转化DH5a感受态细胞，挑取白色克隆，进行PCR 鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用BglII单酶切后能释放出大小为1.5kb的片断， 与GenBank上的HPV16L1基因大小吻合。送Invitrogen公司采用Applied Biosystem 双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果显示与原型HPV16L1比较，从鲍温氏 病活检组织获得的HPV16L1存在三个错义突变扭s202Asp、 Thr266Ala、 Ala316Thr，另外还有三个同意突变，分别位于Ll基因序列的993(Tto A)、 1029(A toT)、 1188(CtoT)。该基因命名为HPV16L1N。实施例3.人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的优化与克隆 由于在野生型人乳头瘤病毒16型Ll基因的5'端存在着抑制性序列，为了提 高HPV16L1蛋白的表达量，对这些抑制性序列进行突变失活，将优化后的 HPV16L1基因命名为HPV16L1N。以含有野生型HPV16Ll基因的重组载体pGEM-T-HPV16Ll wild为模板，用 突变弓l物 1 5，- CCACGCTGGTACCTCCCGCCTGCTGGCAGTTGGACAT CCCTATTTTCC -3'和下游弓|物 5'-CCC^GC77TTACAGCITACGTTT TTTGCGTTTAGCAG-3' ， pfo髙保真酶进行PCR反应，反应条件为94"变性 60s, 61"复性60s, 72"延伸120s，循环30次，最后72"延伸300s。 PCR产物
经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约1.4kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后， 进行定量。然后以回收的PCR片段为模板(约50ng)，用突变引物2 5，-GTGTCCACCGACGAGTACGTGGCTCGCACCAACATCTACTACCACGCTGG TACCTCCCG-3，和下游引物5'-CCCMi4GCnTTACAGCTTACGTTTTTTG CGTTTAGCAG-3', pfo高保真酶进行PCR反应，反应条件为94"变性60s, 62"C 复性60s， 72"C延伸120s，循环30次，最后72"延伸300s。 PCR产物经15^琼脂 糖凝胶电泳，可见约1.45kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后，进行定量。 然后以回收的PCR片段为模板(约50ng ),用突变引物3 5，-AGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGTCCAAGGTGGTGTCCACC GACGAGTAC-3，和下游引物5，-CCCA4GC77TTACAGCTTACGTTTTTTG CGTTTAGCAG-3， ， pfo高保真酶进行PCR反应，反应条件为94C变性60s, 61C复性60s, 72"延伸120s，循环30次，最后72"C延伸300s。 PCR产物经1X 琼脂糖凝胶电泳，可见约1.5kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后，进行 定量。然后以回收的PCR片段为模板(约50ng),用突变引物4 5'-CTAGrCK404GCCGCCACCATGTCCCTGTGGCTGCCCTCCGAGGCCACCGT GTACCTGC-3'和下游引物5'-CCC^4GC77TTACAGCTTACGTnTTTGC GTTTAGCAG-3' ， pfii髙保真酶进行PCR反应，反应条件为94"变性60s, 61C 复性60s， 721C延伸120s，循环30次，最后72"延伸300s。 PCR产物经1M琼脂 糖凝胶电泳，可见约1.5kb的特异性扩增片段，对此片段进行回收。由于在突变引 物4和下游引物中分别含有Xbal和HindIII酶切位点，用Xbal和HindIII双酶切 回收的最终PCR片段以及杆状病毒一昆虫细胞双表达载体pFastBacDual (Invi加gen公司)，371C酶切6小时，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，定量后，按 4:1的摩尔比加入酶切后的PCR片段和pFastBacDual载体,T4DNA连接酶，于16" 连接过夜，连接物转化DH5a感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆 进行质粒小提，用Xbal和HindIII双酶切后能释放出大小约为1.5kb的片段，与 HPV16L1N大小吻合，保种，送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核 苷酸终止法进行测序。测序结果显示，优化突变的序列完全正确。序列与SEQID NO.l所示序列一致，并位于pFastBacDual双表达载体的PH启动子的下游。与 HPV16野生型基因序列相比，该HPV16L1N基因的前129bp进行了同义突变改造， 与Collier B等报道的所改造的HPV16L1基因的N端514bp存在13处碱基差异， 主要是由于Ser Ala Arg Gly氨基酸密码子的选择不同所致另外本发明的 HPV16L1N基因的mRNA起始区的特征是位于伸展在外部的开环区，而Collier B 等报道的N端优化的HPV16L1基因的mRNA起始区的特征是位于伸展在外部的 茎区，因此相比较于上述现有技术，本发明的16LlN基因的mRNA起始区的特征 是位于伸展在外部的开环区，因而比HPV16L1的mRNA起始区的二级结构较低，
更易于RNA聚合酶的识别，利于提高基因的转录及表达水平。获得 pFastBacDual-HPV16LlN重组质粒。实施例4.入乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L2基因的克隆 从GeneBank上检索得到人乳头瘤病毒16型次要衣壳蛋白L2基因序列，根据 此序列设计引物，上游引物为 5，- CATGGCTAGCACCATGC GACACAAACGTTCTGCAAAACG-3'，下游引物为5'-ACGTGCATGCTTAGG CAGCCAAAGAGACATCTG-3'。上下游引物中分别包含Nhel和Sphl酶切位点。 以HPV16野生型基因组DNA为模板，用pfo髙保真酶进行PCR反应，反应条件 为94"C变性60s， 59C复性60s， 72"延伸120s，循环30次，最后72t!延伸300s。 PCR产物经1。^琼脂糖凝胶电泳，可见约1.4kb的特异性扩增片段，回收此特异性 片段。