使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列的制作方法

专利名称：使用衍生自ap205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学、免疫学、病毒学和分子生物学领域。
背景技术：
接种提供了抵抗感染性疾病的最有效途径之一，并且在上个世纪对公众健康产生了最重要的益处。早期接种方案使用活的、减毒的或灭活的病原体作为免疫原。公众和官方在安全性方面的关注一直以来促进了对更确定的和更安全的疫苗的探索。
该探索促进了新的研究方向，其中单个抗原被分离或重组表达，并且作为免疫原进行注射。这些研究的例子包括亚单元疫苗的开发和利用。然而，因为分离的蛋白质通常没有足以导致保护性免疫应答的免疫原性，所以这种疫苗常常需要添加佐剂以产生足够抵抗抗原的免疫应答。尽管已知几种强的佐剂，诸如弗氏完全佐剂，但是它们通常是有毒的，并且不能在人类中使用。因此，大量的努力被投入到新佐剂的探索中。
最近，对免疫系统区分自我和外来物的原理的研究已经表明病毒表面上抗原的组织程度和重复性是抗原作为外来物被识别的非常强的信号(Bachmann & Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。在基于病毒样颗粒(VLP)的新疫苗设计中利用了病毒结构的这种特性，该新疫苗联合了病毒结构的免疫原性和非复制疫苗改进的安全性。在这些疫苗中，抗原融合或化学附着(chemical attachment)于病毒样颗粒上，所述化学附着是共价或非共价的。这样，通过连接抗原和病毒样颗粒，病毒结构的免疫原特性被转移给抗原。
各种VLP已经用于附着抗原。例如，WO 00/32227描述了乙型肝炎病毒核心抗原在一些类型疫苗的生产中的用途。
WO 03/056905中公开了一类新的高度可表达的并具有高度免疫原性的VLP，这里将这篇文献整体并入为参考文献。这些VLP由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。该外壳蛋白在细菌中重组表达，并且VLP不含有噬菌体RNA基因组，因此不能复制。
最近鉴定了新RNA噬菌体，AP205(Klovins，J.，等，J Gen.Virol.831523-33(2002).)。AP205 RNA噬菌体(Taxonomy ID154784)是单链、正链RNA(没有DNA阶段)病毒，其属于轻小病毒科(Leviviridae)，轻小病毒属(Levivirus Genus)，未分类的轻小病毒(Unclassified Levivirus)亚组。该亚组的其它成员是RNA噬菌体BO1，fr1，TW19和PP7。两种已描述的轻小病毒亚组包括下列RNA噬菌体fr，JP501，f2，M12，MS2和R17(亚组I)和BZ13，JP34，TH1，GA和KU1(亚组II)。AP205基因组长4267核苷酸(nt)。全长基因组序列登录号AF334111，NC-002700。AP205噬菌体的天然宿主是不动杆菌属种(Acinetobacter Spp.)(Klovins，J.，等，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。AP205噬菌体基因组包含3个大的开放读框(ORFs)，其编码成熟蛋白、外壳蛋白和复制酶蛋白质。此外，在5，末端还存在两个小ORF，位于成熟蛋白基因之前。这些ORFs编码的蛋白质的功能未知。推测这些ORF之一可能编码裂解蛋白质(Klovins，J.，等，J.Gen.ViroL.831523-33(2002))。

发明内容
我们已经发现利用本发明载体，可以在细菌中重组表达AP205外壳蛋白。我们也已经研究出了AP205病毒样颗粒的纯化方法。而且，正如电子显微镜术(EM)和免疫扩散所证明的，本发明方法产生的AP205外壳蛋白自发地形成衣壳，因此在大肠杆菌(E.coli)中，外壳蛋白单独与RNA一起就足以装配衣壳。这排除了两种未知功能ORFs编码的蛋白质的任何作用。本发明令人惊奇的特征是在结构已阐明的其它RNA噬菌体外壳蛋白和AP205外壳蛋白之间不存在序列同源性，但是当在电子显微镜(EM)下观察时，AP205外壳蛋白形成的衣壳和这些RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳具有几乎是不能区分的结构特征。我们已经发现AP205 VLP具高度免疫原性，并且其可以连接有机分子以产生疫苗构建体，从而展示出以重复方式定向的有机分子。针对此展示的有机分子已经诱导了高效价，这表明结合的有机分子可以被抗体分子接近以发生相互作用，并且具有免疫原性。
本发明提供了重组表达的病毒样颗粒(VLP)，其从至少一种大肠杆菌中重组表达的噬菌体AP205外壳蛋白自发装配而成。在相关的方面，本发明提供了能够装配的突变形式的AP205 VLP，其包括在氨基酸5位具有脯氨酸到苏氨酸置换的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO3)。这些VLP，来源于天然来源的AP205 VLP(SEQ ID NO1)或AP205病毒颗粒，可以结合至少一种有机分子以产生有机分子的有序重复阵列。本发明的有机分子包括抗原和抗原决定簇、变应原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及小的有机分子诸如滥用的药物，如烟碱和它们的衍生物。利用本发明提供的抗原-AP205 VLP缀合物或含有这种缀合物的组合物进行动物免疫接种，可以诱导抗所展示的抗原的强免疫应答。因此，本发明的VLP可以用于分子(特别是抗原)的附着和展示。从而，本发明的缀合物、组合物和方法可以用于刺激抗各种展示抗原的免疫应答，因此可用于在动物中使用。
在第一方面，本发明提供了病毒样颗粒，其包含或者备选地或优选地其基本组成为或者备选地或优选地其组成为至少一种选自以下的蛋白质(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ IDNO3中所述氨基酸序列的蛋白质；(c)所述(a)或(b)蛋白质的突变蛋白质。优选地，所述蛋白质是重组蛋白。因此，本发明提供了由至少一种选自以下的蛋白质形成的衣壳(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白质；(c)所述(a)或(b)蛋白质的突变蛋白质。在优选的实施方式中，所述突变蛋白质具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1个氨基酸残基，优选地3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。在另一优选实施方式中，所述突变蛋白质具有SEQ ID NO1中所述或SEQID NO3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置换了SEQ ID NO1或SEQID NO3的至少1个半胱氨酸残基，优选地2个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少1个，优选地2个置换是保守性置换。在另一个优选实施方式中，所述突变蛋白质具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
在第二方面，本发明提供了具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突变蛋白质。做为可替代方案，本发明提供了SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的重组蛋白质的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1个氨基酸残基，优选地3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
在另一方面，本发明提供了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的重组蛋白质的突变蛋白质，其中缺失或置换了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1个半胱氨酸残基，优选地2个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少1个，优选地2个置换是保守性置换。做为可替代方案，本发明提供了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的重组蛋白质的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
在另一方面，本发明提供了用于产生AP205病毒样颗粒的载体，其序列与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的序列至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地99％相同。做为可替代方案，本发明提供了用于产生重组蛋白质的载体，该重组蛋白质包含与选自以下的蛋白质融合的多肽(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白质；和(c)所述(a)或(b)多肽的突变蛋白质。
在另一方面，本发明提供了产生AP205病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(a)提供核酸，该核酸包含与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核苷酸序列至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地100％相同的核苷酸序列，或者提供载体，该载体包含与SEQ IDNO2或SEQ ID NO4的核苷酸序列至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地99％相同的核苷酸序列；(b)将所述核酸或载体引入到宿主细胞中；(c)在所述宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的序列，以获得能形成AP205病毒样颗粒的蛋白质或突变蛋白质。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌。
在另一方面，本发明提供了产生AP205病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(a)提供编码至少一种选自以下的蛋白质的核酸或载体(i)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白质；(ii)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白质；(iii)所述(i)或(ii)蛋白质的突变蛋白质；(b)将所述核酸或所述载体引入到宿主细胞中；(c)在所述宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的序列，以获得能形成AP205病毒样颗粒的所述蛋白质或所述突变蛋白质。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌。上面已经指出了(i)和(ii)下所述的蛋白质和突变蛋白质的优选实施方式。
