李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法及抗血清和试剂盒的制作方法

专利名称：李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法及抗血清和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用毕赤酵母表达李坏死环斑病毒外壳蛋白基因的方法，本发明还涉及一种采用该表达外壳蛋白基因制备的抗血清；本发明还涉及一种李坏死环斑病毒ELISA检测试剂盒。
背景技术：
李坏死环斑病毒(Plum necrosis ringspot virus, PNRSV)是我国最新颁布的进境植物的检疫性病原物，是核果类果树危险性最大的病毒之一，果树一旦受其侵染，会造成未成熟果实大量脱落、产量严重下降，并且使果实品质大幅度下降。且该病毒传播速度快，在短时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难性损失。目前中国仅有局部地区有该病毒发生的报道。由于我国奉行改革开放的国策，同他国种质资源交流越来越频繁，为了防止该病毒随着种子、苗木等繁殖材料的引进而进入我国，以保护我国农业的健康和可持续发展，必须加强对该病毒的检验检疫。酶联免疫吸附分析法(ELISA)是目前灵敏较高、比较稳定且通量较高的一种成熟的检测方法，是口岸植物种苗病毒的常规检测和对多个样品的快速检测的首选方法。但由于该病毒在果树体内含量非常低，繁殖困难，因此要大量提纯该病毒并制备高效价的抗血清就变得十分困难，而且本病毒目前在我国属于检疫性病毒之列，不宜为各个检测部门提供该病毒作为阳性对照，这样就在很大程度上限制了对该病毒进行血清学检测
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用毕赤酵母表达李坏死环斑病毒外壳蛋白基因的方法；本发明的另一个目的是提供一种采用该表达基因制备的抗血清；本发明的另一个目的是提供一种李坏死环斑病毒ELISA检测试剂盒。为了达到上述目的，本发明采用以下方案一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于包括以下步骤A、从PNRSV感病材料中提取李坏死环斑病毒的RNA ；B、采用RT-PCR扩增的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白基因；将得到的壳蛋白基因连接到PGEM-T载体上，得到pGEM-T-PNRSV重组载体，并以序列分析确定该病毒外壳蛋白基因的序列正确性；C、构建PNRSV外壳蛋白基因真核表达载体；D、转化毕赤酵母GS115菌株,诱导毕赤酵母表达外壳蛋白；Ej Western-blot检测表达蛋白大小的正确性。如上所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤A中提取李坏死环斑病毒的RNA具体包括以下步骤(I)取PNRSV感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成< IOOmg小份至预冷Ε· P管，取IOOmg样品加入ImlTriZOL抽提；(2) 12000rpm, 2-8°C 离心 IOmin ；(3)吸取上清液，转移至新的1. 5mlE. P管中，15_30°C放置5min ；(4)加 O. 2ml 氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5) I^OOOrpmJ-SO 离心 15min ；(6)吸取上清液，转移至新的1. 5mlE. P.管中，加O. 5ml异丙醇，15_30°C放置IOmin ；(7) I^OOOrpmJ-SO离心 IOmin ；(8)弃去上清液，得胶体状RNA，加1-1. 5ml75%乙醇，涡旋混匀(9) 7500rpm、2-8°C离心5min，弃去上清液，留下胶体状RNA ；(10)干燥 5-10min ；(11)溶于 Rnase. free 水中，枪头打勻，55_60°C温浴 IOmin ；(12)5% Agarose胶检测，测定浓度并调至2_3μ g/μ L，_70°C储存备用。如上所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤B具体方法包括

a、RT-PCR扩增目的基因⑴引物上游引物PNRSV-F 5 ' -GTGGATCCTACGTAATGGTTTGCCGAATTTG-3 '，其中 GGATCC为BamHI酶切位点，TAC GTA为SnaB I酶切位点；下游引物PNRSV-R 5 ' -GGAAGCTTGCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3 '，其中 AAGCTT为Hind III酶切位点，GCGGCCGC为Not I酶切位点；在引物两端即5，及3，分别加上了 SnaB I及NotI酶切位点引物；(2)扩增体系模板RNA I μ L ；5 μ mol/L上游引物I μ L ；5μ mol/L 下游引物 IyL;扩增酶混合液 I μ L ；2 X buffer 12. 5μ L ；RNase-freeddH20至总体积25 μ L ;(3)扩增过程50°C 30min, 94。。3min, 94°C lmin, 60°C 30s, 72°C lmin, 72°C IOmin,4°C ;其中 94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循环 35 次；b、基因克隆及序列测序(I)PNRSV CP 产物的回收取扩增产物在I % TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收；(2)重组质粒的构建采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒，具体步骤为电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4 μ L回收产物，I μ LpGEM-T载体，5 μ L连接液，补充ddH20至总体积10 μ L ;16°C下反应过夜；(3)感受态细胞制备于LB培养基平板上活化DH5 α菌株，并挑取单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37°C下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5ml菌液，于IOOml LB液体培养基，37°C摇动培养2 2. 5hr,至OD600 = O. 6 O. 8时，吸取1. 5ml菌液于1. 5ml离心管中，冰浴5min,4°C下4000g离心lOmin，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300 μ L冰预冷的100mmol/L CaCl2重悬浮菌体,冰浴30min,4°C下4000g离心IOmin,收集沉淀,力口入100 μ L冰预冷的100mmol/L CaCl2重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4°C冰箱中放置12 24hr备用；或加入70 μ L冰预冷的100mmol/LCaCl2和30 μ L50%甘油于_70°C保存备用；(4)重组质粒的转化及筛选从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10 μ L连接产物于100 μ L感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42°C水浴中热激90sec,迅速将离心管冰浴3 5min。