用Nhel和Sphl对PCR回收产物和含有HPV16L1的重组载体 pFastBacDual-HPV16LlN进行双酶切，37"酶切6小时，琼脂糖凝胶电泳回收酶 切产物，定量后，按4: 1的摩尔比加入酶切后的L2 PCR片段和 pFastBacDual-HPV16LlN载体，T4DNA连接酶，于16"连接过夜，连接物转化DH5a 感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用NheI和SphI 双酶切后能释放出大小约为1.4kb的片段，与HPV16L2大小吻合，保种，送 Invitrogen公司采用AppliedBiosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果与 genebank上的HPV16L2序列比较显示第33位氨基酸由Glu变为Asp,其余的与 野生型一致。获得双表达HPV16L1N和HPV16L2 的质粒 pFastBacDual-HPV16LlN/L2。实施例5.大肠杆菌热不稳定肠毒素LTK63基因的克隆大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)由A和B两个亚基组成。由于野生型大肠杆 菌热不稳定肠毒素，具有较强的毒性，所以不适合做疫苗佐剂。而LTK63是LT 蛋白的一种突变体，它的63位氨基酸由野生型的丝氨酸突变为赖氨酸，突变后的 LTK63完全消除了野生型LT的毒性，可作为病毒样颗粒疫苗的佐剂。LT A亚基 DNA序列的3'端与B亚基DNA序列的5'端有4个碱基的重叠，其中包括A亚基 的终止密码子。在大肠杆菌中A和B两个亚基的开放阅读框可以被通读，而在真 核细胞中A亚基的终止密码子将终止B亚基的表达。为了在昆虫细胞中表达完整 的大肠杆菌热不稳定肠毒素，需消除A亚基的终止密码子，将A和B两亚基融合 表达。为此本研究将融合表达AB两亚基的大肠杆菌热不稳定肠毒素即LTK63与 HPV16L2融合，使其以嵌合的形式表达在组装后的VLPs上。首先需获得大肠杆 菌热不稳定肠毒素LTK63基因，为了尽量减小LTK63融合对病毒样颗粒组装效率 的影响，去除LTA亚基的N端的信号肽序列，具体措施如下以含有LT基因序列的pLT质粒为模板，用LT A上游引物(含有BamHI酶切 位点)5，-CGCG04rCCACCATGAAAAATATAACTTTCA-3， ， LT A下游引物 5，-TAATTCATCCCGAATTCTGT TATATATG-3', pfii高保真酶进行PCR反应， 扩增编码A亚基的基因。反应条件为:94"变性60s, 54匸复性60s, 72匸延伸120s， 循环30次，最后72"C延伸300s。 PCR产物经r^琼脂糖凝胶电泳，可见约800bp 的特异性扩增片段，对此片段进行回收。以含有LT基因序列的pLT质粒为模板，用LT B上游引物 5，-GAATTCGGGATGAATTAATGAATAAAGTAAAATG-3，， LT B下游引物(含 有XhoI酶切位点)5'-CCGCTC04GCTAGTTTTCCATACTGATTG-3'， pfo高保真 酶进行PCR反应，扩增编码B亚基的基因。反应条件为:94^变性60s, S3.5"复 性60s, 72"C延伸120s,循环30次，最后72t:延伸300s。 PCR产物经1 %琼脂糖 凝胶电泳，可见约370bp的特异性扩增片段，对此片段进行回收。得到的B片段 的5'端有17个碱基对与A片段是重叠的GAATTCGGGATGAATTA。利用overlapPCR法，以A片段及B片段PCR产物为模板(各50ng)，用LT A上游引物和LTB下游引物，pfo高保真酶进行overlap PCR反应，扩增LTA+B 基因。反应条件为94C变性60s， 53"复性60s， 72"延伸120s，循环30次，最 后72"延伸300s。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约l.lkp的特异性扩增 片段，回收后。对片段进行加A处理，反应体系为PCR片段200ng， dATP20nM, Tap酶10U,总体积为2(HU， 72*0反应15分钟。对加A产物进行琼脂糖凝胶电泳 回收后，进行定量。按4: l的摩尔比加入加A处理后的PCR片段和pGEM-T载 体，T4DNA连接酶，于16"C连接过夜，连接物转化DH5a感受态细胞，挑取白色 克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，BamHI和XhoI双酶切后，能 释放出大小约为l.lkb的片段，与LT A+B大小吻合保种，送Invitrogen公司采用 Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果显示，编码A和B量 亚基的基因巳正确融合，序列正确。获得pGEM-T-LTA+B重组载体。以pGEM-T-LT A+B为载体，用上游引物l(含有Bamffl酶切位点) 5'-CGCG04rCCACCATGAATGGCGACAGATTATACC-3'和下游引物1 (含有突 变位点)5'-AACTAAGCTTAGTGGAAACATATCCGTCATC-3'， pfii高保真酶 进行PCR反应，扩增片段l。反应条件为941C变性60s， 56t:复性60s， 72"延 伸120s，循环30次，最后72"延伸300s。 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见 约200bp的特异性扩增片段，对此片段进行回收。然后，以pGEM-T-LTA+B为载 体，用上游引物2 5，-ATGTTTCCACTAAGCTTAGTTTGAGAAGTGCTC-3，和下游 引物2 (含有Xhol酶切位点)5'-CCGC7UG4GCTAGT TTTCCATACTGATTG-3，， pfii高保真酶进行PCR反应，扩增片段2。反应条件为94匸变性60s， 54匸复性 60s， 72TC延伸120s，循环30次，最后72C延伸300s。 PCR产物经1X琼脂糖凝 胶电泳，可见约卯0bp的特异性扩增片段，对此片段进行回收。由于片段1和片 段2之间有ATGTTTCCACTAAGCTTAGTT 21个碱基对的重叠，利用overlapPCR 法，以片段1 (40ng)和片段2为模板(80ng)，用上游引物1和下游引物2 , pfo髙保真酶进行overlap PCR反应,扩增LTK63基因。反应条件为:94"C变性60s, 541C复性60s, 72"C延伸120s,循环30次，最后72TC延伸300s。 PCR产物经1 % 琼脂糖凝胶电泳，可见约l.lkp的特异性扩增片段，回收后。对片段进行加A处 理，反应体系为PCR片段200ng, dATP20nM, Tap酶10U，总体积为20jil， 72" 反应15分钟。对加A产物进行琼脂糖凝胶电泳回收后，定量。