在第一实施方式中，本发明提供了包含一种或多种RNA噬菌体AP205重组VLP或其突变体的组合物。在另一实施方式中，本发明提供了包含一种或多种AP205 VLP和一种或多种有机分子的组合物，其中所述分子附着、连接、偶联或融合，即，结合于AP205 VLP上。在另一个实施方式中，有机分子是抗原。
在一些其它实施方式中，有机分子选自(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的有机分子；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的有机分子；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的有机分子；(d)适于诱导改进的抗自身抗原的应答的有机分子；(e)适于在农畜或宠物中诱导免疫应答的有机分子；和(f)适于诱导抗药物、激素或有毒化合物的应答的有机分子和(g)(a)-(f)中所述任何分子的片段(例如表位或抗原结构域)。
在另一个实施方式中，有机分子是一种或多种抗原。在一个这样的实施方式中，抗原是重组多肽。在另一个实施方式中，从天然来源诸如花粉、蜂、病原体或肿瘤提取抗原。而在另一个实施方式中，抗原选自(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的多肽；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的多肽；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的多肽；(d)适于诱导抗自身抗体的免疫应答的多肽；和(e)适于在农畜或宠物中诱导免疫应答的多肽。
在特别的实施方式中，抗原包含细胞毒性T细胞或辅助T细胞的表位。在相关实施方式中，抗原包含B细胞表位。
在相关方面，本发明提供了用于将有机分子附着，即结合到AP205VLP上的方法。在一些实施方式中，有机分子以定向方式结合到AP205VLP上。
在本发明另一个实施方式中，在免疫动物的方法中使用本发明缀合物或组合物，其中通过皮下、肌内、鼻内、真皮内、静脉内、经皮、经粘膜、口服方式将缀合物或组合物引入到动物体中或者直接引入到淋巴结中。在另一个实施方式中，在想要免疫接种以进行抵抗的肿瘤或局部病毒储库(reservoir)的附近，局部地施用组合物。
本发明也涉及包含免疫学有效量的本发明组合物和药物学可接受稀释剂、载体或赋形剂的疫苗。在进一步实施方式中，该疫苗进一步包含至少一种佐剂，诸如明矾或弗氏不完全佐剂。本发明也提供了免疫和/或治疗动物的方法，该方法包括向动物施用免疫学有效量的本发明缀合物、组合物或疫苗。
AP205 VLP缀合物或组合物可以用于接种以抵抗例如肿瘤、病毒疾病、自身分子或非肽小分子。接种可以用于预防或治疗目的，或者同时用于这两种目的。AP205 VLP缀合物或组合物还可以用于抗变态反应接种，以诱导适于变态反应治疗或预防的抗变应原的免疫偏离和/或抗体应答。
本发明也提供了通过施用包含或可替代地基本组成为与有机分子结合的AP205 VLP的组合物，治疗或预防个体或一群个体中的疾病、身体病症或状况的方法。在相关的方面，抗该组合物产生的免疫分子或抗体，如抗体，可以用于疾病、状况或病症的治疗、预防或诊断。
在本发明另一个方面，以试剂盒形式提供包含与有机分子结合的AP205 VLP的组合物。在本发明另一方面，还以试剂盒形式提供了包含免疫分子或抗体的组合物，其中所述的免疫分子和抗体是利用结合有机分子的AP205 VLP分离的。这种试剂盒可以用于各种目的，包括但不限于检测与VLP上呈递的有机分子反应的免疫分子或抗体，检测有机分子，筛选免疫分子或抗体；和/或诊断通过免疫分子或抗体的存在或不存在表征的状况。在一些相关实施方式中，本发明试剂盒可以包含一种或多种额外的成分诸如缓冲液、载体、赋形剂、佐剂和检测试剂等。
在另一方面，本发明也提供了用于表达RNA噬菌体AP205的外壳蛋白从而形成病毒样颗粒的载体和宿主细胞。宿主细胞包括原核生物，包括大肠杆菌；和真核生物，包括酵母、动物、细胞系等。
在另一方面，本发明提供了表达RNA噬菌体AP205及其病毒样颗粒的外壳蛋白的方法。在另一方面，本发明提供了纯化和分离噬菌体AP205病毒样颗粒的方法。
根据本领域的现有技术、下面附图和本发明说明书及权利要求书，本发明的其它实施方式对本领域普通技术人员显而易见。


图1A-B显示了AP205病毒样颗粒和AP205噬菌体颗粒相比较的电子显微照片，其中所述AP205病毒样颗粒自大肠杆菌表达并纯化的重组蛋白质自发装配而成。图1A显示AP205噬菌体颗粒的电子显微照片，而图1B所示是重组AP205 VLP的自装配颗粒的电子显微照片。
图2显示AP205 VLP和Qβ VLP与Derp1.2肽的偶联反应的SDS-PAGE分析。在16％Tris-甘氨酸凝胶上，在还原条件下电泳样品。泳道1是蛋白质标记物，具有凝胶左侧边缘标明的相应分子量；泳道2，衍生的Qβ衣壳蛋白；泳道3，Qβ衣壳蛋白和Derp1.2肽的偶联反应的上清液；泳道4，Qβ衣壳蛋白和Derp1.2肽的偶联反应的沉淀；泳道5，衍生的AP205 VLP；泳道6AP205 VLP和Derp1.2肽的偶联反应的上清液；泳道7，AP205 VLP和Derp1.2肽的偶联反应的沉淀。在图中，箭头标示对应于每个单体与1，2，3，4或5个肽偶联的偶联产物。与Qβ衣壳蛋白比较，更大数量的表位可以与AP205 VLP偶联。
图3显示在免疫小鼠血清中“Derp1.2”特异的IgG抗体的ELISA分析，其中该小鼠用分别与AP205 VLP或Qβ衣壳蛋白偶联的Derp1.2肽免疫。测定了总IgG效价和IgG亚型效价。针对每种IgG亚型分析了免疫前血清，在所有分析的免疫前血清中均未能检测到Derp1.2特异的抗体。该图显示对于AP205和Qβ，诱导了Th1免疫应答典型的抗体亚型，因为IgG2a效价比IgG1效价高得多。用偶联VLP的肽获得了强的特异性抗肽免疫应答。通过ELISA也测定了对载体特异的抗体，并且对两种载体，这些是相当的。
图4A-4C显示所用不同真核生物表达载体的部分序列。仅示出了修饰的序列。图4ApCep-Xa-Fc*显示了从BamHI位点起的序列，在翻译序列(SEQ ID NO103和SEQ ID NO104)上方显示了不同特征。箭头指示因子Xa蛋白酶的切割位点。图4BpCep-EK-Fc*显示了从BamHI位点起的序列，在翻译序列(SEQ ID NO105和SEQ ID NO106)上方显示了不同特征。箭头指示肠激酶的切割位点。HindIII位点下游序列与图4A中所示序列相同。图4CpCep-SP-EK-Fc*显示从信号肽起始的序列，翻译序列(SEQ ID NO107和SEQ ID NO108)上方显示了不同特征。用粗体表示信号肽酶切割的信号肽序列。箭头指示肠激酶切割位点。HindIII位点下游序列与图4A中所述序列相同。
图5A-B显示rMIF构建体，和表示rMIF构建体的表达和纯化的SDS-PAGE，该构建体用于与AP205 VLP偶联。图5A显示MIF构建体的示意图，该构建体具有添加的包含半胱氨酸残基的氨基酸接头。图5B显示在还原条件下电泳并且用考马斯亮蓝染色的纯化MIF构建体的SDS-PAGE分析。图5A中，凝胶上的加样是纯化的大鼠构建体rMIF-C1(SEQ ID NO114)，rMIF-C2(SEQ ID NO115)和rMIF-C3(SEQ ID NO117)。
图6显示rMIF-C1与AP205 VLP偶联反应的结果。泳道1分子标记物。泳道2AP205 VLP。泳道3衍生的AP205 VLP。泳道4经透析的衍生的AP205 VLP。泳道5经透析的衍生的AP205 VLP。泳道6rMIF-C1与AP205 VLP的偶联反应。在图中用箭头标明了偶联产物。在凝胶左侧边缘标出了标记物蛋白质的分子量。
图7显示在用偶联AP205 VLP的rMIF-C1免疫的小鼠的血清中，对rMIF-C1特异的IgG免疫应答的ELISA分析。
图8显示在0和14天免疫的3只小鼠(1-3)的血清中Angio I肽特异的IgG抗体的ELISA分析，其中小鼠用与AP205 VLP偶联的Angio I肽免疫。在第21天血清中测定总IgG效价。
发明详述定义下面的定义是对相关领域普通技术人员通常理解的概念的总结，提供这些定义旨在用于理解下面的公开，但是不意味着其限制本公开。
氨基酸接头如这里所使用的，本说明书中“氨基酸接头”，或也称为“接头”在于连接第二附着位点与抗原或抗原决定簇，或者更优选地，其已经包含或含有第二附着位点，通常，但不是必需地，该位点为一个氨基酸残基，优选地为半胱氨酸残基。然而，即使由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明优选的实施方式，但是这里使用的术语“氨基酸接头”并没有意指这种氨基酸接头专门地由氨基酸残基组成。氨基酸接头的氨基酸残基优选地由本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸，全L或全D或其混合物组成。然而，包含具有巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头也包括在本发明中。这种分子优选地包含C1-C6烷基-、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基组成部分。然而，除了氨基酸接头外，优选地包含C1-C6烷基-、环烷基-(C5，C6)、芳基或杂芳基组成部分并且无任何氨基酸的接头也包括在本发明范围内。抗原或抗原决定簇或可选地第二附着位点和氨基酸接头之间的连接优选地通过至少一个共价键，更优选地通过至少一个肽键进行。
动物这里使用的术语“动物”意在包括例如人类、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳动物、猴子、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蛛形纲动物。
抗体这里所用术语“抗体”指能结合表位或抗原决定簇的分子。该术语意在包括整个抗体和其抗原结合片段，包括单链抗体。这些抗体包括人抗原结合抗体片段，并且包括，但不限于Fab，Fab′和F(ab′)2，Fd，单链Fvs(scFv)，单链抗体，二硫键连接的Fvs(sdFV)及含有VL或VH结构域的片段。抗体可以来源于任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体来自哺乳动物，例如人类、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马等等或者其它适合的动物例如鸡。这里所用术语“人”抗体包括具有人类免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并包括从人类免疫球蛋白文库分离的抗体或者从具有一种或多种人类免疫球蛋白基因并且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，例如，参见美国专利号5,939,598中所述，这里整体将该文献并入为参考文献。
抗原这里所用术语“抗原”指能被抗体结合或者在被MHC分子呈递后能被T细胞受体(TCR)结合的分子。这里所用术语“抗原”也包括T-细胞表位。在MHC I类(存在于除了红细胞以外的所用身体细胞上)背景中，或者MHC II类(存在于免疫细胞上，并且特别是抗原呈递细胞上)背景中，T细胞受体识别T-细胞表位。该识别事件引起了T细胞和随后效应机制的激活，诸如T细胞增殖、细胞因子分泌、穿孔素分泌等。抗原还能被免疫系统识别和/或能诱导引起B-和/或T-淋巴细胞激活的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，这可能要求，至少在一些情况下，抗原含有或连接TH细胞表位，并且以在佐剂中的形式给出。抗原可以有一种或多种表位(B-和T-表位)。上述特异性反应意思是指抗原典型地以高度选择性方式优先地与其相应抗体或TCR反应，并且不与可能由其它抗原激发的大量其它抗体或TCR反应。这里所用抗原也可以是几种单独抗原的混合物。这里所用抗原包括但不限于变应原、自身抗原、半抗原、癌抗原和感染性疾病抗原及有机小分子诸如滥用的药物(象烟碱)及其片段和衍生物。而且，用于本发明的抗原可以是肽、蛋白质、结构域、碳水化合物、生物碱、脂质或小分子诸如，类固醇激素和其片段和衍生物。