每管中加入800 μ LLB液体培养基(不含抗生素)，37°C下摇动培养90min，以利于细菌的复苏和质粒编码抗性基因的表达；采用抗生素和α -互补法筛选重组质粒；取100ml LB固体培养基加热融化，待冷却至60°C以下时，加入100 μ LAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4 μ LIPTG，200mg/ml水溶液过滤除菌及40 μ LX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200 μ I转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37°C下倒置培养16 24hr ;挑取直径约为I 2mm大小的白色菌落于5ml LB液体培养基中，37°C下摇动培养12 16hr，标记后取0. 7ml与0. 3ml 50%的灭菌甘油混匀后，置_80°C下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及 鉴定；(5)重组质粒的抽提经抗生素及α -互补法筛选得到的待检菌落培养物于4°C冰箱内预冷5 lOmin，采用碱裂解法抽提质粒DNA ;具体步骤如下离心管标号，取含重组质粒的菌体液1. 5ml至离心管中，4°C、12000g、离心lmin，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150 μ L溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5 lOmin，加入250 μ L溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，加入180 μ L溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6 7min，4°C、12000g离心lOmin，上清夜移入干净的离心管中，分别加入1/2体积的氯仿/异戊醇、Tris饱和苯酚，混匀，4°C、12000g离心5min，取上清，氯仿/异戊醇再抽提一次；上清水相移入干净离心管中，加入1/10体积NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，-20°C冰箱中20min或过夜，4°C、12000g离心lOmin，弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上，吸干余液，70%, 100%乙醇各洗一次，室温下风干，加入20 μ LTE，_20°C冰箱中备用；(6)重组质粒的鉴定①、特异引物PCR鉴定利用特异引物对待检重组质粒进行PCR扩增，反应体系程序参数同上，PCR产物在1% TBE琼脂糖凝胶上电泳鉴定，凡含有目的扩增片段的克隆，进一步进行酶切鉴定；②、重组质粒酶切鉴定经PCR鉴定阳性的重组质粒，以下列体系进行双酶切10 X HBufferl. 5 μ L，BamHlO. 5 μ L, HindIIIO. 5 μ L，待检质粒 4 μ L，加 ddH20 至总体积 15 μ L，37°C下反应过夜，取10 μ L反应液电泳检测酶切结果；③、重组质粒序列测定经上述PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体，抽提并纯化质粒后，利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定。如上所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤C的具体做法用PCR扩增出PAP基因，然后回收该基因片段后用SnaB I和Not I双酶切，再与用同样双酶切的载体PPIC9K相连接构建成表达载体PPIC9K-P，将pPIC9K_P转化大肠杆菌JM109后经筛选培养基筛选，碱法提取其重组质粒，然后用酶切及PCR进行鉴定；用PCR和质粒酶切鉴定方法筛选出的阳性重组子后，再进行DNA测序，以验证阅读框的正确性。如上所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤D的具体做法序列分析验证后，再用酶BglII将表达载体PPIC9K-P线性化，然后通过电转移方法将其导入酵母GS115菌株的感受态细胞；(I)制备酵母感受态细胞酵母菌株P.pastoris GS115 于 500ml YPD 中 30°C培养至 A 600 =1. 5，1500g离心收集菌体，先后用500ml、250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清夜，用20ml预冷的Imol/L山梨醇悬浮菌体,离心后菌体再用O. 5ml预冷的山梨醇悬浮后备用；(2)制备转化DNA :质粒DNA的提取采用碱裂解法，然后将提取的DNA用BglII酶切，使之分成二个片段，其中之一是含有酵母表达盒的DNA区段，将其用低熔点琼脂糖电泳后回收；(3)酵母细胞的转化取上述步骤制备的 I 5μ gDNA加到40μ I山梨醇悬浮的酵母细胞中，冰浴5min，然后用电击仪电击，参数为0. 8kV、11.5yF;电击结束后立即加入O. 5ml预冷的lmol/L山梨醇，取200μ I于固体RDB转化培养基为RDB : 18. 6%山梨醇、2%葡萄糖、1. 34% ΥΝΒ、
0.00004%生物素、各O. 005%谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、2%琼脂糖，上涂板，30°C培养直至转化子出现；用牙签挑取转化子对应点种到MM :1. 34% YNB,O. 00004%生物素、O. 5%甲醇、1. 5%琼脂糖，平板和MD :1. 34% YNB,O. 00004%生物素、2%葡萄糖、
1.5%琼脂糖上，30°C培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子即为阳性克隆；(4) PNRSV CP基因在酵母中的诱导表达具体操作按Invitrogen 公司 Pichia Expression Kit 程序进行。如上所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤E的具体做法(I)表达蛋白分子量的测定取Iml酵母发酵液，13000rpm离心15分钟，取上清10 μ I进行SDS-PAGE，电泳后
用考马斯亮兰染色；(2)表达蛋白 Western-blot 检测SDS-PAGE电泳后将表达蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，然后用PNRSV抗血清作为一抗与硝酸纤维素膜上的蛋白进行免疫反应，之后再用第二抗血清即碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗血清对表达蛋白进行特异性鉴定，以未用甲醇诱导的酵母培养液作为阴性对照。本发明一种抗血清，其特征在于其制备方法包括以下步骤根据预表达结果，选取高效表达的毕赤酵母GSl 15菌株，大量诱导表达，经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，切胶条带用生理盐水适当稀释后，加入等体积福氏不完全佐剂乳化；蛋白液体lmg/mL直接与福氏不完全佐剂进行乳化；免疫大白兔采用肌肉注射结合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分别于第21天、第35天和第49天加强免疫3次；最后一次注射免疫后7天开始少量静脉采血测定效价，根据效价情况分次大量取血；制备的抗血清加入O. 02%的叠氮化钠，-200C保存。抗血清效价及特异性测定将抗血清进行一系列稀释后，用间接ELISA方法测定抗血清的效价和特异性。(I).用包被液将抗原稀释成2ug/mL，IOOul/孔加到96孔可拆酶标板中，4°C过夜。