按4: l的摩尔比 加入加A处理后的PCR片段和pGEM-T载体，T4DNA连接酶,于16TC连接过夜， 连接物转化DH5a感受态细胞，挑取白色克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行 质粒小提，BamHI和XhoI双酶切后，能释放出大小约为l.lkb的片段，与LTK63 大小吻合保种，保种，送Invi加gen公司采用AppliedBiosystem双脱氧核苷酸终止 法进行测序。测序结果显示，LTK63基因序列正确。获得pGEM-T-LTK63重组质 粒。实施例6.双表达HPV16L1N和HPV16L2-LTK63融合基因重组质粒的构建 突变后的LTK63完全消除了野生型LT的毒性，可作为病毒样颗粒疫苗的佐 剂。为了尽可能的减小LTK63对病毒样颗粒组装的影响，将LTK63通过一个 (GlyGlyGlyGlySer)x3的柔性linkB与去除终止密码的HPV16L2 C末端融合。首先 PCR扩增不含终止密码子的HPV16L2基因以HPV16野生型基因组DNA为模板， 用上游引物(含有Xhol酶切位点〉5'-CCGCrCG4GGC CGCCACCATGCGACACA AACGTTCTGC-3'和下游引物(含有Nhel 酶切位点)5'-CATGGC2^GCGGCAGCCAAAGAGACATCTG-3', pfii髙保真酶进行PCR反应， 反应条件为94r变性60s, 6lr复性60s, 72"C延伸120s，循环30次，最后72匸 延伸300s。 PCR产物经1M琼脂糖凝胶电泳，可见约1.4kb的特异性扩增片段，回 收此特异性片段。用Xhol和Nhel对PCR回收产物和含有HPV16L1的重组载体 pFastBacDual-HPV16LlN进行双酶切，371C酶切6小时，琼脂糖凝胶电泳回收酶 切产物，定量后，按4: 1的摩尔比加入酶切后的L2 PCR片段和 pFas迅acDual-HPV16LlN载体,T4DNA连接酶，于16r连接过夜,连接物转化DH5a 感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用XhoI和NheI 双酶切后能释放出大小约为1.4kb的片段，与HPV16L2大小吻合，保种，获得双 表达HPV16L1N和HPV16L2 LackTAA的载体pFastBacDual-HPV16LlN/L2 LackTAA。以pGEM-T-LTK63重组质粒为模板，用上游引物1 5'-GGTG GCGGTGGCTCCGGTGGCGGTGGCTCCACCATGAATGGCGACAGATTA-3' 和 下游引物(含有Sphl酶切位点)5'-ACGTGC47UO:TAGTTTTCCATA CTGATTGCCGCAATTG-3', pfo高保真酶进行PCR反应，反应条件为94*0变 性60s， 611C复性60s， 721C延伸120s,循环30次，最后72t:延伸300s。 PCR产
物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约l.lkb的特异性扩增片段，回收此特异性片段。 然后以此回收的PCR片段为模板，用上游引物2 (含有Nhel酶切位 点)5，-CATGGC7MGCGGCGGTGGCGGTTCCGGTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGG TGGCTCC-3'和下游引物(含有Sphl酶切位点)5'-ACGTGC4 rGCCTAGTTTTCCATACTGATTGCCGCAATTG-3'， pfo高保真酶进行PCR反 应，反应条件为94匸变性60s， 61"复性60s, 72t!延伸120s,循环30次，最后 72"延伸300s。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可见约l.lkb的特异性扩增片段， 回收此特异性片段。用Nhel和SpW对回收的PCR片段和 pFas迅acDual-HPV16LlN/L2LackTAA重组质粒进行双酶切，37"C酶切6小时，琼 脂糖凝胶电泳回收酶切产物，定量后，按4: 1的摩尔比加入酶切后的PCR片段和 pFastBacDual-HPV16LlN/L2LackTAA载体，T4DNA连接酶，于16t:连接过夜，连 接物转化DH5a感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提， 用Nhel和Sphl双酶切后能释放出大小约为l.lkb的片段，与添加有linker的LTK63 大小吻合，保种，送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进 行测序。测序结果显示，HPV16L2-LTK63融合基因序列正确。序列与SEQ ID N0.2 所示的序列一致。获得双表达HPV16L1N和HPV16L2-LTK63融合基因的重组质 粒pF^tBacDual-HPV16LlN/L2- LTK631inkB。实施例7.重组Bacmid的获得取三支lOOjil CaCl2方法制备的感受态大肠杆菌DH10Bac (Invi加gen货号 10361012)，分别加入pFas氾acDual-HPV16LlN， pFastBacDual-HPV16LlN/L2和 pFastfiacDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkerB质粒各50ng，轻轻混匀，冰浴30min, 42C水浴热休克45s，置冰上冷却2min后加入不含抗生素SOC培养基卯Ojil， 振荡培养(225rpm)4h。取适量菌液涂于含卡那霉素、庆大霉素、四环素和Blue-gal 的LB平板上，37C培养24~48h,白斑为阳性克隆。对阳性克隆进行2~3次蓝白 斑分化筛选及PCR鉴定。对真阳性克隆进行保种。将阳性菌接种于5ml含卡那、庆大、四环素三种抗生素的LB培养基中，37" 振荡培养(250ipm) 18~24h。收集1.5ml菌液于EP管内，10000gx30s,弃上清， 加溶液I [15mMTris-HCL (pH8.0), 10mMEDTA，100ng/ml RNase A] 0.3ml重悬菌 体，加溶液Il (0.2NNaOH，l%SDS) 0.3ml，轻轻混匀，室温放置5min，加溶液 III (3MKAc，pH5.5) 0.3ml,混匀，冰上放置10min,离心14000gxl0min,吸上 清于另一支EP管中，加异丙醇0.8ml, -20"放置过夜，室温离心14000gxl0min， 70%乙醇洗两次。用无菌的50nlTE (pH8.0)溶解。OD260/280测定重组Bacmid 纯度及浓度。实施例8.昆虫细胞sf-9的培养 -9细胞(货号11496015)，接种于T75培养瓶，接种 密度为5xl06/T75培养瓶，用SF-900II SFM培养基(Invitrogen货号10卯2088) 于27"C恒温培养箱中培养，当细胞密度达到905^融合时，用巴斯特吸管轻轻将细 胞吹下，迸行传代。