抗原决定簇这里所用术语“抗原决定簇”意指B或T淋巴细胞特异地识别的抗原部分。B-淋巴细胞通过抗体产生对外源抗原决定簇应答，而T淋巴细胞是细胞免疫的介导者。因此，抗原决定簇或表位是被抗体识别的或者在MHC背景中被T细胞受体识别的那些抗原部分。抗原决定簇含有一个或多个表位。在脊椎动物中，变应原也起到抗原作用。
变应原这里所用术语“变应原”指与变态反应有关的抗原。变态反应以释放炎性因子，特别是组胺，及在个体中导致病理学炎症为特征。变态反应通常也与抗变应原的IgE抗体有关。这里所用术语“变应原”也包括“变应原提取物”和“变应原性表位”。变应原的例子包括但不限于花粉(例如，草、豚草、桦树和雪松(mountain cedar))；屋尘螨和尘螨；哺乳动物表皮变应原和动物毛发皮屑；霉菌和真菌；昆虫身体和昆虫毒液；羽毛；食物；和药物(例如，青霉素)。
AP205病毒样颗粒或AP205 VLP这里所用术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205 VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地并优选地组成为至少一种噬菌体AP205蛋白质或外壳蛋白质，或其片段或突变蛋白质，其中所述至少一种外壳蛋白或其片段或突变蛋白质典型地并优选地能装配形成病毒样颗粒。在可替代和优选的实施方式中，这里所用术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205 VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少一种噬菌体AP205蛋白质或外壳蛋白或其突变蛋白质，其中所述至少一种噬菌体AP205外壳蛋白或所述其突变蛋白质能装配形成病毒样颗粒。在本发明非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少一种具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的噬菌体AP205外壳蛋白，其中典型地且优选地，所述至少一种外壳蛋白能装配成病毒样颗粒或衣壳。在本发明另一可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205 VLP”指组合物，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地且优选地组成为至少一种具有SEQ IDNO3中所述氨基酸序列的噬菌体AP205外壳蛋白的突变蛋白质，其中所述至少一种所述外壳蛋白的突变蛋白质能装配成病毒样颗粒。在本发明另一可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地且优选地组成为至少一种具有SEQ ID NO1中或SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的噬菌体AP205外壳蛋白的突变蛋白质，其中所述至少一种所述蛋白质的突变蛋白质能装配成病毒样颗粒。在本发明另一可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205 VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少一种具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了至少1个氨基酸残基，优选地3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所述至少一个置换是保守性置换。在本发明再一可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205 VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少一种具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突变蛋白质，其中缺失或置换了至少1个半胱氨酸残基、优选地3个半胱氨酸残基、更优选地2个半胱氨酸残基，甚至更优选地1个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少一个置换是保守性置换。在本发明另一个可替代的非常优选的实施方式中，术语“AP205病毒样颗粒”或“AP205 VLP”指组合物或病毒样颗粒，其包含，或可替代地基本组成为，或可替代地和优选地组成为至少一种具有SEQ ID NO1中所述或SEQ IDNO3中所述氨基酸序列的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少一个置换是保守性置换。随着本说明书的描述，AP205 VLP的其它优选的实施方式将显而易见。组成AP205 VLP的AP205亚单位每一个均可以通过二硫键与颗粒中的其它亚单位连接，或者做为替代方案，大多数AP205 VLP亚单位通过二硫键与颗粒中的其它AP205 VLP亚单位连接。在一些实施方式中，少数或没有一个AP205 VLP亚单位通过二硫键与颗粒中其它AP205 VLP亚单位连接。
缔合(association)这里所用术语“缔合”当用于第一和第二附着位点时，指第一和第二附着位点的结合，优选地通过至少一个非肽键结合。缔合的性质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的或它们的任何组合，优选地缔合的性质是共价的。
第一附着位点这里所用短语“第一附着位点”指非天然或天然来源的元件，位于抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可以与其缔合。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物，次生代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它们的联合或者它们的化学反应基团。通常地和优选地，第一附着位点位于核心颗粒诸如，优选地病毒样颗粒的表面上。多个第一附着位点通常以重复构型存在于核心或病毒样颗粒的表面上。
第二附着位点这里所用短语“第二附着位点”指与抗原或抗原决定簇连接的元件，位于核心颗粒或病毒样颗粒表面上的第一附着位点可以与其缔合。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次生代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟化合物)，或它们的联合或者它们的化学反应基团。至少一个第二附着位点存在于抗原或抗原决定簇上。因此，术语“具有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”指包含至少该抗原或抗原决定簇和该第二附着位点的抗原或抗原性构建体。然而，特别是对于非天然来源，即，不天然出现在抗原或抗原决定簇中的第二附着位点，这些抗原或抗原性构建体包含“氨基酸接头”。
结合这里所用术语“结合”指可以是例如通过化学偶联的共价的结合或附着，或者可以是通过例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等的非共价的结合或附着。共价键可以是例如酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、二酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等等。术语“结合”更广义，并且包括术语诸如“偶联”、“融合”和“附着”。
外壳蛋白这里所用术语“外壳蛋白”指能在噬菌体或RNA噬菌体衣壳装配中掺入的噬菌体或RNA噬菌体蛋白质。外壳蛋白也称为CP。在本发明中，该术语更常指RNA噬菌体AP205的外壳蛋白。
核心颗粒这里所用术语“核心颗粒”指具有固有重复组织的刚性结构。这里所用核心颗粒可以是合成过程的产物或者是生物学过程的产物。
疾病(disease)、病症(disorder)，状况(condition)这里所用术语“疾病”或“病症”指个体的任何不利状态，包括肿瘤、癌症、变态反应、成瘾、自身免疫性、中毒或最佳的精神或身体功能的受损。这里所用“状况”包括疾病和病症，但是也指生理状态。例如，生育力是生理状态而不是疾病或病症。因此，将适于通过降低生育力预防怀孕的本发明组合物描述为对状况(生育力)的治疗，而不是对病症或疾病的治疗。本领域技术人员明了其它的状况。
表位这里所用术语“表位”指由单个抗体或T细胞受体识别的基本元件或最小单位，因此也指抗体或T细胞受体结合的特定结构域、区域或分子结构。抗原可以由大量表位组成，而半抗原通常具有很少的表位。
免疫应答这里所用术语“免疫应答”指个体免疫系统针对分子或化合物(诸如抗原)的任何行动。在哺乳动物中，免疫应答包括细胞的活动和可溶分子诸如细胞因子和抗体的产生。因此，该术语包括体液免疫应答和/或引起B和/或T-淋巴细胞激活或增殖的细胞免疫应答。然而，在一些情况下，免疫应答可能具有低的强度，只有当使用至少一种本发明物质时才可检测。“免疫原性的”指用于刺激活生物体的免疫系统的试剂，这种刺激使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且定向于该免疫原性剂。“免疫原性多肽”是在佐剂存在或不存在的情况下，单独地或是与载体连接时能激发细胞和/或体液免疫应答的多肽。
“免疫偏离”这里所用术语免疫偏离指刺激与预先存在的免疫应答具有不同性质的免疫应答。例如，可以通过本发明实施方式，诱导具有对抗变应原的TH2免疫应答(这样一旦暴露于变应原将产生IgE抗体)的个体，产生抗变应原的TH1免疫应答。这种TH1应答将抵消诱导变态反应的TH2应答，由此缓解变应性疾病。
免疫治疗这里所用术语“免疫治疗”指用于疾病、病症或状况治疗的组合物。更具体地，该术语用于指通过接种引起有益的免疫应答的治疗方法。
免疫有效量这里所用术语“免疫有效量”指当引入个体中时足以在个体中诱导免疫应答的组合物的量。达到免疫有效所必需的组合物的量根据许多因素而变化，这些因素包括组合物，组合物中其它成分的存在(例如，佐剂)，抗原，免疫途径，个体，以前的免疫或生理状态等。
个体这里所用术语“个体”指多细胞生物体，并且包括植物和动物。优选地多细胞生物体是动物，更优选地是脊椎动物，甚至更优选地是哺乳动物，最优选地是人类。
低或不可检测的这里所用短语“低或不可检测的”当用于基因表达水平时指表达水平显著低于最大限度地诱导基因时所观察到的表达水平(例如，至少低5倍)，或者该表达水平通过本文实施例中所用方法不容易检测到。
模拟表位(mimotope)这里所用术语“模拟表位”指诱导对抗原或抗原决定簇的免疫应答的物质。一般地，与特定抗原相关联使用术语模拟表位。例如，激发抗磷脂酶A2(PLA2)抗体产生的肽是与该抗体结合的抗原决定簇的模拟表位。模拟表位可以与诱导的免疫应答所针对的抗原或抗原决定簇有或没有相似的实质结构或共有结构特性。本领域已知并且在本文其它地方也描述了产生和鉴定诱导针对特定抗原或抗原决定簇的免疫应答的模拟表位的方法。