(2). PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，加200ul/孔I % BSA, 37°C恒温箱2小时。(3).取抗血清按照1: 1000,1 2000,1 4000,1 8000，I ; 16000，I 32000,1 64000,1 128000作梯度稀释，每个样品不小于200ul。(4).取出37°C恒温箱里的抗原板，PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，加步骤3中稀释好的抗血清样品IOOul/孔，每个稀释度加并排两个孔。(5).取阴性血清1: 1000稀释按顺序加到抗血清最小浓度样品后作为阴性对照。置37°C恒温箱I小时。(也要重复2次)(6). PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，羊抗兔酶标(辣根过氧化物酶)二抗按照使用说明稀释好，IOOul/孔加到酶标板中，置37°C恒温箱I小时。(7). PBS-T洗五次于吸水纸上拍干，TMB显色液IOOul/孔加到酶标板中，置37°C恒温箱10分钟。酶标仪450nm测OD值并打印结果。(8).通常将2. 5倍阴性对照OD值看作阳性，根据结果判断样品滴度。(9).选择最适合的工作浓度，分别与TMV、PVX、PVY等病毒进行免疫反应，以测试该血清的特异性。本发明一种试剂盒，其特征在于该试剂盒内包括1). PNRSV抗体；2).酶标抗体碱性磷酸酯酶标记；3).底物对硝基苯磷酸钠(P NPP) ；4). PNRSV阳性对照；5). PNRSV阴性对照。

本发明中材料、主要试剂、仪器和溶液等1、PNRSV感病材料由西班牙国家生物技术中心分子生物学实验室提供，于_80°C超低温冰箱中保存。2、主要试剂=Trizol试剂、Taq酶、M-MLV反转录酶，T4连接酶及甲醇、山梨醇、酵母氮碱等均购自广州普博生物技术公司；限制性内切酶均购自大连宝生物公司；pPIC9K载体、毕赤酵母GS115菌株购自Invitrogen公司。3、主要仪器BIOTEK酶联检测仪、日本梯度PCR仪、Labofuge400R型冷冻高速离心，高速台式离心机、DYY-7型转移电泳仪，Pharmacia EPS601型电泳仪；法国UVP凝胶成像系统；日本Shimadzu公司UV-120-02型可见-紫外分光光度计；HARRIS超低温冰三洋牌、法国吉尔森牌移液器；单人型超净工作台；人工气候箱LRH-250-GS，隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS，HZQ-C空气浴振荡器，电热恒温水浴锅DK-S22等等。4、主要溶液的配制:⑴PBS缓冲液每IOOOmL中，含2. 2gNa2HP04. 12Η20、0· 2gKH2PO4,8. Og NaCl、0· 2g KCl、0· 2g NaN3,调节 pH 至 7. 3 ; (2) PBST 每 IOOOmL PBS 中力口O. 5mL Tween-20。(3)摩擦接种缓冲液=PBS中加入I %的铜试剂。(4)0.1 % DEPC水溶液IOOOmL水中加入ImLDEPC后，37°C下处理24hr，高压灭菌，封闭保存。(5) RNA提取缓冲液4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L朽1檬酸钠,0. 5%十二烧基肌氨酸纳(w/v),0. lmol/L巯基乙醇，2mol/LNaAc，水饱和酚(ρΗ3· 5)。(6) 10XMOPS 0. 2mol/L MOPS (pH7. O), IOmmol/L EDTA (pH8. 0),80mmol/L NaAc。(7) LB 培养基胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母浸出液(Yeast Extract) 5g/L,氯化钠(NaCl) lOg/L, pH 7. 0 7. 2,固体培养基加1. 5% (w/v)琼脂粉。(8)质粒抽提缓冲液溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (pH8. O)，IOmmol/L EDTA(pH8. 0)，分装后高压灭菌，于 4°C下保存;溶液 I1:0. 2mol/L NaOH, I % SDS (w/v),4mol/L NaOH和20% (w/v) SDS贮存液现配现用；溶液II1:在60mL 5mol/L的乙酸钾溶液中加入11. 5mL冰乙酸和28. 5mL水，配成浓度为3mol/L(pH5. 3)，乙酸钾浓度为5mol/L的溶液。(9)10% (w/v) SDS溶液(IOOmL) SDS 10g，加入ddH20至终体积100mL。室温保存(使用前确保SDS没有沉淀)。(10)酶联免疫吸附试验(ELISA)的相关试剂A.抗原包被缓冲液(0.05mol/L pH 9. 6 碳酸盐缓冲液):每 IOOOmL 中含1. 59g Na2CO3, 2. 93gNaHC03,0. 2gNaN3，调节 pH值至 9· 6 ；Β.洗涤缓冲液(0. 02mol/L ρΗ7· 3PBST 缓冲液):取 8· Og NaCl，0. 2gKCl，2· 9g Na2HPO4,0. 2gKH2P04,0. 5mL 吐温-20 (Tween-20)，蒸馏水定容至 lOOOmL，调节 pH至7. 3 ；C.1gG稀释缓冲液(O. 02mol/L PBST牛血清白蛋白缓冲液)0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶于IOOmL洗涤液中；D.磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5. 0) 0. 2mol/L Na2HP0425. 7mL,0. lmol/L柠檬酸液24. 3mL，加蒸馏水定容至IOOmL ；E.底物溶液(OPD-H2O2):该溶液现用现配，取磷酸盐-柠檬酸缓冲液IOOmL^ 40mg(随温度升高可调整至16mg)邻苯二胺(OPD)，避光充分溶解后，加入0. 15mL (随温度升高可调整至0. 07mL)30%的H2O2 ；F.终止液2mol/LH2S04。(11)氨苄青霉素(Amp):用双蒸水溶解，稀释至贮存浓度100mg/mL，过滤除菌后置-20°C备用；(12)氯仿 异戊醇(24 I):取氯仿48mL、异戊醇2mL，充分混匀后，棕色瓶中保存。(13)TE :含 10mmol/LTris-Cl，lmmol/L EDTA，调 pH 值至 8· O ; (14) EB 母液(lOmg/mL):称取IOmg EB溶解于ImL蒸馏水中，避光保存，工作浓度为0. 5 μ g/mL。(15)5XTBE母液称取 54g Tris base，27. 5g 硼酸，0. 5mol/LEDTA(PH 8. 0) 20mL，双蒸水定容至 1000mL。稀释10倍为0.5 X TBE工作液。本发明技术方案1.提取李坏死环斑病毒的总核酸；2.以总核酸为模板，用Oligo (dT)为引物，反转录成cDNA第一链；3.设计李坏死环斑病毒外壳蛋白基因的特异性引物，以cDNA第一链为模板，PCR扩增外壳蛋白基因；4.将外壳蛋白基因克隆到pGEM-T载体上，然后进行序列测定，以确证基因序列的正确性；5.从pGEM-T载体上将外壳蛋白基因切下，克隆到真核表达载体PPIC9K上，转化毕赤酵母GSl 15菌株，然后诱导毕赤酵母表达外壳蛋白；6.用Western-blot检测表达蛋白大小的正确性；7.大量表达外壳蛋白，然后进行回收,免疫家兔；8.抽取免疫家兔体内血，检测其是否产生抗血清及其特异性；9.测定抗血清的效价，制备酶联免疫检测试剂盒，并在实际检测工作中加以检验。本发明融合了现代分子生物学、分子病毒学及免疫学等理论和技术，避开了传统的生产抗原和抗体的方法，采用分子生物学方法，利用真核生物的繁殖来大量表达该病毒的外壳蛋白，该表达蛋白即可以为血清学检测提供阳性对照，又能够用来作为抗原生产抗血清，提供给检测部门尤其是检疫部门的检测使用。同时由于已经将该病毒的外壳蛋白基因克隆在表达载体上，因此可以源源不断地生产出外壳蛋白作为阳性对照之用，同时避免了直接用该病毒或被该病毒侵染的寄主植物存在病毒逃逸的危险，从而充分保证了检测工作中抗血清的供应以及生物安全性问题。