当细胞数量及活力打到悬浮培养要求时，从T75培养瓶小心 地将细胞吹下后，台盼兰染色测定细胞活力在90%以上，按照5xl()S细胞/ml的密 度接种于悬浮培养瓶中，转速为50rpm,于27"恒温培养箱中培养，每天测定细 胞的密度与活力，当细胞密度达到2.5xl(^细胞/ml时进行传代。实施例9.重组杆状病毒的获得与扩增于35mm平皿中接种培养2~3天(处于对数生长期)的Sf9细胞8xl05个，27匸 培养2一h。准备溶液A (l吗BacmidDNA稀释于lOOpl Grace培养基(Invitrogen 货号11595030))和溶液B (6ji1 Cellfectin转染试剂(Invitrogen货号10362010) 稀释于IO(HUGrace培养基(Invitrogen货号11595030)),将溶液A和B合并，轻 轻混匀，室温放置25min。用2mlGrace培养基洗涤细胞2次，缓慢向平皿中加入 上述混合的DNA脂质体复合物，轻轻混勾，再中加入800fUGrace培养基，平皿置 于27"培养5h。移去转染培养基，添加2ml SF-卯OII SFM培养基(Invitrogen货 号10卯2088)培养，继续培养至72h。收集上清，即为重组杆状病毒原液P1，加 入胎牛血清，终浓度为2%，于41C避光保存。对数生长期的sf-9细胞按照3xl05细Jja/5ml/T25培养瓶接种，27"培养2一h， 细胞贴壁后，加入15(HU重组杆状病毒原液P1， 271C继续培养48h,收集上清，离 心去除细胞残渣，得到的为第二代重组杆状病毒液P2,加入胎牛血清，终浓度为 2%，于4C避光保存。对数生长期的sf-9细胞按照9xl05细fla/15ml/T75培养瓶接种,27^培养2~4h， 细胞貼壁后，加入800nl第二代重组杆状病毒液P2， 27"继续培养48h,收集上清， 离心去除细胞残渣，得到的为第三代重组杆状病毒液P3,加入胎牛血清，终浓度 为2%，于4"C避光保存。其滴度可达Ixl08~lxl09p&/ml。得到的第三代重组杆 状病毒用于人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的表达。实施例10.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒在昆虫细胞sf-9细胞中的表达 sf-9细胞悬浮培养到密度为2 2.5xl(^细胞/ml时，从摇瓶中取出5x 108细胞， 1500rpm离心5min，去除上清，加入20ml SF-卯OII SFM重悬细胞，加入5ml第三 代重组杆状病毒(MOI为2 5),室温感染1-L5h。往直径为150mm的平皿中接 种已感染病毒的细胞，晃动平皿以铺匀细胞，在27eC培养箱中培养，待细胞有明 显的病变时，用细胞刮收集细胞，5000rpm, 4。C离心后，约2x 109细胞用10ml昆 虫细胞裂解液重悬，-80°(:冻存。 实施例11.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的纯化1) .将样品置于50ml离心管中，冰浴，用Hs/ier550超声波破碎仪，Speed 4.5, 超声5分钟，每次25秒，间隔10秒。2) .将超声处理后的样品于4。C , lO，OOOrpm离心15min。留取上清。3) .向离心管(Beckman)中先加8mlCsCl，然后沿着管壁慢慢加入8ml 40%庶 糖，使其形成明显的界面。4) .用1000jU加样器慢慢滴加21ml含有VLP的样品,然后于l(TC，27,000ipm 离心2.5h。5) .用吸管从上部吸去液体，直至蔗糖/CsCl交界处的云雾状区带。6) .用10ml注射器，收集上述管内的液体，然后将其加入离心管内(Beckman Quick-Seal管)；最后吸取裂解液补足体积至颈口下少许，平衡后于20。C， 50,000 rpm离心16h。7) .离心后可见云雾状VLP区带。用18-19G针头从离心管底部刺破收集云雾 状VLP区带。8) . Western blot对每个收集组分进行鉴定。9) .将阳性收集组分用lOmM HEPES(pH 7.2) 4°C透析2~6小时。透析后用BCA 试剂盒(P正RCE)进行蛋白定量。定量后再进行透射电镜分析。根据BCA定量结果，可以计算出每升密度为2 2.5xl(^细胞/ml的sf-9细胞 通过杆状病毒表达系统表达后，可纯化得到8~10mg的HPV16L1N VLPs, HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs。实施例12.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的SDS-PAGE考马斯亮兰染色及 western blot检测各取5吗纯化后的HPV16L1N VLPs , HPV16L1N/L2 VLPs及 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs，加入终浓度为10mmol/LDTT， 70。C变性5min，用 8%SDS-PAGE进行电泳，电泳完后用考马斯亮蓝R-250染色液(45ml甲醇"K5ml 蒸馏水+10ml冰乙酸+0.258考马斯亮蓝R250)室温染色2h，再于脱色液(45ml甲醇 445ml蒸馏水+10ml冰乙酸)中脱色数小时，至染色条带清晰可见为止。结果如图4 所示，HPV16LlNVLPs， HPV16LlN/L2VLPs和HPV16LlN/L2-LTK63cVLPs三种 VLPs的纯度均在卯％以上。三个泳道中位于55kD的带为HPV16L1N蛋白，第二 泳道中位于90kD的带为HPV16L2蛋白，第三泳道中位于130kD的带为 HPV16L2-LTK63融合蛋白。各取0.5吗纯化后的HPV16L1N/L2 VLPs及HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs，加 入终浓度为10mmol/LDTT， 70。C变性5min,用8MSDS-PAGE进行电泳，转膜， 5%BSA-PBST室温封闭2h后分别用C咖-vir-l单抗，抗HPV16L2兔多抗以及抗 LT B亚单位兔多抗以1: 3000稀释后4°C孵育过夜。洗涤后分别加入1: 5000稀