突变蛋白质这里所用术语“突变蛋白质”指有一个或多个氨基酸不同于给定的参照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白质或多肽，其中这种差异由至少一个氨基酸的添加、置换或缺失或它们的联合引起。优选的实施方式包括由至少一个氨基酸置换引起的突变，优选地由至少一个氨基酸的保守性置换引起的突变。保守性置换包括同构置换(isostericsubstitution)，在该置换中维持氨基酸的电荷、极性、芳香族、脂肪族或疏水性质。例如，用丝氨酸残基置换半胱氨酸残基是保守性置换。在本发明优选的实施方式中，术语“突变蛋白质”指有3个，优选地2个，最优选地1个氨基酸不同于给定参照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白质或多肽，其中这种差异由添加、置换或缺失或它们的联合引起。在本发明其它优选的实施方式中，术语“突变蛋白质”指有3个，优选地2个，最优选地1个氨基酸不同于给定参照(例如，天然、野生型等)多肽的蛋白质或多肽，其中这种差异来源于3个，优选地2个，最优选地1个氨基酸的置换，优选地来源于3个，优选地2个，最优选地1个氨基酸的保守性置换。
天然来源这里所用术语“天然来源”意指物质的整体或其部分不是合成的，而是在自然界中存在或产生的。优选地，这里所用术语“天然来源”意指就整体而言不是合成的，而是在自然界中存在和产生的。
非天然的一般地，这里用该术语指非来源于自然界，更具体地，该术语指来源于人工。
非天然来源的这里所用术语“非天然来源的”一般指合成的，或非来源于自然界的；更具体地指来源于人工的。
有序和重复的抗原或抗原决定簇阵列这里所用术语“有序重复的抗原或抗原决定簇阵列”一般地指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇相对于核心颗粒或病毒样颗粒的一种典型地且优选地一致的空间排列。在本发明一个实施方式中，重复模式可以是几何学模式。适宜的有序重复抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选例子是具有严格重复的抗原或抗原决定簇次晶晶序的阵列，优选地具有1到30纳米晶面间距(spacing)，优选地5到15纳米晶面间距。
有机分子如这里所用术语“有机分子”或本发明提到的“有机分子”优选地包括抗原和抗原决定簇、变应原、自身抗原、半抗原、癌症抗原和感染性疾病抗原及有机小分子诸如滥用的药物(如烟碱)及它们的片段和衍生物。
多肽这里所用术语“多肽”指由氨基酸残基，一般地天然氨基酸残基，通过肽键连接在一起形成的聚合物。多肽不必限定大小，并且包括蛋白质和肽。肽是大小为通常约5到约50个氨基酸或者该通常范围内的任何数量氨基酸的多肽。然而，肽也可以具有更长的长度，例如达到120-150个氨基酸。
蛋白质这里所用术语蛋白质指通常具有大于约5个或更多个，10个或20个以上或更多个，25个或更多个，50个或更多个，75个或更多个，100个或更多个，200个或更多个，500个或更多个，1000个或更多个，2000个或更多个氨基酸的多肽。尽管蛋白质不一定有确定的三维结构，但是蛋白质通常具有确定的并常常称为折叠的三维结构，这与常常不具有确定三维结构而是采用大量不同的构象并且称为未折叠的肽和多肽不同。然而，肽也可以具有确定的三维结构。
纯化的如这里所用，当术语“纯化的”用于指分子时，它意指被纯化的分子相对于在该分子的天然环境中或者在产生、发现或合成该分子的环境中与该分子相关的分子，其浓度已经得以增加。天然相关分子包括蛋白质、核酸、脂质和糖，但是一般不包括为维持被纯化分子的完整性或有利于该分子的纯化而添加的水、缓冲液和试剂。例如，即使在寡dT柱层析期间mRNA被水性溶剂稀释，但如果天然相关核酸和其它生物学分子不结合柱子并且与所述mRNA分子分离，那么通过该层析亦纯化了mRNA分子。根据该定义，当相对于杂质考虑时，物质可以是5％或以上，10％或以上，20％或以上，30％或以上，40％或以上，50％或以上，60％或以上，70％或以上，80％或以上，90％或以上，95％或以上，98％或以上，99％或以上或100％纯度。
受体这里所用术语“受体”指能与称为配体的另一分子相互作用的蛋白质、糖蛋白或其片段。该配体可以属于任何类型的生物化学或化学化合物。受体不需要一定是结合膜的蛋白质。可溶蛋白质，象麦芽糖结合蛋白质或视黄醇结合蛋白质也是受体。
残基这里所用术语“残基”意指多肽主链或侧链中的具体氨基酸。
重组宿主细胞这里所用术语“重组宿主细胞”指其中已经引入本发明一种或多种核酸分子的宿主细胞。宿主细胞包括真核生物，包括例如哺乳动物、昆虫、植物、鸟类、酵母；和原核生物例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)等。
RNA噬菌体这里所用术语“RNA噬菌体”指感染细菌的RNA病毒，更具体地指感染细菌的单链正义RNA病毒。
自身抗原这里所用术语“自身抗原”指能被宿主DNA编码的分子或化合物。这种自身抗原包括肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质和其它生物分子。更通常地和优选地，术语“自身抗原”指宿主DNA编码的多肽或蛋白质。通过宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物也定义为自身的。通过翻译后修饰和蛋白酶解加工或通过自身基因产物可变剪接修饰的蛋白质也定义为自身的。通过宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。此外，由2种或几种自身分子联合产生的蛋白质，或者代表自身分子的一部分的蛋白质，和与上述自身分子具有高度同源性(＞95％，优选地＞97％，更优选地＞99％，)的蛋白质也可以考虑是自身的。
载体这里所用术语“载体”指用于向宿主细胞传送遗传材料的工具(例如质粒或病毒)。载体可以由DNA或RNA组成。
病毒样颗粒(VLP)这里所用术语“病毒样颗粒”指类似病毒颗粒的结构。而且，本发明病毒样颗粒由于缺少所有或部分病毒基因组，特别是病毒基因组中的复制和感染元件，所以它是非复制和非感染性的。本发明病毒样颗粒可以含有不同于其基因组的核酸。本发明病毒样颗粒的典型和优选的实施方式是病毒衣壳，诸如病毒，噬菌体或RNA噬菌体的病毒衣壳。这里可交换地使用的术语“病毒衣壳”和“衣壳”指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配物。典型并优选地，病毒蛋白质亚单位装配成病毒衣壳或衣壳，所述衣壳具有固有的重复组织的结构，其中所述结构通常是球形或管状。例如，RNA噬菌体的衣壳具有二十面对称的球形。这里所用术语“衣壳样结构”指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配物，其形态类似上述意义的衣壳，但是偏离典型的对称装配，而是维持了足够程度的有序和重复性。
噬菌体的病毒样颗粒这里所用术语“噬菌体的病毒样颗粒”指类似噬菌体结构的病毒样颗粒，其是非复制和非感染性的，并且缺少至少一种或多种编码噬菌体复制机器的基因，并且典型地也缺少一种或多种编码负责病毒附着或进入到宿主中的蛋白质的基因。然而，该定义也应该包括这样的噬菌体病毒样颗粒，其中前述一种或多种基因仍旧存在但是已失活，因此也导致非复制和非感染性的噬菌体病毒样颗粒。
病毒颗粒这里所用术语“病毒颗粒”指病毒的形态学形式。在一些病毒类型中，它包括蛋白质衣壳环绕的基因组；其它病毒还具有另外的结构(例如，包膜，尾等)。
一个/一种除非另有说明，当在本公开中使用术语“一个/一种”时，它们意指“至少一个/一种”或者“一个/一种或多个/多种”。
如这里所用，当指任何数值时，术语“约”意指所述值±10％的值(例如，“约50℃”包括从45℃到55℃的温度范围，包含45℃和55℃在内；类似地，“约100mM”包括从90mM到110mM的浓度范围，包含90mM和110mM在内)。
概述我们已经公开了利用本发明载体可以在细菌中表达重组的AP205外壳蛋白，并且获得其纯化形式。在细菌中，重组AP205外壳蛋白自发地自装配为AP205病毒样颗粒。本发明提供了适于AP205 VLP表达的宿主细胞和载体，和能装配的AP205外壳蛋白变异体形式。这些表达的VLP、来源于天然来源的AP205 VLP或AP205病毒颗粒可以结合有机分子以产生有序重复的有机分子阵列。本发明的有机分子包括抗原、变应原、自身抗原、半抗原、癌症抗原和感染性疾病抗原。在一个实施方式中，有机分子是多肽或蛋白质。
通过附着、连接、融合或其它结合方式(包括共价和非共价键)可以形成本发明缀合物，即，有机分子与VLP结合。在一个实施方式中，VLP含有第一附着位点，有机分子含有第二附着位点。可以通过直接地或者利用第三分子，典型地且优选地借助于交联剂，连接第一和第二附着位点，从而实现与有机分子间的缔合。附着位点可以天然存在或者可以引入。在优选的实施方式中，该结合包含至少一个共价键，优选地包含肽键或者可替代地和优选地包含非肽键。
用本发明提供的AP205 VLP缀合物或用包含这种缀合物的组合物免疫动物，可以诱导抗所展示的有机分子的强免疫应答。因此，本发明缀合物和组合物可以用于刺激抗各种展示的抗原的免疫应答，因此可以用于动物中使用。本发明也涉及一种疫苗，该疫苗包含免疫有效量的具有本发明一种或多种缀合物的组合物及药物学可接受的稀释剂、载体或赋形剂。AP205 VLP可以用于接种以抵抗例如半抗原、变应原、肿瘤、病毒疾病或自身分子或非肽小分子。接种可以用于预防或治疗目的，或者这两种目的。在相关方面，抗这种组合物产生的免疫分子或抗体，诸如抗体，可以用于疾病、状况或病症的治疗、预防或诊断。本发明的这种抗体和组合物也可以以试剂盒形式使用。
AP205噬菌体外壳蛋白的克隆AP205基因组由成熟蛋白质、外壳蛋白、复制酶及在相关噬菌体中不存在的两个开放读框(一个裂解基因和一个开放读框在成熟基因的翻译中起作用)组成(Klovins，J.，等，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。在本发明的一个方面，利用本领域已知的方法，通过AP205噬菌体RNA的逆转录，之后通过PCR分离外壳蛋白质cDNA。将包含外壳蛋白基因上游的核糖体结合位点的外壳蛋白cDNA克隆到载体pQb10(Kozlovska，T.M.，等，Gene137133-37(1993))中。在另一个方法中，AP205外壳蛋白cDNA可以克隆到载体pQb185中，置换噬菌体Qβ外壳蛋白基因，并由此位于载体中的核糖体结合位点下游。这两种方法都引起了蛋白质的表达和衣壳的形成。因此，在本发明中，可以从含有核糖体结合位点的载体表达外壳蛋白，其中该核糖体结合位点不是AP205核糖体结合位点，而是诸如载体pQb185中的核糖体结合位点。
载体pQb10和pQb185是来源于pGEM载体的载体，在这些载体中trp启动子控制克隆基因的表达(Kozlovska，T.M..等，Gene 137133-37(1993))。pAP283-58(SEQ ID NO.2)在下面序列中包含推定的AP205核糖体结合位点，其位于XbaI位点下游和AP205外壳蛋白ATG起始密码子的紧上游tctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg(SEQ ID NO5)。载体pQb185包含位于XbaI位点下游和起始密码子上游的SD(Shine Delagarno)序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg(SEQ ID NO6)，下划线的是SD序列)，其也存在于载体pAP281-32(SEQ ID No.4)中。本领域已知的其它载体包括，例如pKK223.3，pET载体家族，pBR322(Sutcliffe，J.G.Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.43 Pt 177-90(1979))，pUC18，pUC19，如本领域技术人员所认识到的，如果这些载体不存在启动子和核糖体结合位点或者不适于外壳蛋白的表达和随后病毒样颗粒的形成，则可以对所有这些载体进行修饰以包含适宜的启动子和核糖体结合位点。来源于前述载体的其它载体和适于在大肠杆菌或者本领域技术人员已知的其它宿主中表达蛋白质的其它载体，和一般地适于在大肠杆菌或者其它宿主中表达蛋白质的任何载体均适于实施本发明，条件是它们允许外壳蛋白表达和随后形成病毒样颗粒。在本发明的一个方面，将用于AP205外壳蛋白基因表达的载体转染到大肠杆菌中。适合的大肠杆菌菌株包括，但不限于大肠杆菌K802，JM109，RR1。本领域普通技术人员已知其它大肠杆菌菌株，并且通过SDS-PAGE检测外壳蛋白的表达，及通过可选地首先凝胶过滤纯化衣壳，随后在免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜术(Kozlovska，T.M.，等，Gene 137133-37(1993))中检测衣壳来测试衣壳的形成和装配，可以鉴定载体和菌株的适宜联合。