图1为PNRSV重组质粒PCR鉴定结果图；图2为真核分泌型表达载体PPIC9K-PNRSV的构建示意图；图3真核表达载体pPIC9K_PNRSV PCR及双酶切鉴定结果图；图4为酵母表达蛋白SDS-PAGE分析结果图；图5表达蛋白Western-blotting特异性检测结果图；图6回收PNRSVCP蛋白的SDS-PAGE分析结果图。其中图1中2、3、5、6号转化子有PNRSV CP基因片段插入。“M”表示IOObp ladderDNA Marker. “一”指示为PNRSV CP片段(675bp)。图3中1.分子量对照，2.双酶切，3. PCR鉴定。图4中LMarker(Ku) : 15，20，31，43，66. 2 ;2.表达蛋白，3.阴性对照；图5中1:甲醇诱导的表达产物；2 :阴性对照;图6中1:M :蛋白质分子量对照(150kDa, IOOkDa, 75kDa,50kDa，31kDa，20kDa，15kDa)2 :E1_E8 :诱导表达蛋白产物
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明做进一步描述实施例1
1、病毒样品的保存及鉴定保存主要采用二种方法，-是选取症状典型叶片标本速冻干燥后，保存于_80°C冰箱中；二是抽提病株总DNA和RNA并保存于-80°C冰箱中。鉴定采集的样品先采用血清学方法，主要是ELISA进行检测，根据血清学检测结果，再用现代分子生物学方法如PCR检测法进行确证。2、PNRSV的血清学检测方法采用间接ELISA方法进行，步骤如下(I)取待测样品O. lg，用研杵捣碎，加入ImL的抗原包被缓冲液，转入1. 5mL离心管中，2700g离心，取上清液体；(2)加入200 μ L上清液体到酶联板样品孔中以包被抗原，37°C下，孵育2hr ；
(3)倒掉包被液，用PBST洗板3次，每次3min ； (4)加入PNRSV特异性IgG,每孔150uL,37°C，温育2hr ； (5)倒掉此溶液，洗板同前；(6)加入酶标羊抗兔IgG，每孔100 μ L(工作浓度1: 3000)，37 °C下温育2hr ； (7)倒掉此溶液，洗板同前；⑶加入底物溶液TMB，每孔100 μ 1，室温30min后，每孔加50 μ L 2mol/L的H2SO4终止反应；(9)酶标仪测定OD450nm,观测记录显色情况，重复三次。注做ELISA检测时，每个样品至少重复2次，并需要设置阳性对照、阴性对照以及空白对照；而且显色时间不可过长。3、总RNA提取方法(I)幼嫩组织若干,液氮研磨，分装成< IOOmg小份至预冷E. P.管，IOOmg样品加入ImL TriZOL抽提几分钟(颠倒混勻)；(2) 12000rpm, 2-8°C 离心 IOmin ；(3)吸取上清(含RNA)，转移至新的1. 5mLE. P.管中，15_30°C放置5min(此前可于-70°C放置I月再抽提)；(4)加 O. 2mL(l/5XV01. TriZOL)氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5) 12000rpm、2-8°C离心15min(形成上层无色水相、中间相和下层有机相、中间相和有机相可用于DNA和蛋白质抽提)；(6)吸取上清，转移至新的1. 5mL E. P.管中，加O. 5mL (1/2 X V01. TriZOL)异丙醇，15-30°C放置 IOmin ；(7) I^OOOrpmJ-SO离心 IOmin ；(8)小心弃去上清，得胶体状RNA，加l_1.5mL( >= I X VOl. TriZOL) 75%乙醇，涡旋混匀(在75%乙醇中，RNA沉淀可于2-8°C放置二周、_70°C放置I年)；(9) 7500rpm、2_8°C离心5min,弃去上清，留下胶体状RNA ；(10)干燥5-10min (过干会使RNA难以溶解)；(11)溶于 RNase. free 水中，枪头打勻，55-6CTC温浴 IOmin ;(12)5% Agarose胶检测，测定浓度并调至2-31^/μ L。_70°C储存备用。4、RT-PCR扩增目的基因(I)引物设计合成根据已测定的PNRSV CP基因保守序列设计，上游引物PNRSV_F 5' -GTGGATCCTACGTA ATGGTTTGCCGAATTTG-3',其中 GGATCC 为 BamHI 酶切位点，TAC GTA为SnaB I酶切位点；下游引物PNRSV-R :5' -GGAAGCTT GCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3',其中 AAGCTT为Hind III酶切位点，GCGGCCGC为Not I酶切位点；在引物两端即5’及3’分别加上了SnaB I及Not I酶切位点引物；引物由北京奥科生物公司合成。(2)扩增参数体系采用大连宝生物公司的试剂盒PrimeScript One-Step Ver. 2. O进行一步法RT-PCR扩增。PCR产物4°C保存，取5 μ L在I %的琼脂糖凝胶上电泳，检查PCR结果。(2)扩增体系:模板RNA I μ L ；5 μ mol/L上游引物I μ L ；5 μ mol/L下游引物I μ L ；扩增酶混合液 I μ L ；2 Xbuffer 12. 5 μ L ；RNase-free ddH20 至总体积 25 μ L ；(3)扩增过程50°C 30min,94°C 3min,94°C lmin，60°C 30s，72°C lmin，72°C IOmin,4°C ;其中 94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循环 35 次；5、基因克隆及序列测序(I)PNRSV CP 产物的回收取扩增产物在1% TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收。具体步骤参照试剂盒说明取一1. 5mL离心管在电子天平上称重，切下体积尽可能小的凝胶块至离心管中，称重，按每IOOmg胶加入300 μ L Buffer DE_A,悬浮混匀后于75°C水浴加热，每隔2 3min混合一次，直至凝胶块完全融化，按Buffer DE-A体积的50%加入Buffer DE-B,混合均匀，DNA-prep柱置于2mL离心管中，并将上述混合液移入DNA-prep柱中，3600g离心lmin,弃滤液，将DNA-prep柱置回到原2mL离心管中，加入500 μ LBuffer ffl, 3600g离心lmin,弃滤液，将DNA-prep柱置回到原2mL离心管中，加入700 μ L已加无水乙醇的Buffer W2，3600g离心lmin，以同样的方法再用700 μ L Buffer W2洗漆一次，将DNA-prep柱置于1. 5mL离心管中，12000g离心lmin,将DNA-prep柱置于另一干净1. 5mL离心管中，在silica膜中央加入25 30 μ L 65°C预热的Eluent或去离子水，室温静置lmin，12000g离心lmin，洗脱DNA，_20°C保存备用。(2)重组质粒的构建采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒。连接反应方法按生产商推荐的方法进行，具体步骤为电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4 μ L回收产物，I μ LpGEM-T载体，5 μ L连接液，补充ddH20至总体积10 μ L ;16°C下反应过夜。(3)感受态细胞制备感受态大肠杆菌的制备参考Sambrook等(1989)的氯化钙法。具体步骤为于LB培养基平板上活化DH5 α菌株，并挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37°C下摇动培养过夜(约12 16hr)，形成种子菌液。取此5mL菌液，于IOOmLLB液体培养基，37°C摇动培养2 2. 5hr，至OD600 = O. 6 O. 8左右时，吸取1. 