释的HRP标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG二抗，室温孵育lh,充分洗涤后，加入 化学发光底物试剂(PIERCE,货号34079),室温孵育5min，暗示显影、定影。 结果如图5A,图5B和图5C所示。图5A所示,用Cam-vir-l孵育后，HPV16L1N/L2图5B所示，用抗HPV16L2兔多抗孵育后HPV16L1N/L2 VLPs和 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs分别在卯kD和130kD处出现特异条带，在特异性条 带下有一些非特异的带，可能是L2或者L2-LTK63的降解物，图5C所示，用抗 LT B兔多抗孵育后HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs 130kD处出现特异性条带，而 HPV16L1N/L2 VLPs则没有任何条带。Western blot结果显示HPV16L1N/L2 VLPs 和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs的组成成分正确。实施例13.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的透射电镜观察 将2(Hil透析后的病毒样颗粒样品滴在铜网上，静置lmin，用去离子水洗铜网。 然后用l(XHd的1%醋酸铀对铜网负染303,用滤纸吸干剩余的醋酸铀染液，在空 气中干燥后。将铜网装入JEM1010电子显微镜，放大倍率为50,000倍，观察，照 相。结果如图6A和图6B所示，HPV16LlN/L2VLPs直径约为55nm，大小均匀， 形状规则。而HPV16LlN/L2-LTK63cVLPs存在一些比天然病毒大的颗粒，这样的 颗粒直径约为70nm，而且形状不规则，同时存在一些比较规则，直径约为55nm， 大小均匀的病毒样颗粒。在50,000倍放大倍数的透射电镜视野中,其中HPV16L1N VLPs每视野可见86个VLPs, HPV16L1N/L2 VLPs每视野可见119个VLPs, HPV16L1N/L2-LTK63 eVLPs每视野可见112个VLPs,而用同系统表达野生型 HPV16L1基因获得的VLP每个视野可见72个VLPs(王立良人乳头瘤病毒16型 Ll结构基因的克隆、表达以及表达蛋白的结构与功能的研究，中国协和医科大学 博士论文)，结果表明1. 优化后的HPV16L1 N基因可显著提高VLPs的产量；2. 嵌合LTK63后不影响蛋白的表达水平及VLPs的组装效率。因此，以优化后HPV16L1基因作为VLPs疫苗生产的抗原基因极具应用开发 前景。实施例14.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒诱发小鼠红细胞发生凝集反应的实验1) .从小鼠颈动脉取血至装有109mM柠橡酸钠(m/v)的EP管中(血:柠檬酸钠 =9:1)。2) .4°C ， 1000g离心5分钟。3) .弃上清，将红细胞用含有lmg/ml BSA的PBS重悬，终浓度为l%(vol/vol)。4) .4°C , 1000g离心5分钟后，弃上清，用含有lmg/mlBSA的PBS洗红细
胞两遍，并将终浓度调节为l%(vol/vol)。5) .将经过10 mM HEPES (pH 7.2)透析后的VLP用含有lmg/ml BSA的PBS 调节浓度为4ng/jil。向96孔U型板中加入50^1 PBS(含lmg/ml BSA)/孔，再向第 一个孔中加入50pl浓度为4ng/jil的VLP溶液，混匀后做倍比稀释。6) .向每个孔中加入50nl浓度为1%的红细胞溶液，充分混匀。于4。C孵育3 小时后，照相。结果如图7所示，HPV16LlN/L2VLPs和HPV16LlN/L2-LTK63cVLPs均能有 效的诱导小鼠红细胞发生凝集反应。实施例15.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的小鼠免疫实验取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分为三组，分别用PBS, HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs进行免疫，肌肉注射，每次10fig/100nl/小鼠，对照组用100jilPBS代替，于第O, 2， 4周免疫，共三次。实施例16.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒诱导血清中和抗体滴度的测定 在第0天，第13天，第27天，第42天和第64天尾静脉取血，分离血清， 用间接ELISA法测定中和抗体的滴度。方法如下1) .用PBS稀释HPV16 L1N VLPs,浓度为0.2jig/100nl。向96孔ELISA板加 入100^1 HPV16 LIN VLPs包被液/孔，4"过夜。2) .吸去包被液后，用0.05外PBST洗涤三遍。3) .每个孔加入200jU 5%BSAin 0.05%PBST,室温2小时。4) .吸去封闭液后，用0.05%PBST洗涤三遍。5) .用1。/。BSAin0.05。/。PBST将待测免疫血清用不同比率进行稀释，每孔加入 100jil稀释样品，室温2h。6) .吸去样品后，用0.05外PBST洗涤三遍。酶标记羊抗鼠IgG二抗，37":育lh。、' 、8) .吸去二抗后，用0.05。/。PBST洗涤五遍。9) .每孔中加入邻苯二胺(OPD)底物溶液100^1， 37"胖育5min(避光)。 底物用磷酸一柠橡酸缓冲液(pH5.0)A液柠檬酸1.92g加ddH20到100ml B液NaaHPCU 12 H20 7.16g加ddH20到100ml 取2.43ml(A) + 2.57ml(B) + 5ml ddH20混合即为所需溶液。 加底物前新鲜配制30%H2O2 +邻苯二胺4mg + 9.985ml磷酸-拧檬酸缓 冲液。10) .加入50ul12M H2S04终止反应。用酶标仪测波长4卯nm处的光密度(OD)。 11).抗体滴度定义为OD值是同比稀释度对照血清的2倍以上，而且OD值 大于0.2。结果如图8所示，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs均能有 效的诱发小鼠产生高滴度的中和抗体，其中第三次免疫后两周，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠的平均中和抗体滴度为507500和 卯OOOO，第三次免疫后5周，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs 免疫小鼠的平均中和抗体滴度为28卯00和677500。 HPV16L1N/L2 VLPs和 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs诱发中和抗体的长效保护水平正在监测中。与 HPV16LlN/L2VLPs疫苗相比，含有L2-LTK63基因的L1N/L2-LTK63 VLPs疫苗 可显著提髙HPV16L1N/L2 VLPs特异的血清抗体滴度。实施例17.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒诱导产生构象依赖的中和抗体的检测用PBS稀释天然的HPV16 Ll VLPs和变性的HPV16 Ll VLPs (IOO"变性 5min)，浓度为0.2ng/100nl。向96孔ELISA板加入lOOjtl天然的HPV16 Ll VLPs 包被液/孔或变性的HPV16 Ll VLPs包被液/孔，4"过夜。用0.05%PBST洗涤三遍 后用5。/。BSA-0.05。/。PBST封闭，加入l: 3000稀释的小鼠抗血清，室温孵育2h。 