由于在大肠杆菌胞质中加工，从载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白可以无起始的甲硫氨酸氨基酸。切除了甲硫氨酸的多肽，特别是切除了甲硫氨酸的SEQ ID NO1和SEQ ID NO3的多肽，及产生本发明AP205 VLP的未切割形式的AP205多肽，或者产生本发明AP205VLP的以上多肽的混合物均是本发明实施方式，并且在本发明范围内。
AP205病毒样颗粒在一个实施方式中，本发明提供了形成衣壳的AP205外壳蛋白。这种蛋白质通过重组方式表达或从天然来源制备。能装配为VLP的重组AP205外壳蛋白片段也是本发明的实施方式。通过外壳蛋白的内部或者末端缺失可以产生这些片段。与装配为VLP相容的在外壳蛋白序列中的插入或与外壳蛋白序列的融合也是本发明的实施方式。可以通过电子显微镜术检测外壳蛋白序列的插入、缺失和融合的结果、及其是否与装配为VLP相容。
本发明提供了重组AP205外壳蛋白的纯化方法。利用沉淀分级分离步骤和凝胶过滤纯化步骤的联合，可以以纯化形式分离由AP205外壳蛋白形成的颗粒。分离病毒样颗粒的其它方法是本领域已知的，并且可以用于分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166中描述了超离心用于分离酵母逆转录转座子Ty的VLP的用途，这里将这篇文献整体并入为参考文献。除了凝胶过滤外，也可以使用其它层析步骤诸如离子交换、疏水相互作用或者亲和层析。
重组AP205外壳蛋白的表达引起病毒样颗粒的装配，当通过电子显微镜术分析时，该病毒样颗粒和噬菌体颗粒具有相同外观和大小。可以纯化这些VLP是本发明的发现。因此，本发明提供了新的VLP，该VLP可以以高数量纯化形式获得。
大肠杆菌中自装配的AP205 VLP与AP205噬菌体颗粒具有相同的外观和大小。与针对其它VLP所证明的一样(多瘤病毒VP1 VLP和乳头瘤病毒L1 VLPS，Chackerian B.等，PNAS 962373-2378(1999))，实验条件的操作或表位与VLP的融合可以导致具有不同装配状态的VLP。例如，可以获得比野生型或主要颗粒形式具有低的三角划分数的颗粒。因此，比AP205噬菌体颗粒更小尺寸的AP205 VLP，或者与AP205噬菌体颗粒相比同样尺寸的AP205 VLP和更小尺寸的AP205 VLP的混合物也是本发明的实施方式。
如WO03/024481的实施例17中所述，在非还原性PAGE中分析时比在还原性PAGE中分析时，AP205 VLP亚单位电泳具有更高表观分子量，表明这些亚单位通过二硫键缔合。
在另一个方面，本发明提供了含有适于AP205病毒样颗粒产生的开放读框的载体，所述载体还包含额外的核酸，这样，由此得到的载体能产生包含所述额外核酸编码的氨基酸的重组AP205病毒样颗粒。
在另一方面，本发明提供了含有适于AP205病毒样颗粒产生的开放读框的载体，所述载体还包含适于引入额外核酸的限制酶位点，这样由此得到的载体能产生包含所述额外核酸编码的氨基酸的重组病毒样颗粒。
有机分子，半抗原和抗原本发明方法、缀合物和组合物中使用的有机分子包括任何抗原、半抗原、有机分子或其片段。本发明分子包括本身(即，不结合AP205病毒或病毒样颗粒)在动物中不能诱导免疫应答的半抗原、有机分子和抗原片段。有机分子包括例如(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的有机分子；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的有机分子；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的有机分子；(d)适于诱导抗自身抗原的免疫应答的有机分子；(e)适于诱导抗药物、激素或毒素，特别是滥用的药物的免疫应答的抗原或半抗原；和(f)(a)-(e)中所述任何有机分子、抗原或半抗原的片段(例如，结构域)。
感染性疾病在本发明一个特别实施方式中，有机分子、抗原或抗原决定簇可以用于感染性疾病的预防。这种治疗方法可以用于治疗影响广泛宿主，例如人类、母牛、绵羊、猪、狗、猫、其它哺乳动物物种及非哺乳动物物种的广泛种类的感染性疾病。这种疫苗可以预防地用于防止个体或群体中的传染，或者治疗地用于减轻正在发生的感染。已知存在疫苗的或期望使用疫苗的感染性疾病是本领域技术人员已知的，所述感染性疾病例如包括病毒病因学的感染，诸如HIV，流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；细菌病因学的感染诸如肺炎、结核病、梅毒、Lyme氏疏螺旋体病、霍乱、沙门氏菌病、脑膜炎、脓毒等；或者寄生虫病因学的感染，诸如疟疾、锥虫病、利什曼病、毛滴虫病、阿米巴病等。本发明缀合物、组合物和方法中可以使用的抗原或抗原决定簇是相关领域普通技术人员已知的。抗原或抗原决定簇的例子包括HIV抗原gp140和gp160；流感病毒抗原血凝素，M2蛋白质和神经氨酸酶、乙型肝炎表面抗原和疟疾的环子孢子蛋白。
在本发明一个这种实施方式中，抗原或抗原决定簇选自(a)重组HIV蛋白质，(b)重组流感病毒蛋白质(例如流感病毒M2蛋白质或其片段)，(c)重组丙型肝炎病毒蛋白质，(d)重组弓形体属(Toxoplasma)蛋白质，(e)重组恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)蛋白质，(f)重组间日疟原虫(Plasmodium vivax)蛋白质，(g)重组卵形疟原虫(Plasmodium oval)蛋白质，(h)重组三日疟原虫(Plasmodium Malariae)蛋白质，(i)重组衣原体(Chlamydia)蛋白质和(j)(a)-(i)中所述任何蛋白质的片段。
在另一个实施方式中，本发明涉及疫苗组合物，该疫苗组合物包含至少一种流感病毒核酸编码的抗原或抗原决定簇；并涉及这种疫苗组合物激发免疫应答的用途。在特定的这种实施方式中，流感抗原或抗原决定簇是M2蛋白质(例如，具有GenBank登录号P06821，PIR登录号MFIV62中所示氨基酸的M2蛋白质或其片段(例如，从约2到约24位的氨基酸))。适于本发明使用的引起免疫应答的M2蛋白质部分及其它蛋白质包括长度为任何数量氨基酸的肽，但是一般为至少6个氨基酸长度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或97个氨基酸长度的肽)。
激素、毒素和药物，特别是滥用的药物在另一个方面，本发明提供了适于刺激抗半抗原的免疫应答的组合物。这些半抗原包括，但不限于激素、药物和有毒化合物。抗各种药物、激素和有毒化合物的免疫应答可以用于保护有危险暴露于这种化合物的个体，用于治疗已暴露于这种化合物的个体，或者用于预防或治疗对这种化合物的成瘾性。
代表性的有毒化合物包括但不限于有毒植物、动物和微生物的天然产物。这种产物包括黄曲霉毒素、ciguautera毒素和河豚毒素。人工或作为代谢结果产生的其它代表性有毒化合物包括抗生素(例如，万古霉素)，抗癌化合物(例如，长春花碱)和化学战试剂(例如，沙林，芥子气，VX)。本发明的一个方面包括产生抗体，以抵抗通常所用的药剂的有毒代谢物；由此个体可以继续接受药剂的有益效果，而不出现与有毒代谢物有关的副作用。因此，在优选的实施方式中，毒素是个体身体中产生的代谢物，其中所述代谢物是药剂的代谢物。在进一步优选的实施方式中，毒素是化学战试剂。
适于在治疗药物成瘾，特别是消遣性药物成瘾的缀合物、组合物和方法中使用的有机分子，抗原或抗原决定簇是相关领域普通技术人员已知的。有机分子、抗原或抗原决定簇的代表性例子包括，例如阿片样物质和吗啡衍生物诸如可待因、芬太尼、海洛因、吗啡和鸦片；兴奋剂诸如苯丙胺、可卡因、MDMA(甲烯二氧甲苯丙胺)、甲基苯丙胺，哌醋甲酯和烟碱；致幻剂诸如LSD、三甲氧苯乙胺和叔胺吲哚磷酯；Cannabinoids诸如大麻粉和大麻；其它成瘾性药物或化合物；和这些化合物的衍生物，副产物，变异体和复合物。
变态反应和癌症在相关实施方式中，本发明提供了适于作为免疫疗法用于变态反应或癌症的治疗或预防的组合物。
适于在治疗或预防变态反应的缀合物、组合物和方法中使用的抗原或抗原决定簇将是相关领域普通技术人员已知的。这种抗原或抗原决定簇的代表性例子包括蜂毒磷脂酶A2、Bet v I(桦树花粉变应原)、5 Dol m V(white faced hornet毒液变应原)、Mellitin和Der p I(屋尘螨变应原)、谷蛋白、麦醇溶蛋白、贝类变应原、蟑螂变应原、花生和其它坚果变应原、豚草和其它花粉变应原，银桦属(Grevillea)变应原，及其可以用于激发免疫应答的片段。在本发明特定的实施方式中，变应原选自(a)重组蜂螫刺变态反应蛋白质，(b)重组坚果变态反应蛋白质，(c)重组食物变态反应蛋白质，(d)重组哮喘蛋白质，(e)重组衣原体(Chlamydia)蛋白质和(f)(a)到(e)任何变应原的片段。
如上所述，适于本发明缀合物、组合物或方法中使用的抗原或抗原决定簇是Der p I。Der p I是在屋尘螨粪粒中发现的25kD蛋白酶，并且是屋尘螨的主要变应原。因此，80％螨变应性患者具有抗Der p I IgE抗体。特别地，已知其中Der p I肽p52-72和p117-133(SEQ ID NO64)包含天然Der p I特异性抗体所识别的表位。在针对整个抗原的多克隆应答中产生的IgE抗体以高亲和力结合肽区域59-94(L.Pierson-Mullany等.(2000)Molecular Immunology)。其它区域也以高亲和力结合IgE。肽p117-133在其N末端包含可以作为本发明第二附着位点的半胱氨酸。3D模建将肽p52-72和p117-133分配至整个蛋白质的表面(Jeannin，P.等，MolecularImmunology 301511-1518(1993))。然而，Der p I蛋白质的其它片段也可能包含适用于本发明的B细胞表位。
在本发明组合物的优选实施方式中，抗原或抗原决定簇是Der p I肽，其中具有所述第二附着位点的所述Der p I肽有选自a)CGNQSLDLAEQELVDCASQHGCH(SEQ ID NO97)；和b)CQIYPPNANKIREALAQTHSA(SEQ ID NO64)的氨基酸序列。