5mL菌液于1. 5mL离心管中，冰浴5min，4°C下4000g离心lOmin，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300 μ L冰预冷的lOOmmol/L CaCl2重悬浮菌体，冰浴30min，4°C下4000g离心IOmin,收集沉淀,加入100 μ L冰预冷的100mmol/L CaCl2重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4°C冰箱中放置12 24hr备用；或加入70 μ L冰预冷的IOOmmol/L CaCl2和30yL50%甘油于一 70°C保存备用。(4)重组质粒的转化及筛选从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10 μ L连接产物于100 μ L感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42°C水浴中热激90sec,迅速将离心管冰浴3 5min。每管中加入800 μ L LB液体培养基(不含抗生素)，37°C下摇动培养90min，以利于细菌的复苏和质粒编码抗性基因的表达。米用抗生素和α -互补法(Sambrook, et al. , 1989)筛选重组质粒。取IOOmL LB固体培养基加热融化，待冷却至60°C以下时，加入100 μ LAmp,混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4 μ LIPTG (200mg/mL水溶液过滤除菌)及40 μ LX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200 μ L转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37°C下倒置培养16 24hr。挑取直径约为I 2mm大小的白色菌落于5mL LB液体培养基中(含100 μ g/mLAmp) 37°C下摇动培养12 16hr,标记后取0. 7mL与0. 3mL 50%(v/v)的灭菌甘油混匀后， 置-80°C下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定。(5)重组质粒的抽提经抗生素及α -互补法筛选得到的待检菌落培养物于4°C冰箱内预冷5 lOmin，采用碱裂解法抽提质粒DNA (Sambrook, et al. , 1989)。具体步骤如下离心管标号,取含重组质粒的菌体液1. 5mL至离心管中，4°C、12000g、离心lmin，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150 μ L溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5 IOminJPA 250 μ L溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，力口入180 μ L溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6 7min，4°C、12000g离心lOmin，上清夜移入干净的离心管中，分别加入1/2体积的氯仿/异戊醇、Tris饱和苯酚，混匀，4°C、12000g离心5min，取上清，氯仿/异戊醇再抽提一次。上清水相移入干净离心管中，加入1/10体积NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，-20°C冰箱中20min或过夜，40C、12000g离心lOmin，弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上，吸干余液，70%、100 %乙醇各洗一次，室温下风干，加入20 μ L TE，_20°C冰箱中备用。(6)重组质粒的鉴定A、特异引物PCR鉴定利用特异引物对待检重组质粒进行PCR扩增。反应体系程序参数同上，PCR产物在1% TBE琼脂糖凝胶上电泳鉴定。凡含有目的扩增片段的克隆，进一步进行酶切鉴定。
B、重组质粒酶切鉴定经PCR鉴定阳性的重组质粒，以下列体系进行双酶切10 X HBufferl. 5 μ L，BamHlO. 5μ L(14U/y L)，HindII 10. 5 μ L(14U/μ L)，待检质粒 4 μ L(约 400ng)，力口 ddH20 至总体积15yL，37°C下反应过夜，取10 μ L反应液电泳检测酶切结果。C、重组质粒序列测定经上述PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体，抽提并纯化质粒后，利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定，由宝生物工程(大连)有限公司进行DNA序列测定。6、PNRSV CP基因真核表达载体的构建用PCR扩增出PAP基因，然后回收该基因片段后用SnaB I和Not I双酶切，再与用同样双酶切的载体PPIC9K相连接构建成表达载体PPIC9K-P，将pPIC9K_P转化大肠杆菌JM109后经筛选培养基筛选，碱法提取其重组质粒，然后用酶切及PCR进行鉴定。用PCR和质粒酶切鉴定方法筛选出的阳性重组子后，再送到宝生物工程(大连)有限公司进行DNA测序，以验证阅读框的正确性。7、表达载体的序列分析及GS115的转化序列分析验证后， 再用酶BglII将表达载体PPIC9K-P线性化，然后通过电转移方法将其导入酵母GS115菌株的感受态细胞。具体操作程序如下7.1酵母感受态细胞的制备酵母菌株P.pastoris GS115于500mlYPD (I %酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖)中30°C培养至A600 =1. 5，1500g离心收集菌体，先后用500ml、250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清夜，用20ml预冷的lmol/L山梨醇悬浮菌体，离心后菌体再用O. 5ml预冷的山梨醇悬浮后备用。7. 2转化DNA的制备质粒DNA的提取采用碱裂解法，然后将提取的DNA用BglII酶切，使之分成二个片段，其中之一是含有酵母表达盒的DNA区段，将其用低熔点琼脂糖电泳后回收。8、酵母细胞的转化取步骤2. 2. 7. 2制备的I 5yg DNA加到40 μ I山梨醇悬浮的酵母细胞中，冰浴5min，然后用电击仪电击，参数为0.81 ν、11.5μΡ。电击结束后立即加入O. 5ml预冷的lmol/L山梨醇，取200 μ I于固体RDB转化培养基为RDB : (18. 6 %山梨醇、2 %葡萄糖、1. 34% YNB,O. 00004%生物素、各O. 005%谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、2%琼脂糖)上涂板，30°C培养直至转化子出现。用牙签挑取转化子对应点种到MM(1. 34%YNB,O. 00004% 生物素、O. 5% 甲醇、1. 5% 琼脂糖)平板和 MD (1. 34% YNB,O. 00004% 生物素、2%葡萄糖、1. 5%琼脂糖)上，30°C培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子即为阳性克隆。9、PNRSV CP基因在酵母中的诱导表达具体操作按Invitrogen 公司 Pichia Expression Kit 程序进行。10、表达蛋白分子量的测定取Iml酵母发酵液，13000rpm离心15分钟，取上清10 μ I进行SDS-PAGE，电泳后用考马斯亮兰染色。