0.05WPBST洗涤三遍后，加入l: 3000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二 抗，37"孵宵lh。0.05。/。PBST洗涤五遍。每孔中加入邻苯二胺(OPD)底物溶液100jil， 37卩孵育5min(避光)。加入5(Hd 2M H2S04终止反应。用酶标仪测波长4卯nm处 的光密度(OD)。结果如图9所示，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs诱发产 生的中和抗体均为构象依赖的，这些中和抗体能有效的结合天然的病毒样颗粒， 而对变性的病毒样颗粒的结合能力很低。实施例18.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒免疫小鼠脾细胞的制备1) .将小鼠引颈处死后，用70%酒精对小鼠进行消毒，取小鼠脾脏，放入装有 3ml DMEM-5(DMEM， 5%胎牛血清，100 U/ml青雾素，IOO ng/ml硫酸链霉素，2 mML-glutamine)的直径为24mm的平皿中，用无菌的剪子将脾脏剪成小块，用注 射器后柄以旋转方式将脾脏碾碎。2) . 1500rpm离心10分钟，用10mlDMEM-5将细胞沉淀吹匀。垂直静置5 IO分钟，吸取上层细胞悬液，以去除残留的结缔组织。3) . 1500rpm离心10分钟后，加入4ml ACK(NH4Cl 4g, KHJCU 0.05g，加ddH20 至500ml)红细胞裂解敏脾脏，吹匀后，37"孵育5mins,加入10mlDMEM-5。4) .1500rpm离心10分钟。如仍有红细胞，重复步骤3后离心。5) .用DMEM-5洗涤三遍，用10mlDMEM-5重悬细胞，计数。 实施例19.人乳头癯病毒16型病毒样颗粒免疫小鼠脾细胞的增殖试验1) .第三次免疫后3周，分离免疫小鼠的脾细胞。2) .实验于U型96孔板中进行加入3xl0S脾细flS/200nl/孔，刺激孔每孔加 入2吗HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs，阴性对照孔不加 VLPs，每个处理设3个重复。3) . 37"C孵育72h后每孔加入50nl含有HPV16L1N/L2 VLPs或 HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs和3H-TdR的完全培养基吹匀后，使得311-丁祖的量 为lnCi/we11,继续培养18h。4) .用多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，室温凉干，放于盛有5ml 闪烁液(闪烁液5g PPO+0.5g POPOP，溶于1000ml二甲苯中)的闪烁杯内，p 闪烁计数仪测定cpm值。刺激指数(stimulating index, SI)的计算:SI-抗原刺激管cpm 均值/培养基对照管cpm均值。结果如图10所示，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫 小鼠的脾细胞在HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs刺激下能有 效的发生增殖，平均刺激指数分别为3.950和6.241，均明显高于PBS对照组(平 均刺激指数为1.037)， HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs与HPV16L1N/L2 VLPs相比能 跟有效的诱导特异性脾淋巴细胞增殖。实施例20.流式细胞术检测人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒免疫小鼠的抗原 特异性Th细胞1) .第三次免疫后6周，分离免疫小鼠的脾细胞。于96孔U型板中，加入l,2xl06 脾细胞/200^1/孔，每孔加入2吗HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs，每组设四个孔，其中两个孔用于检测CD4+ZIL-4、细胞，另两个用于检 测CD4+7IFNV"Th细胞。2) . 37"孵育72h后，每孔加入4^1经过1: 30稀释后的BD GolgiStop(BD Biosciences,货号554724), 37"C继续培养6-12h。3) .将细胞收于流式管中，用lml staining buffer (PBS， 1%胎牛血清)洗细胞一 次，4卩，1500xg离心10min，将细胞重悬于200jU staining buffer。4) .每管加入4^1 0.5 ng/jil 2.4G2 (BD Biosciences.货号553142)，混匀后，冰 浴30min。5) .用lml staining buffer洗细胞一次，4t:, 1500xg离心10min，将细胞重悬 于100^1 staining buffer。双阴性对照管细胞悬于500jjJ staining buffer,放置于4"C， 等待上机检测。6) .在CD4单染，CD4/IL4双染以及CD4/IFN^双染的lOOpl细胞悬液中加 入4^1 0.5 FITC标记的大鼠抗小鼠CD4单抗(BD Biosciences.货号 553651)，在IL4单染和IFNi单染的100jU细胞悬液中加入4jil 0.5 ng/jd FITC
标记的大鼠IgG^k同型对照抗体(BD Biosciences.货号554688)，混匀后，冰浴避 光孵育30min。7) .用lml staining buffer洗细胞两次，每次于4", 1500xg离心10min。8) .离心后，用振荡仪将细胞块振荡分散，每管中加入250jil BD Cytofix/Cytopenn溶液，混匀后，冰浴避光孵育30min。9) .用lml lxPerm/Wash溶液(将10xBD Perm/Wash溶液(货号554728)储 存液用蒸馏水h IO稀释)洗细胞两次，每次于4"C, 1500xg离心10min。10) .离心后，用50^1 lxPerm/Wash溶液重悬细胞。CD4单染的5(HU细胞悬 液中加入5jil 0.2 ng/nl PE标记的大鼠IgGl同型对照抗体(BD Biosciences.货号 554685)， IFN"Y单染和CD4/IFN-y双染的50jU细胞悬液中加入5^1 0.2 jig/^il PE 标记的大鼠抗小鼠IFN"Y单抗(BD Biosciences.货号554412), IL-4单染和 CD4/IL4双染的50^1细胞悬液中加入5jU 0.2 jig/jd PE标记的大鼠抗小鼠IL-4单 抗(BD Biosciences.货号554435)。混匀后，冰浴避光孵育30min。11) .用lml lxPerm/Wash溶液洗细胞两次，每次于4卩，1500xg离心10min。12) .离心后将细胞重悬于500nl staining buffer,上机检测。