在另外实施方式中，本发明提供了适于在预防和/或减弱变应性反应(诸如引起过敏反应的变应性反应)的方法中使用的疫苗组合物。如本文其它地方所公开的，变应性反应的特征在于引起IgE抗体出现的抵抗抗原的TH2应答。TH1免疫应答的刺激和IgG抗体的产生可以缓解变应性疾病。因此，本发明疫苗组合物包括引起如下抗体产生的组合物，该抗体可以预防和/或减弱变应性反应。因此，在一些实施方式中，本发明的疫苗组合物包括激发抗变应原的免疫应答的组合物。这种变应原的例子包括磷脂酶诸如意大利蜜蜂(Apis Mellifera)(GenBank记录号443189，GenBank记录号229378)，大蜜蜂(Apis dorsata)(GenBank记录号B59055)，中华蜜蜂(Apis cerana)(GenBank记录号A59055)，Bombus Pennsylvanicus(GenBank记录号B56338)和钝尾毒蜥(Heloderma Suspectum)(GenBank记录号P80003；GenBank记录号S 14764；GenBank记录号226711)磷脂酶A2(PLA2)蛋白质。
利用意大利蜜(Apis Mellifea)的PLA2蛋白质氨基酸序列(GenBank记录号443189，GenBank记录号229378)做为示例，构成整个PLA2序列中的任何一个部分的长至少约60个氨基酸的肽也可以用在组合物中以预防和/或减弱变应性反应。这种肽的例子包括含有氨基酸1-60，氨基酸1-70，氨基酸10-70，氨基酸20-80，氨基酸30-90，氨基酸40-100，氨基酸47-99，氨基酸50-110，氨基酸60-120，氨基酸70-130或氨基酸90-134的肽，以及其它PLA2蛋白质(例如上述PLA2蛋白质)的相应部分。这种肽的进一步例子包括包含氨基酸1-10，氨基酸5-15，氨基酸10-20，氨基酸20-30，氨基酸30-40，氨基酸40-50，氨基酸50-60，氨基酸60-70，氨基酸70-80，氨基酸80-90，氨基酸90-100，氨基酸100-110，氨基酸110-120或者氨基酸120-130的肽，以及其它PLA2蛋白质(例如上述PLA2蛋白质)的相应部分。
适于本发明使用的引起免疫应答的PLA2部分及其它蛋白质部分可以包含一般地至少6个氨基酸长度的肽(例如，6，7，8，9，10，12，15，18，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100个氨基酸长度的肽)，或者可替代由上述肽组成。
PLA2肽(例如上述全长PLA2蛋白质及每个蛋白的子部分)也可以与允许有序和重复抗原阵列形成的任何物质(例如，AP205衣壳蛋白或其片段)偶联。
对于在治疗癌症的组合物和方法中使用的抗原或抗原决定簇，其选择将是相关领域普通技术人员已知的。在本发明特定的实施方式中，抗原或抗原决定簇选自(a)重组乳腺癌细胞蛋白质；(b)重组肾癌细胞蛋白质；(c)重组前列腺癌细胞蛋白质；(d)重组皮肤癌细胞蛋白质；(e)重组大脑癌细胞蛋白质；(f)重组白血病癌细胞蛋白质；(g)重组profiling；和(h)(a)-(g)中所述任何蛋白质的片段。
这种类型的抗原或抗原决定簇的代表性例子包括Her2(乳腺癌)，GD2(成神经细胞瘤)，EGF-R(恶性成胶质细胞瘤)，CEA(甲状腺髓样癌)，和CD52(白血病)，人黑素瘤蛋白质gp100，人黑素瘤蛋白质melan-A/MART-1，酪氨酸酶，NA17-A nt蛋白质，MAGE-3蛋白质，p53蛋白质和HPV16 E7蛋白质，及可以用于激发免疫应答的这些蛋白质之每一个的片段。可以用于癌症治疗组合物和方法的另外抗原决定簇是参与血管生成的分子和抗原决定簇。血管生成，即新血管的形成，在生理学和病理生理学过程诸如伤口愈合和实体肿瘤生长中起到必需的作用(Folkman，J.(1995)Nat.Medicine 1，27-31；Folkman，J.，和Klagsbum，M.(1987)Science 235，442-446；Martiny-Baron，G.，和Marmé，D.(1995)Curr.Opin.Biotechnol.6，675-680；Risau，W.(1997)Nature 386，671-674)。快速生长的肿瘤起始并依赖于血管的形成以提供所需的血液供应。因此，认为抗血管生成药剂作为抗癌疗法是有效的。
在已经鉴定的几种推定的血管生成因子中，血管内皮生长因子(VEGF)是有效的内皮细胞特异性促细胞分裂剂和许多实体肿瘤血管形成的主要刺激剂。因此，VEGF作用的阻断可以作为干扰肿瘤诱导的血管生成的靶标，成为一种阻断内皮而不是肿瘤的抗肿瘤策略(Millauer，B.等.(1994)Nature367，576-579；KIM，J等.(1993)Nature 362，841-844)。
已经公开了抗VEGFR-II抗体(IMC-1C11)和抗VEGF抗体(Lu，D.等.(2000)J.Biol Chem.275，14321-14330；Presta，L.G，等(1997)Cancer Res.47，4593-4599)。前者，中和性单克隆抗VEGFR-2抗体识别已经鉴定为推定的VEGF/VEGFR-II结合位点的表位(Piossek，C.等.(1999)J Biol Chem.274，5612-5619)。
因此，在本发明一个实施方式中，本发明缀合物、组合物或方法中使用的抗原或抗原决定簇是来源于VEGFR-II接触位点的肽。这提供了具有用于癌症治疗的抗血管生成特性的本发明组合物和疫苗组合物。在小鼠中，利用对VEGFR-2特异的血清，已经证明了对肿瘤生长的抑制作用(Wei，YQ等.(2000)Nature Medicine 6，1160-1165)。因此，适于抗血管生成的本发明组合物和本发明疫苗组合物的其它抗原决定簇包括具有氨基酸序列CTARTELNVGI DFNWEYPSSKHQHKK(SEQ ID NO99)的VEGFR-II衍生肽，和/或具有氨基酸序列CTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKK(SEQ ID NO113)的鼠VEGFR-II衍生肽，和/或VEGFR-II的相关细胞外球状结构域1-3。
自身抗原在特定实施方式中，本发明提供了适于在预防和/或减弱由“自身”基因产物(例如，肿瘤坏死因子)引起或加重的疾病或状况的方法中使用的疫苗组合物。通常通过常规接种诱导对自身分子的抗体应答，即使可能，也是困难的。本发明通过利用抗原与AP205 VLP的结合，增加待用于免疫的抗原的重复程度，提供了一种提高接种效率的方法。
不同于分离的蛋白质，在有和无T细胞辅助，不存在任何佐剂的情况下，病毒均能诱导迅速和有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。尽管病毒常常由少数蛋白质组成，但是它们能比它们的分离的成分引起强得多的免疫应答。对于B细胞应答，已知病毒免疫原性的一个至关重要的因素是表面表位的重复性和次序。许多病毒显示了准晶体表面，该表面展示出一个有规则的表位阵列，该表位阵列可以与B细胞上的表位特异性免疫球蛋白有效交联(Bachmann &Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是强激活信号，其直接诱导细胞周期进程和IgM抗体的产生。而且，这种触发的B细胞能激活T辅助细胞，这接着可以诱导B细胞中IgM产生向IgG抗体产生的转换和长寿记忆B细胞的形成——任何接种的目的(Bachmann & Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。在自身免疫疾病中，甚至可以将病毒结构与抗-抗体的产生联系起来，作为针对病原体的天然应答的一部分(参见，Fehr，T.等，J Exp.Med.1851785-1792(1997))。这样，通过高度有组织的病毒表面呈递的抗体能诱导强的抗-抗体应答。
免疫系统通常不能产生抵抗来源于自身的结构的抗体。对于低浓度存在的可溶抗原而言，这是由Th细胞水平上的耐受性所致。在这些条件下，将自身抗原与可以递送T辅助作用的载体偶联可以破坏耐受性。对于高浓度存在的可溶蛋白质或低浓度的膜相关蛋白质，B和TH细胞可以是耐受性的。然而，B细胞的耐受性可能是可逆的(无变应性)，并且可以通过施用偶联外源载体的高度有组织形式的抗原来破坏(Bachmann &Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol15235-270(1997))。
因此，本发明疫苗组合物包括引起抗体产生的缀合物、组合物和方法，其中该抗体可以预防和/或减弱由“自身”基因产物引起或加重的疾病或状况。这种疾病或状况的例子包括移植物抗宿主病、IgE介导的变应性反应，过敏反应，成人呼吸窘迫综合征，局限性回肠炎、变应性哮喘、急性成淋巴细胞白血病(ALL)，糖尿病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，突眼性甲状腺肿，系统性红斑狼疮(SLE)，炎性自身免疫性疾病，重症肌无力，免疫增生性疾病淋巴结病(IPL)，血管免疫增生性淋巴结病(AIL)，免疫母细胞性淋巴结病(IBL)，类风湿性关节炎，糖尿病，多发性硬化，阿尔茨海默氏病，骨质疏松症，和与一些感染有关的自身免疫状况包括风湿热、猩红热、Lyme氏疏螺旋体病和传染性多关节炎。
对于在治疗与自身抗原相关的其它疾病或状况的缀合物、组合物和方法中使用的抗原或抗原决定簇，其选择也是相关领域普通技术人员已知的。这种抗原或抗原决定簇的代表性例子是，例如淋巴毒素(例如，淋巴毒素α(LTα)，淋巴毒素β(LTβ))，和淋巴毒素受体，核因子κB受体活化因子配体(RANKL)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管内皮生长因子受体(VEGF-R)，白细胞介素-5，白细胞介素-17，白细胞介素-13，CCL21，CXCL12，SDF-1，MCP-1，Endoglin，抵抗素，GHRH，LHRH，TRH，MIF，Eotaxin，缓激肽，BLC，肿瘤坏死因子α和淀粉样β肽(Aβ1-42)，以及其可以用于激发免疫应答的片段。
在一个实施方式中，抗原决定簇是淀粉样β肽(Aβ1-42)(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO7)，或其片段。Aβ肽在阿尔茨海默氏病的神经病理学中具有重要作用。Aβ肽的区域特异性细胞外积累伴随着小神经胶质细胞增生(microgliosis)，细胞骨架改变，营养不良性神经炎和突触损失。据认为这些病理学改变与定义这种疾病的认知下降有关。
在阿尔茨海默氏病小鼠模型中，通过基因工程改造产生Aβ1-42的转基因动物(PDAPP-小鼠)在大脑中出现了斑块和神经元损害。最近的工作表明利用Aβ1-42免疫年青的PDAPP小鼠引起了对斑块形成和相关营养不良性神经炎的抑制作用(Schenk，D.等，Nature 400173-77(1999))。
而且，对已经患有AD样神经病的老年PDAPP小鼠的免疫也降低了神经病理学的程度和进展。在另一个研究中，外周施用抗Aβ1-42产生的抗体能诱导对预先存在的淀粉状蛋白的清除(Bard，F.等，Nature Medicine 6916-19(2000))。该研究利用了抗Aβ1-42的多克隆抗体或抗来源于Aβ不同区域的合成片段的单克隆抗体。因此，利用本发明缀合物，组合物和方法诱导抗Aβ抗体可以被认为是阿尔茨海默氏病的潜在治疗方法。
公认单独施用纯的蛋白质通常不足以引发强的免疫应答；一般地，分离的抗原必须与称为佐剂的辅助物质一起施用。这些佐剂保护施用的抗原免受快速降解，并且佐剂可以实现抗原的低水平长期释放。在本发明中，Aβ肽或其片段通过结合AP205 VLP而获得免疫原性，因此不一定需要佐剂。