11、表达蛋白 Western-blot 检测SDS-PAGE电泳后将表达蛋白电转移到硝酸纤维素膜(NC)上，然后用PNRSV抗血清作为一抗与NC膜上的蛋白进行免疫反应，之后再用第二抗血清即碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗血清对表达蛋白进行特异性鉴定，以未用甲醇诱导的酵母培养液作为阴性对照。本发明表达产物的纯化及抗血清制备根据预表达结果，选取高效表达菌株，大量诱导表达，经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，切胶条带用生理盐水适当稀释后，加入等体积福氏不完全佐剂乳化；蛋白液体(lmg/mL)直接与福氏不完全佐剂进行乳化。免疫大白兔采用肌肉注射结合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分别于第21天、第35天和第49天加强免疫3次。最后一次注射免疫后7天开始少量静脉采血测定效价，根据效价情况分次大量取血。制备的抗血清加入O. 02%的叠氮化钠，_20°C保存。抗血清效价及特异性测定将抗血清进行一系列稀释后，用间接ELISA方法测定抗血清的效价和特异性。(I).用包被液将抗原稀释成2ug/mL，IOOul/孔加到96孔可拆酶标板中，4°C过夜。(2). PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，加200ul/孔1% BSA，37°C恒温箱2小时。(3).取抗血清按照1: 1000，I 2000，I 4000，I 8000，I 16000，I 32000，I 64000，I 128000作梯度稀释，每个样品不小于200ul。(4).取出37°C恒温箱里的抗原板，PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，加步骤3中稀释好的抗血清样品IOOul/孔，每个稀释度加并排两个孔。(5).取阴性血清1: 1000稀释按顺序加到抗血清最小浓度样品后作为阴性对照。置37°C恒温箱I小时。(也要重复2次)(6). PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，羊抗兔酶标(辣根过氧化物酶)二抗按照使用说明稀释好，IOOul/孔加到酶标板中，置37°C恒温箱I小时。
(7). PBS-T洗五次于吸水纸上拍干，TMB显色液IOOul/孔加到酶标板中，置37°C恒温箱10分钟。酶标仪450nm测OD值并打印结果。(8).通常将2. 5倍阴性对照OD值看作阳性，根据结果判断样品滴度。(9).选择最适合的工作浓度，分别与TMV、PVX、PVY等病毒进行免疫反应，以测试该血清的特异性。为了进一步验证本发明技术方案，作了一下测试和鉴定及分析1、提取植物总RNA以及含CP基因片段的克隆以带病叶片总RNA为模板，经RT-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度约675bp的DNA目的片段。扩增产物经纯化后克隆到pGEM -T载体上，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，对所获得的阳性克隆进行序列测定，确定了扩增产物的核苷酸序列，其中包含675bp的PNRSV CP序列，与GenBank报道的CP序列一致。2、含CP基因重组载体的酶切鉴定应用特异性引物PPV-F和PPV-R所获得的CP基因PCR产物经双酶切后，连接到同样用BamHl和HindIII双酶切的可隆载体上，组建成重组载体。经Colony PCR扩增，阳性克隆可以得到675bp大小的条带，抽提质粒经BamHl和HindIII双酶切证明筛选出的阳性重组子正确，见图1。3、表达载体pPIC9K-PNRSV的鉴定表达载体 pPIC9K-PNRSV的构建策略如图2.对表达载体pPIC9K_PNRSV分别用PCR及SnaB I/Not I双酶切鉴定及PCR扩增，结果表明PNRSV CP基因已经克隆于表达载体PPIC9K上，如图3 :对表达载体进行序列分析，结果发现CP插入方向及位置完全正确，可以进行下一步诱导表达。4、PNRSV CP基因的诱导表达及表达蛋白的SDS-PAGE分析
带有表达载体的GSl 15在28°C条件下，在BMMY培养基(I %酵母提取物，2%蛋白腺，IOOmM 憐酸钟，pH 6. O,1. 34%酵母氣喊(yeast nitrogen base, YNB), O. 00004 生物素，I %甲醇)连续培养96小时后，取培养基上清经SDS-PAGE电泳分析，发现在泳道中有一条非常明显的蛋白带，大小约为25Ku，而在阴性对照中几乎看不到任何蛋白带，如图4，经测定其蛋白表达量约为50-60 μ g/ml上清。5、表达蛋白的鉴定经Western-blotting分析发现表达蛋白带能够与PNRSV兔抗血清发生特异性的免疫反应，如图5，说明PNRSV CP基因在酵母中得到了正确表达。6、表达产物的纯化大量诱导的菌液经SDS-PAGE电泳染色后，切下25ku的表达蛋白条带作为直接免疫源，见图6。7、抗血清的制备和效价及特异性测定将切下得到的CP蛋白免疫大白兔，获得了 PNRSV特异性抗血清。经过ELISA测定其抗血清效价为3. 2 X 104，正在制备酶联免疫检测试剂盒，并在实际检测工作中加以检验。根据目前市场价格，制备出的40mL抗血清经济价值超过一亿元，可检测样品1000多万份，经ELISA检测验证，该抗血清均与PVX、PVY、TMV及健康的桃树、李树和樱桃叶片等李树植物没有血清学反应。根据目前市场价格，制备出的40mL抗血清经济价值超过一亿元，可检测样品1000多万份。本发明李坏死环斑病毒(PNRSV)ELISA检测试剂盒，1、试剂盒内容包括I). PNRSV抗体；2).酶标抗体碱性磷酸酯酶标记；3).底物对硝基苯磷酸钠(pNPP) ；4) · PNRSV 阳性对照；5) · PNRSV 阴性对照。本发明试剂盒的用途及检测数主要检测李属植株中的PNRSV，用于100个酶联板孔的检测。2、采用本发明试剂盒的检测方法I).样品制备将待测样品和健康对照样品按1: 10 (重量体积)加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min离心10分钟，上清即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理；2).加样加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，IOOyL/孔，加盖，4°C冰箱孵育过夜，然后用PBST洗涤3次，每次3分钟；3).加抗体用酶标抗体缓冲液将PNRSV抗体按工作浓度稀释，加入酶联板的孔中，100 μ L/孔，加盖，37°C孵育2小时，清空孔中溶液，PBST洗涤3次，每次3分钟；4).加酶标抗体用酶标抗体缓冲液将抗体按要求倍数稀释，加至酶联板中，100 μ L/孔，加盖，37°C孵育4小时，然后用PBST洗涤3次，每次3分钟；5).加底物将底物P NPP加入到底物缓冲液中使终浓度为lmg/mL (现配现用)，按100 μ L/孔，加入到酶联板中，室温孵育；6).读数在不同的时间内如30分钟、I小时内，用酶联仪在405nm处读OD值。3.数据处理及结果判断 I).对照孔的OD4tl5值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)，应该在质量控制范围内。即缓冲液孔和阴性对照孔的OD4tl5值< O. 15。当阴性对照孔的OD4tl5值< O. 05时，按O. 05计算；阳性对照OD4tl5值/阴性对照OD4tl5值> 5-10 ;孔的重复性基本一致。