结果如图11和图12所示，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16LlN/L2-LTK63 cVLPs 免疫组CD4+/IFN^+Thl细胞分别为9300/3xl()S脾细胞和13500/3xl()5脾细胞，明 显高于PBS对照组；同样HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免 疫组CD4+/IL-4+ Th2细胞分别为1800/3xl()S脾细胞和7500/3xl()S脾细胞，明显高 于PBS对照组。这说明HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫 后均能有效的诱发产生抗原特异性CD4+ZIFNV和CD4+/IL4+的T细胞。与 HPV16L1N/L2 VLPs疫苗相比，含有L2-LTK63基因的L1N/L2-LTK63 cVLPs疫苗 可显著提高HPV16L1N/L2 VLPs特异CD4+ZIFNV"和CD4+/IL4+的T细胞数目。 序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120>人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途<130> <160> 3<170> Patent In version 3.3<210> 1 <211> 1518 <212> DNA<213>人乳头癍病毒16型(HPV16L1N) <400> 1atgtccctgt ggctgccctc cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgtccaag 60 gtggtgtcca ccgscgagta cgtggctcgc acc站catct actaccscgc tggtacctcc 120 cgcctgctgg cagttggaca tccctatttt cctattaa站aacctaacaa taacaaaata 180 ttagttccta aagtatcagg attscsatsc agggtattta gaatacattt acctgacccc 240 aat站gtttg gttttcctga cacctcattt tat站tccag atacacagcg gctggtttgg 300 gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat tagtggccat 360 cctttatt站stEL站ttgg6L tg3cscaig站站tgctsgtg cttatgcagc a站tgcaggt 420 gtggataata gagaatgtat atctatggat tacaaacaaa cacaattgtg tttaattggt 480 tgcaaaccac ctatagggga acactggggc aasggatccc catgtaccaa tgttgcagts 540 aatccaggtg attgtccacc sttagagtta ataaacacag ttattcagga tggtgatatg 600 gttgatactg gctttggtgc tatggacttt actacattac aggctaacaa 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gcaatcagtatggaaaactaat2571<210> 3 <211> 856 <212> PRT<213>融合蛋白Ii2-I/TK63 <400> 3 MRHKRSAKRTKRASATQIiYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQIIiQYGSMGVFFGGIiGI60GTGSGTGGRTGYIPIiGTRPPTATDTLAPVRPPIiTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAP120TSVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAIIiDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGH180FTLSSSTISTHNYEEIPMDTFIVSTNPNTVTSSTPIPGSRPVARLGLYSRTTQQVKWDP240AFVTTPTKIiITYDNPAYEGIDVDNTIiYFSSNDNSINIAPDPDFIiDIVALHRPALTSRRTG300IRYSRIGNKQTIiRTRSGKSIGAKVHYYYDLSTIDPAEEIEIiQTITPSTYTTTSHAASPTS360INNGLYDIYADDFITDTSTTPVPSVPSTSLSGYIPANTTIPFGGAYNIPIiVSGPDIPINI420TDQAPSLIPIVPGSPQYTIIADAGDFYIiHPSYYMIiRKRRKRIiPYFFSDVSLAAASGGGGS480GGGGSGGGGSTMNGDRIiYRADSRPPDEIKRSGGLMPRGHNEYFDRGTQMNINIiYDHARGT540QTGFVRYDDGYVSTKLSIiRSAHLAGQSILSGYSTYYIYVIATAPNMFNVNDVLGVYSPHP600YEQEVSAIiGG工PYSGIYGWYRVNFGVIDERIiHRNREYRDRYYRNLNIAPAEDGYRLAGFP660WIHHAPQGCGNSSRTITGDTC肌ETQUIiSTIYLREYQSKVKRQIFSDYQS720EVDIYNRIRDELMNKVKCYVAHGAPQTITEIiCSEYRNTQIYTINDKILSY780TESMAGKREMVIITFKSGETFQVEVPGSQHIDSOKKAIERMKDTLRITYIiTETKIDKIiCV840柳NKTPNSIAAISMEN856 a
权利要求