如所表明的，阿尔茨海默氏(AD)的一个关键事件是淀粉状蛋白沉积为不溶性纤维块(amyloidogenesis)，引起细胞外神经炎斑和在脑血管壁周围的沉积物(综述参见Selkoe，D.J.(1999)Nature.399，A23-31)。神经炎斑和嗜刚果红血管病的主要组分是淀粉状蛋白β(Aβ)，尽管这些沉积物也含有其它蛋白质诸如糖胺聚糖和载脂蛋白。Aβ从称为淀粉样前体蛋白(APPs)的大得多的糖蛋白蛋白酶解切割产生，该前体蛋白包括具有单一疏水跨膜区域的695-770个氨基酸的同种型。Aβ形成不超过43个氨基酸长度的一组肽，这些肽显示了相当大的氨基和羧基末端异质性(截短)及修饰(Roher，A.E.等，(1988)J.Cell Biol.107，2703-2716.Roher，A.E.等(1993)J.Neurochem.61，1916-1926)。重要的同种型是Aβ1-40和1-42。它具有形成β-片层以聚集为原纤维的高度倾向，这最终导致淀粉状蛋白。最近的研究已经表明接种诱导的大脑淀粉状沉积物的减少引起了认知的改进(Schenk，D.等.(1999)Nature.400，173-177)。因此，适于产生本发明疫苗的Aβ片段包括，但是不限于Aβ1-15，Aβ1-27和Aβ33-42。如本文其它地方所述，可以利用氨基酸接头与Aβ或Aβ片段的氨基酸序列融合以实现和AP205 VLP偶联。适于与Aβ或Aβ片段的N末端融合的氨基酸接头包括但不限于序列CGG和CGHGNKS。适于与Aβ或Aβ片段的C末端融合的接头包括但不限于序列GGC。在一个实施方式中，当接头与Aβ或Aβ片段的C末端融合时，酰胺化C末端半胱氨酸。Aβ片段1-15与氨基酸接头融合，并且具有序列DAEFRHDSGYEVHHQGGC-NH2(SEQ ID NO8)，其中用C末端“NH2”表示酰胺化C末端半胱氨酸。Aβ片段1-27与氨基酸接头融合，并且具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNGGC-NH2(SEQ ID NO9)。Aβ片段33-42与氨基酸接头融合，并且具有序列CGHGNKSGLMVGGVVIA(SEQ ID NO10)。
在本发明一个实施方式中，抗原或抗原决定簇包含，或者优选地是血管紧张肽或其片段。这里所用术语“血管紧张肽”包括含有血管紧张肽原、血管紧张肽I或血管紧张肽II的序列或其任何片段的任何肽。血管紧张肽与高血压有关(Gardiner等，Br.J.Pharm.1291178(2000))。因此，适于降低血管紧张肽水平的本发明缀合物、组合物和方法适于治疗高血压。在一个实施方式中，缀合物或组合物包含至少一种血管紧张肽。一些实施方式中肽的氨基酸序列如下血管紧张肽原DRVYIHPFHLVIHN (SEQ IDNO11)；血管紧张肽IDRVYIHPFHL(SEQ ID NO12)；血管紧张肽IIDRVYIHPF(SEQ ID NO13)。通常地，在血管紧张肽序列的C和/或N末端添加一个或多个额外的氨基酸。这些额外氨基酸对于定向和有序地缔合AP205病毒样颗粒特别有价值。此血管紧张肽序列对应于与鼠源序列相同的人类序列。因此，用包含这种血管紧张肽作为抗原或抗原决定簇的本发明疫苗或组合物免疫人类或小鼠是抗自身抗原的免疫接种。在一些实施方式中，带有所述第二附着位点的血管紧张肽具有选自如下的氨基酸序列a)CGGDRVYIHPF(SEQ ID NO14)氨基酸序列；b)CGGDRVYIHPFHL(SEQ ID NO15)氨基酸序列；c)DRVYIHPFHLGGC(SEQ ID NO16)氨基酸序列；和d)CDRVYIHPFH(SEQ ID NO98)氨基酸序列。
在本发明另一个实施方式中，抗原决定簇是RANKL(NFkB受体活化因子配体)。RANKL也称为TRANCE(TNF-相关的激活诱导细胞因子)，ODF(破骨细胞分化因子)或OPGL(骨保护素(Osteoprotegerin)配体)。在EMBL数据库保藏RANKL人类TrEMBLO14788中显示了人类RANKL细胞外部分的氨基酸序列。分别在EMBL数据库保藏RANKL_小鼠Tr EMBLO35235中和在RANKL_小鼠剪接形式TrEMBLQ9JJK8和TrEMBLQ9JJK9中示出了鼠源RANKL及同种型的细胞外部分氨基酸序列。
已经证明RANKL是破骨细胞形成(osteoclastogenesis)中的必需因子。抑制RANKL与其受体RANK的相互作用可以引起破骨细胞形成受抑，因此提供了阻止骨质疏松症和其它状况中所观察到的过度骨吸收的方法。通过RANK-Fc融合蛋白或称为骨保护素(OPG)的RANKL可溶性诱饵受体可以抑制RANKL/RANK相互作用。
在骨骼中，RANKL在基质细胞或成骨细胞上表达，而RANK在破骨细胞前体上表达。RANK和RANKL的相互作用对于破骨细胞前体发育为成熟的破骨细胞至关重要。通过OPG可以阻断该相互作用。OPG缺陷的小鼠患有通过重组OPG注射可以救助的骨质疏松症，表明OPG能逆转骨质疏松症。因此，通过提供适宜的本发明缀合物、组合物和方法(例如，RANKL-AP205 VLP缀合物)抑制RANK-RANKL相互作用在逆转或预防骨质疏松症方面是有效的。
此外，在剔除OPG的小鼠中观察到了可以通过OPG注射逆转的动脉钙化(Min等，J.Exp.Med.4463(2000))。在佐剂诱导的关节炎模型中，OPG注射能防止骨丢失和软骨破坏，但是不能防止炎症(爪肿胀)。推测活化的T细胞可以引起RANKL介导的破骨细胞形成和骨丢失的增加。OPG抑制小鼠骨中前列腺癌诱导的破骨细胞形成并防止前列腺肿瘤生长。OPG减少了小鼠中晚期骨癌的疼痛。
RANKL是属于TNF超家族的245个氨基酸的跨膜蛋白质。可以通过TACE样蛋白酶切下部分细胞外区域(178个氨基酸)(Lum等，J Biol Chen.27413613(1999))。此外，已经描述了缺少跨膜结构域的剪接变异体(Ikeda等，Endocrinology l421419(2001))。切割的细胞外部分含有与可溶性TNF-α高度同源的结构域，并且形成如在TNF-α中所观察到的同源三聚体。C末端看似参加了三聚体的接触位点。在序列的这个区域中存在一个半胱氨酸。
我们已经建立了RANKL相应区域的3维结构模型，并且发现在折叠结构中天然存在的半胱氨酸不可能接近以用于与本发明载体上第一附着位点相互作用。N末端是适于附着包含第二附着位点的氨基酸接头(其具有额外半胱氨酸残基)的一个位点。具有融合了N末端氨基酸接头(含有半胱氨酸残基)的RANKL细胞外部分的人类RANKL构建体，是本发明一个实施方式。然而，含有半胱氨酸残基作为第二附着位点并且融合在RANKL序列C末端或者RANKL细胞外部分上的氨基酸接头也是本发明的实施方式。
可以根据这里公开的教导产生人类RANKL构建体，并且本领域普通技术人员能在氨基酸序列比对中比较鼠和人的RANKL序列以鉴定载体中要克隆的人RANKL序列部分。含有氨基酸138-317并且对应于人类RANKL细胞外结构域C末端区域的片段为本发明一个实施方式，并且可以按本发明教导根据需要修饰该片段以便偶联AP205 VLP。本发明也包括适用于在下述适宜宿主中表达的其它载体。本发明范围中意欲包括的其它人RANKL构建体包括包含可以被TACE样蛋白酶释放的部分细胞外区域(178个氨基酸)或其片段(Lum等，J Biol Chem.27413613(1999))的人类RANKL构建体，或者该人类RANKL构建体可以包含对应于缺少跨膜结构域的可变剪接变异体的序列，以及其保守性片段。包含氨基酸165-317的人RANKL的C末端片段也是本发明实施方式。包含整个细胞外区域(氨基酸71-317)并可以根据需要按本发明教导进行修饰以偶联AP205 VLP的RANKL片段也在本发明范围内。
已经在不同系统中(例如，大肠杆菌，昆虫细胞，哺乳动物细胞)表达了RANKL，并且已经证明这些RANKL是活性的。因此，几种表达系统可以用于产生组合物中适宜的RANKL抗原。在使蛋白质表达定向于大肠杆菌周质的情况下，可以用细菌信号肽置换RANKL或RANKL构建体(由蛋白质的细胞外部分组成)的信号肽，该RANKL或RANKL构建体可以经修饰包含本发明的第二附着位点。对于在大肠杆菌胞质中表达蛋白质，RANKL构建体无需信号肽。
在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是MIF或其片段。MIF是起巨噬细胞移动抑制剂作用的细胞因子。它也被称作延迟早期应答蛋白质6(delayed early response protein 6，DER6)、糖基化抑制因子或苯丙酮酸互变异构酶。
已经证明MIF涉及多种状况。在结核菌素诱导的迟发型超敏(DTH)反应中MIF(mRNA和蛋白质)被上调，并且抗MIF抗体抑制该DTH反应。在肾脏同种异体移植排斥中MIF也被上调。在眼睛自身免疫病模型中(实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU))，抗MIF治疗引起了EAU发展的延迟。患者血清中MIF增加，该增加也出现在贝赫切特病患者和患有虹膜睫状体炎的患者中。抗MIF的免疫可以提供抗类风湿性关节炎的治疗方法。因此适于引起抗MIF免疫或适于降低血清MIF的本发明缀合物、组合物和方法可以用于治疗或预防与MIF超量产生有关的这些疾病、病症和状况。
在特应性皮炎患者中已经发现了高血清MIF浓度。在皮肤损伤中，MIF弥散性表达，而在对照中MIF存在于基细胞层中。类固醇治疗后，MIF浓度降低，这与炎症中MIF的作用一致。也发现MIF有助于肾小球肾炎的确立。用抗MIF抗体治疗的动物显示了显著降低的肾小球肾炎。MIF是垂体来源的并在例如受到LPS刺激时分泌，并且其增强内毒素血症。因此，抗MIF mAb抑制内毒素血症和脓毒性休克，而重组MIF显著地增加腹膜炎的致死率。MIF也是糖皮质激素诱导的、可以调节细胞因子产生的物质，并且其促进炎症。
T细胞(TH2)也产生MIF，并且MIF可以支持T细胞增殖，而抗MIF治疗降低T细胞增殖和IgG水平。在多发性硬化和神经贝赫切特病(neuro-Behcets disease)患者的脑脊髓液中存在增加的MIF浓度。在患有长期银屑病的患者的血清中也发现了高MIF水平。在溃疡性结肠炎患者而不是局限性回肠炎患者的血清中发现了高MIF水平。
在支气管哮喘患者的血清中已经发现了高MIF水平。在类风湿性关节炎患者的滑液中MIF也被上调。在小鼠和大鼠模型中，抗MIF治疗有效地降低类风湿性关节炎(Mikulowska等，J.Immunol.1585514-7(1997)；Leech等，Arthritis Rheum.41910-7(1998)，Leech等.Arthritis Rheum.43827-33(2000)，Santos等，Clin.Exp.Immunol.123309-14(2001))。因此，利用包含MIF作为抗原决定簇的组合物定向抑制MIF活性的治疗将有益于上述状况。
如MIF大鼠SEQ ID NO120，MIF小鼠SEQ ID NO121和MIF人类SEQ ID NO119 SwissProt中所示，来源于小鼠、大鼠和人类的MIF由114个氨基酸组成，并且含有3个保守性半胱氨酸。3个亚基形成没有通过二硫键稳定的同源三聚体。X射线结构已经解析，显示了3个自由半胱氨酸(Sun等，PNAS 935191-96(1996))，而一些文献数据声称存在二硫键。尽管如此，没有一个半胱氨酸被足够暴露以致可以与载体上存在的可能的第一附着位点最佳地相互作用。因此，在本发明该实施方式中，一方面，含有半胱氨酸残基的氨基酸接头被添加到蛋白质的C末端(因为在三聚体结构中蛋白质C末端是暴露的)用于产生第二附着位点。在小鼠和大鼠MIF之间只有一个氨基酸改变，相似地，在人类和大鼠MIF或人类和小鼠MIF之间也具有非常高的序列同源性(约90％序列同一性)。本发明包括含有与AP205 VLP缔合的人类和小鼠MIF构建体的缀合物、组合物和方法。
在MIF序列N末端添加含有半胱氨酸的氨基酸接头也是本发明的实施方式。在大肠杆菌中已经表达、纯化了MIF，并且已证明其具有完全的功能性的(Bernhagen等，Biochemistry 3314144-14155(1994)。因此，可以在大肠杆菌中表达MIF以产生本发明有用的实施方式。