2).在满足了上述质量要求后，结果原则上可判断如下样品OD4tl5值/阴性对照OD405值明显> 2，判为阳性；样品OD4tl5值/阴性对照OD4tl5值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证；样品OD4tl5值/阴性对照OD4tl5值明显< 2，判为阴性；若满足不了上述质量要求，则不能进行结果判断。4.缓冲液的配制I).包被缓冲液(pH9. 6) =Na2CO3L 59g ；NaHC032. 93g ；NaN30. 2g ;溶于蒸馏水，调 pH值至9. 6，蒸馏水定容至1000mL，4°C储存。2). PBST缓冲液(洗涤缓冲液)在IOOOmL蒸馏水中加入8. Og NaCl,1. 15g Na2HPO4,0. 2g KH2PO4,0. 2g KCl，0.5mL Tween-20，调 pH 值至7. 4。3).酶标抗体缓冲液向IOOOmLPBST加入2. Og BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉，20. OgPVP (MW24, 000-40，000)，O. 2g NaN3,调 pH 值至 7. 4，4°C储存。4).底物缓冲液在800mL 蒸 馏水中加入0.1g MgCl2 ；0. 2g NaN3 ；97mL 二乙醇胺；用 HCl 调 pH 值至9. 8，蒸馏水定溶至1000mL，4°C储存。
权利要求
1.一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于包括以下步骤 A、从PNRSV感病材料中提取李坏死环斑病毒的RNA； B、采用RT-PCR扩增的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白基因；将得到的壳蛋白基因连接到PGEM-T载体上，得到pGEM-T-PNRSV重组载体，并以序列分析确定该病毒外壳蛋白基因的序列正确性； C、构建PNRSV外壳蛋白基因真核表达载体； D、转化毕赤酵母GS115菌株,诱导毕赤酵母表达外壳蛋白； E、用Western-blot检测表达蛋白大小的正确性。
2.根据权利要求1所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤A中提取李坏死环斑病毒的RNA具体包括以下步骤 (1)取PNRSV感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成<IOOmg小份至预冷E. P管，取IOOmg样品加入ImlTriZOL抽提；(2)12000rpm，2-8°C 离心 IOmin ； (3)吸取上清液，转移至新的1.5mlE. P管中，15-30°C放置5min ； (4)加0. 2ml 氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5)I^OOOrpmJ-ST^ 离心 15min ； (6)吸取上清液，转移至新的1.5mlE. P.管中，加0. 5ml异丙醇，15_30°C放置IOmin ；(7)I^OOOrpmJ-ST^ 离心 IOmin ； (8)弃去上清液，得胶体状RNAJP1-1.5ml75%乙醇，涡旋混匀 (9)7500rpm、2-8°C离心5min，弃去上清液，留下胶体状RNA ；(10)干燥5-10min ； (11)溶于Rnase.free水中，枪头打勻，55_60°C温浴IOmin ； (12)5%Agarose胶检测，测定浓度并调至2_3ii g/y L，_70°C储存备用。
3.根据权利要求1所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤B具体方法包括 a、RT-PCR扩增目的基因 (1)引物 上游引物PNRSV-F 5 ' -GTGGATCCTACGTAATGGTTTGCCGAATTTG-3 '，其中 GGATCC 为BamHI酶切位点，TAC GTA为SnaB I酶切位点； 下游引物PNRSV-R :5' -GGAAGCTTGCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3 ',其中 AAGCTT 为Hind III酶切位点，GCGGCCGC为Not I酶切位点； 在引物两端即5’及3’分别加上了 SnaB I及Not I酶切位点引物； (2)扩增体系模板RNAI H L·5umol/L上游引物I UL ·5y mol/L下游弓I物I PL 扩增酶混合液I P L ·2X buffer12.5叫 RNase-free ddH20至总体积 25 y L (3)扩增过程·50 0C 30min，94 °C 3min，94 °C lmin，60 °C 30s, 72 °C lmin，72 °C 10min，4 °C ;其中·94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循环 35 次； b、基因克隆及序列测序 (1)PNRSVCP产物的回收 取扩增产物在I % TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收； (2)重组质粒的构建 采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒，具体步骤为电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4 ii L回收产物，I u LpGEM-T载体，5 u L连接液，补充ddH20至总体积IOii L ;16°C下反应过夜； (3)感受态细胞制备 于LB培养基平板上活化DH5 a菌株，并挑取单菌落接种子5mlLB液体培养基中，37°C下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5ml菌液，于100ml LB液体培养基，37°C摇动培养·2 2. 5hr,至0D600 = 0. 6 0. 8时,吸取1. 5ml菌液于1. 5ml离心管中，冰浴5min, 4°C下·4000g离心lOmin，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300 u L冰预冷的100mmol/L CaCl2重悬浮菌体,冰浴30min,4°C下4000g离心IOmin,收集沉淀,加入·100 u L冰预冷的100mmol/L CaCl2重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4°C冰箱中放置·12 24hr备用；或加入70 ii L冰预冷的IOOmmo I/L CaCl2和30 u L50%甘油于_70°C保存备用； (4)重组质粒的转化及筛选 从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10 ii L连接产物于100 ii L感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42°C水浴中热激90sec，迅速将离心管冰浴3 5min。每管中加入800 u LLB液体培养基(不含抗生素)，37°C下摇动培养90min，以利于细菌的复苏和质粒编码抗性基因的表达； 采用抗生素和a -互补法筛选重组质粒；取100ml LB固体培养基加热融化，待冷却至·60°C以下时，加入IOOii LAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4 y LIPTG，200mg/ml水溶液过滤除菌及40 u LX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200 U I转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37°C下倒置培养16 24hr ；挑取直径约为I 2mm大小的白色菌落于5ml LB液体培养基中，37°C下摇动培养12 ·16hr，标记后取0.7ml与0.3ml 50%的灭菌甘油混匀后，置_80°C下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定； (5)重组质粒的抽提 经抗生素及a -互补法筛选得到的待检菌落培养物于4°C冰箱内预冷5 lOmin，采用碱裂解法抽提质粒DNA ;具体步骤如下离心管标号，取含重组质粒的菌体液1. 