1.一种病毒样颗粒，其特征在于该病毒样颗粒由选自序列为SEQ ID N0.1的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或核苷酸序列为SEQ ID NO.2的HPV16L1N/L2-LTK63嵌合基因所编码，该病毒样颗粒由下列步骤获得1)使用pFastBacDual-HPV16L1N、pFastBacDual-HPV16L1N/L2或pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63linkB重组质粒分别转化感受态大肠杆菌DH10Bac；2)筛选鉴定获得分别重组有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63linkB基因的重组Bacmid；3)将所述重组Bacmid转染对数生长期的昆虫细胞，转染后收集上清，获得含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63linkB基因的重组杆状病毒；4)用所述含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63linkB基因的重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，使重组杆状病毒在感染细胞内分别表达导入的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63基因；5)裂解感染有含HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63linkB基因的重组杆状病毒的细胞，纯化获得HPV16L1NVLPs、HPV16L1N/L2VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63嵌合病毒样颗粒。
2. 根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其中所述的pFastBacDual-HPV16L1N/L2 重组质粒于2006年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，其保藏号为CGMCC ID NO. 1802。
3. 根据权利要求1所述的病毒样颗粒，其中所述的 pFastBacDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkB重组质粒于2006年9月7日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏号为CGMCC ID NO. 1803,
4. 一种序列号为SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的HPV16L1N基因。
5. —种序列号为SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的融合基因L2-LTK63。
6. 根据权利要求5所述的融合基因L2-LTK63,其编码的蛋白质具有SEQ ID NO. 3 所示的氨基酸序列。
7. —种含有HPV16L1N基因的pFastBacDual-HPV16LlN重组质粒，其特征在于 HPV16L1N基因位于PH启动子的下游。
8. —种保藏号为CGMCC NO. 1802的pFastBacDual-HPV16LlN/L2重组质粒，其特 征在于含有位于P10启动子下游的HPV16L2基因。
9. 一种保藏号为CGMCC NO. 1803的pFastBacDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkerB 重组质粒，其特征在于含有位于P10启动子下游的L2-LTK63基因。
10. 含有如权利要求1所述HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63嵌合基因的重组Bacmid。
11. 含有如权利要求10所述的重组bacmid的大肠杆菌DH 10Bac菌株。
12. 含有如权利要求10所述的重组Bacmid的昆虫S 细胞。
13. 如权利要求12所述的昆虫Sf9细胞表达的重组杆状病毒。
14. 如权利要求1所述的病毒样颗粒在制备用于预防HPV16病毒的感染以及感染 诱发的宫颈或外阴部位的癌前病变及恶性肿瘤的疫苗中的应用。
15. 根据权利要求14所述的应用，其中所述的恶性肿瘤是与HPV16感染相关的 宫颈癌、阴茎癌、口腔鳞状细胞癌、食道癌或前列腺癌。
16. —种制备病毒样颗粒的方法，其步骤包括1 ) 使用 pFas迅acDual-HPV16LlN 、 pFastBacDual-HPV16LlN/L2 或 pFastBacDual-HPV16LlN/L2-LTK63 linkB重组质粒分别转化感受态大肠杆菌 DH10Bac;2) 筛选鉴定获得分别重组有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组Bacmid;3) 将所述重组Bacmid转染对数生长期的昆虫细胞，转染后收集上清，获得含 有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的 重组杆状病毒；4) 用所述含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒感染对数生长期的S 昆虫细胞，使重组杆状病毒在 感染细胞内分别表达导入的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或 HPV16L1N/L2-LTK63基因； 5)裂解感染有含HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒的细胞，纯化获得HPV16LlNVLPs、 HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63嵌合病毒样颗粒。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述的pFastBacDual-HPV16LlN/L2重组质 粒于2006年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其 保藏号为CGMCC ID NO. 1802。
18. 根据权利要求16所述的病毒样颗粒，其中所述的 pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63 linkB重组质粒于2006年9月7日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保裁号为CGMCC ID NO. 1803。
全文摘要
本发明涉及人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒，及其生产方法和用途，在生产中使用了对N端改造的主要衣壳蛋白基因和C末端融合改造的大肠杆菌热不稳定肠毒素LTK63的次要衣壳蛋白L2融合基因；在杆状病毒一昆虫细胞表达体系中生产L1NVLPs、L1N/L2VLPs和L1N/L2-LTK63嵌合病毒样颗粒(cVLPs)。源自HPV16L1N基因的病毒样颗粒产量高；本发明还涉及所述病毒样颗粒在制备疫苗中的应用，该疫苗免疫原性好，可预防HPV16感染及相关病变。
文档编号C12N15/09GK101148661SQ20061012738
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月18日 优先权日2006年9月18日
发明者刘世德, 司静懿, 宋国兴, 张洪涛, 许于飞, 许雪梅 申请人:中国医学科学院基础医学研究所