5ml至离心管中，4°C、12000g、离心lmin，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150 u L溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5 lOmin，加入250 y L溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，加入180 ii L溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6 7min，4°C、12000g离心lOmin，上清夜移入干净的离心管中，分别加入1/2体积的氯仿/异戍醇、Tris饱和苯酹,混勻，4°C、12000g离心5min,取上清,氯仿/异戊醇再抽提一次；上清水相移入干净离心管中，加入1/10体积NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，_20°C冰箱中20min或过夜，4°C、12000g离心lOmin，弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上，吸干余液，70%, 100%乙醇各洗一次，室温下风干，加入20 u LTE,-20°C冰箱中备用； (6)重组质粒的鉴定 ①、特异引物PCR鉴定 利用特异引物对待检重组质粒进行PCR扩增，反应体系程序参数同上，PCR产物在1%TBE琼脂糖凝胶上电泳鉴定，凡含有目的扩增片段的克隆，进一步进行酶切鉴定； ②、重组质粒酶切鉴定 经PCR鉴定阳性的重组质粒，以下列体系进行双酶切10XHBufferl. 5 u L,BamHlO. 5 u L, HindIIIO. 5 y L，待检质粒 4 y L，加 ddH20 至总体积 15 y L，37°C下反应过夜，取10 ii L反应液电泳检测酶切结果； ③、重组质粒序列测定 经上述PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体，抽提并纯化质粒后，利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定。
4.根据权利要求1所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤C的具体做法 用PCR扩增出PAP基因，然后回收该基因片段后用SnaB I和Not I双酶切，再与用同样双酶切的载体PPIC9K相连接构建成表达载体pPIC9K-P，将pPIC9K-P转化大肠杆菌JM109后经筛选培养基筛选，碱法提取其重组质粒，然后用酶切及PCR进行鉴定；用PCR和质粒酶切鉴定方法筛选出的阳性重组子后，再进行DNA测序，以验证阅读框的正确性。
5.根据权利要求1所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤D的具体做法 序列分析验证后，再用酶BglII将表达载体pPIC9K-P线性化，然后通过电转移方法将其导入酵母GS115菌株的感受态细胞； (1)制备酵母感受态细胞 酵母菌株 P. pastoris GS 115 于 500ml YPD 中 30°C培养至 A 600 =1. 5，1500g 离心收集菌体，先后用500ml、250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清夜，用20ml预冷的Imol/L山梨醇悬浮菌体,离心后菌体再用0. 5ml预冷的山梨醇悬浮后备用； (2)制备转化DNA:质粒DNA的提取采用碱裂解法，然后将提取的DNA用Bgl II酶切，使之分成二个片段，其中之一是含有酵母表达盒的DNA区段，将其用低熔点琼脂糖电泳后回收； (3)酵母细胞的转化 取上述步骤制备的I 5μ gDNA加到40 μ I山梨醇悬浮的酵母细胞中，冰浴5min，然后用电击仪电击，参数为0. 8kV、11.5yF;电击结束后立即加入O. 5ml预冷的lmol/L山梨醇，取200 μ I于固体RDB转化培养基为RDB : 18. 6 %山梨醇、2 %葡萄糖、1. 34% ΥΝΒ、·0.00004%生物素、各O. 005%谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、2%琼脂糖，上涂板，30°C培养直至转化子出现；用牙签挑取转化子对应点种到丽1. 34% YNB,O. 00004%生物素、O. 5%甲醇、1. 5%琼脂糖，平板和MD 1. 34% YNB,O. 00004%生物素、2 %葡萄糖、·1.5%琼脂糖上，30°C培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子即为阳性克隆； (4)PNRSV CP基因在酵母中的诱导表达 具体操作按Invitrogen公司Pichia Expression Kit程序进行。
6.根据权利要求1所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤E的具体做法 (1)表达蛋白分子量的测定 取Iml酵母发酵液，13000rpm离心15分钟，取上清10 μ I进行SDS-PAGE，电泳后用考马斯亮兰染色； (2)表达蛋白Western-blot检测 SDS-PAGE电泳后将表达蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，然后用PNRSV抗血清作为一抗与硝酸纤维素膜上的蛋白进行免疫反应，之后再用第二抗血清即碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗血清对表达蛋白进行特异性鉴定，以未用甲醇诱导的酵母培养液作为阴性对照。
7.—种抗血清，其特征在于其制备方法包括以下步骤根据预表达结果，选取高效表达的毕赤酵母GSl 15菌株，大量诱导表达，经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，切胶条带用生理盐水适当稀释后，加入等体积福氏不完全佐剂乳化；蛋白液体lmg/mL直接与福氏不完全佐剂进行乳化；免疫大白兔采用肌肉注射结合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分别于第21天、第35天和第49天加强免疫3次；最后一次注射免疫后7天开始少量静脉采血测定效价，根据效价情况分次大量取血；制备的抗血清加入O. 02%的叠氮化钠，_20°C保存。
8.一种试剂盒，其特征在于该试剂盒内包括1).PNRSV 抗体 2).酶标抗体碱性磷酸酯酶标记 3).底物对硝基苯磷酸钠(pNPP) 4)· PNRSV阳性对照 5).PNRSV阴性对照。
全文摘要
本发明公开了李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法及抗血清和试剂盒，该表达方法从PNRSV感病材料中提取李坏死环斑病毒的RNA；采用RT-PCR扩增的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白基因；将得到的壳蛋白基因连接到pGEM-T载体上，得到pGEM-T-PNRSV重组载体，并以序列分析确定该病毒外壳蛋白基因的序列正确性；构建PNRSV外壳蛋白基因真核表达载体；转化毕赤酵母GS115菌株，诱导毕赤酵母表达外壳蛋白；用Western-blot检测表达蛋白大小的正确性。本发明的目的提供一种用毕赤酵母表达李坏死环斑病毒外壳蛋白基因的方法；另一目的是提供一种抗血清；另一目的是提供一种李坏死环斑病毒ELISA检测试剂盒。
文档编号C07K16/10GK103045635SQ20121024585
公开日2013年4月17日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者陈定虎, 刘恭源, 杨雷亮, 王勇, 刘军 申请人:陈定虎