如果不从构建体切下起始甲硫氨酸，那么MIF的互变异构酶活性将受到抑制。大肠杆菌中表达的MIF构建体显示了互变异构酶活性。切割了起始甲硫氨酸并且在该序列中正好位于起始甲硫氨酸后的脯氨酸残基被突变为丙氨酸的MIF突变体也不显示互变异构酶活性，其代表了本发明进一步的实施方式，并且意欲包括在本发明范围内。在一个具体实施方式
中，AP205缀合无互变异构酶活性的MIF突变体。
在本发明一个实施方式中，抗原或抗原决定簇是白细胞介素-17(IL-17)。人类IL-17是具有可变糖基化的32kDa、二硫键连接的同源二聚体蛋白质(Yao，Z.等，J.Immunol.1555483-5486(1995)；Fossiez，F.等，J.Exp.Med.1832593-2603(1996))。该蛋白质包含155个氨基酸，并且包含19-23个残基的N末端分泌信号序列。IL-17的氨基酸序列只与疱疹病毒(Herpesvirus)蛋白质(HSV13)相似，并且与其它细胞因子或已知蛋白质不相似。在GenBank记录号#AAC50341中给出了人类IL-17氨基酸序列。在GenBank记录号#AAA37490中给出了小鼠蛋白质序列。在评估的大量组织和细胞系中，仅在活化的T细胞和佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸/离子霉素刺激的外周血单核细胞中检测到了编码IL-17的mRNA转录物(Yao，Z.等，J.Immunol.1555483-5486(1995)，Fossiez，F.等，J.Exp.Med.1832593-2603(1996))。人类和小鼠序列都含有6个半胱氨酸残基。
IL-17的受体在许多组织和细胞类型中广泛地表达(Yao，Z.等，Cytokine 9794-800(1997))。尽管人类IL-17受体的氨基酸序列(866个氨基酸)预测为具有单跨膜结构域和一个525个氨基酸的长细胞内结构域的蛋白质，但是该受体序列是独特的，与来自细胞因子/生长因子受体家族的任何受体均不相似。这点和IL-17本身与其它已知蛋白质缺少相似性联系在一起，表明IL-17和其受体可能是新信号传递蛋白质和受体家族的一部分。临床研究表明IL-17可能与许多炎性疾病有关。类风湿性关节炎患者的滑液T细胞分泌IL-17，并且IL-17刺激炎性介质产生(Chabaud，M.等，J.Immunol.161409-414(1998)；Chabaud，M.等，Arthritis Rheum.42963-970(1999))。在类风湿性关节炎患者中已经报道了高水平IL-17(Ziolkowska M.等，J Immunol.1642832-8(2000))。
已经证明白细胞介素17对鼠膝关节中蛋白聚糖的降解具有作用(Dudler J.等，Ann Rheum Dis.59529-32(2000))，并且有助于滑膜基质的破坏(Chabaud M.等，Cytokine.121092-9；(2000))。现已存在检测抗IL-17免疫作用的相关关节炎动物模型(Chabaud M.等，Cvtokine.121092-9；(2000))。在来源于多发性硬化患者的单核的细胞中已发现了升高水平的IL-17mRNA(Matusevicius，D.等，Mult.Scler.5101-104(1999))。在患有系统性红斑狼疮的患者中观察到了升高的IL-17血清水平(Wong C.K.等，Lupus 9589-93(2000))。此外，在分离自损伤的银屑病皮肤的T细胞中IL-17 mRNA水平增加(Teunissen，M.B.等，J.Invest.Dermatol，111645-649(1998))。
也已经证实了IL-17参与肾脏移植排斥(Fossiez F.等，Int.Rev.Immunol.16541-51(1998))。Antonysamy等(J.Immunol.162577-84(1999))也已经提出了器官同种异体移植排斥中IL-17作用的证据，他证明IL-17促进树突细胞祖先细胞的功能性分化。他们的发现提示了在同种异体T细胞增殖中IL-17的作用，其中可能部分地通过对DCs的成熟诱导作用来介导该T细胞增殖。而且，该研究小组还报道了(Tang J.L.等，Transplantation 72348-50(2001))IL-17在急性血管性排斥的免疫发病机理中的作用，其中白细胞介素17拮抗作用可以抑制急性而不是慢性血管性排斥。IL-17看似有潜力作为同种异体移植排斥干预性治疗的新靶标。
抗IL-17单克隆抗体mAb5(Schering-Plough Research Institute)能完全抑制类风湿性关节炎(RA)滑膜上清液中通过50ng/ml IL-17诱导的IL-6产生。在该测定中，不相关的mAb MX1没有作用。mAb5是用人类rIL-17(r＝重组蛋白)免疫后获得的小鼠IgG1。在此测定系统中，1μg/ml浓度的mAb5能完全抑制IL-6产生(Chabaud，M.等，J.Immunol.161409-414(1998))。因此，抗IL-17免疫为上述各种状况提供了治疗方法。
因此，在本发明一个实施方式中，组合物包含与重组IL-17C末端融合的接头，该接头含有第二附着位点。在进一步实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头与加工后的蛋白质的序列的N末端融合，或者插入到信号肽C末端，即成熟蛋白质序列的N末端。对于真核生物表达系统，与这里所述的其它自身抗原一样，IL-17基因的信号肽可以用例如来源于特定真核生物表达载体的另一个信号肽置换。对于在细菌中表达，可以用指导在周质中可溶性表达的细菌信号肽置换该信号肽。对于在细胞质中表达，构建体不带有信号肽。在一些实施方式中，无信号肽的人类IL-17构建体将包含残基24-155，22-155，21-155或20-155。在一些实施方式中，无信号肽的小鼠IL-17构建体将包含残基26-158，25-158，24-158或27-155。可以在CV1/EBNA细胞中表达人类IL-17；已经证明重组hIL-17可以以糖基化和非糖基化两种形式分泌(Yao，Z.等，J.Immunol.1555483-5486(1995))。IL-17也可以表达为hIL-17/Fc融合蛋白，随后从融合蛋白切割IL-17蛋白质。也可以在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达IL-17(Murphy K.P.等，Protein Expr Purif.12208-14(1998))。也可以在大肠杆菌中表达人类IL-17。当使大肠杆菌中IL-17的表达定向于周质时，可以用细菌信号肽置换IL-17信号肽。在一个实施方式中，IL-17构建体无信号肽以便该蛋白质在大肠杆菌细胞质中表达。
在本发明另一个实施方式中，抗原决定簇是白细胞介素13(IL-13)。IL-13是活化的T淋巴细胞分泌的细胞因子，其主要影响单核细胞、巨噬细胞和B细胞。前体蛋白质的头20个氨基酸对应于信号肽，并且在加工后的蛋白质中不存在。已经描述了小鼠序列(Brown K.D.等，J.Immunol.142679-687(1989))。根据表达宿主，IL-13构建体将含有(例如对于在真核生物宿主中表达和分泌)前体蛋白质的序列，或者(例如对于在大肠杆菌中细胞质表达)由成熟蛋白质组成。为了在大肠杆菌周质中表达，可以用细菌信号肽置换IL-13信号肽。
IL-13是最近发现涉及变应性气道应答(哮喘)的T辅助细胞2来源的细胞因子(象IL-4，IL-5)。在许多肿瘤类型(例如，霍奇金淋巴瘤)中已经发现IL-13和IL-13受体被上调。白细胞介素13可以由霍奇金和里-斯细胞分泌并且刺激这些细胞的生长(Kapp U.等，J Exp Med.1891939-46(1999))。因此，抗IL-13免疫提供了治疗诸如上述状况，如哮喘或霍奇金淋巴瘤的方法。
在一个实施方式中，组合物包含含有半胱氨酸残基的氨基酸接头，该接头融合到成熟IL-13序列的N或C末端以在蛋白质中引入第二附着位点。在其它实施方式中，因为根据IL-13的NMR结构，成熟形式的IL-13的N端可以自由接近，所以将含有半胱氨酸的氨基酸接头添加到成熟形式蛋白质的N末端(Eisenmesser，E.Z.等，J.Mol.Biol.310231(2001))。在其它实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末端。在其它实施方式中，将含有半胱氨酸残基的氨基酸接头添加到蛋白质的C-末端。
可以在大肠杆菌(Eisenmesser E.Z.等，Protein Expr.Purf.20186-95(2000))中或在NS-0细胞(真核细胞系)(Cannon-Carlson S.等，Protein Expr.Purf.12239-48(1998))中表达IL-13。
在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是白细胞介素-5(IL-5)。IL-5是促嗜酸性粒细胞生成的谱系特异性细胞因子，在与增加数量的嗜酸性粒细胞有关的疾病，诸如哮喘中起重要作用。
在几个研究中已经证明了IL-5的生物学功能(Coffman R.L.等，Science 245308-10(1989)；Kopf等，Immunity 415-24(1996))，其中指出在嗜酸性粒细胞介导的疾病中抑制IL-5功能的有益作用。因此，对IL-5作用的抑制提供了治疗与嗜酸性粒细胞有关的哮喘和其它疾病的方法。
IL-5形成通过二硫键共价连接的二聚体。已经报道了单链(sc)构建体，其中通过肽接头连接IL-5的两个单体。
在本发明一个实施方式中，在加工形式的IL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸的肽接头。也设想在加工形式的scIL-5序列的N末端添加含有半胱氨酸的接头。在其它实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式的蛋白质序列的N末端。
在其它实施方式中，含有半胱氨酸的接头融合到IL-5序列的C末端，或者融合到scIL-5序列的C末端。
已经描述了用于IL-5的大量表达系统，并且可以在制备本发明组合物时使用这些表达系统。Proudfoot等(Biochem J.270357-61(1990))描述了利用大肠杆菌的细菌表达系统。在大肠杆菌胞质中表达IL-5的情况下，IL-5构建体无信号肽。昆虫细胞也可以用于产生用于制备本发明组合物的IL-5构建体(Pierrot C.等，Biochem.Biophys.Res.Comm un.253756-60(1998))。同样地，也可以使用杆状病毒表达系统(sf9细胞；Ingley E.等，Eur.J Biochem.196623-9(1991)和Brown P.M.等，Protein Expr.Purif.663-71(1995))。最后，也已报道了哺乳动物表达系统(CHO细胞)，并且在制备本发明组合物时也可以使用这些表达系统(Kodama S等，J.Biochem.(Tokyo)110693-701(1991))。
也已经描述了用于小鼠IL-5的杆状病毒表达系统(Mitchell等，Biochem.Soc.Trans.21332S(1993)，Kunimoto DY等，Cytokine 3224-30(1991))和利用CHO细胞的哺乳动物表达系统(Kodama S等，Glycobiology2419-27(1992))。
其中IL-5序列在其N末端融合了包含半胱氨酸残基的氨基酸接头的鼠IL-5构建体的表达适于IL-5偶联AP205 VLP。根据这里的教导可以产生人类构建体，得到适于偶联AP205 VLP的蛋白质人C-IL-5-E、人C-IL-5-F和人C-IL-5-S，其为本发明的其它实施方式。
在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是CCL-21，CCL-21是CC亚家族的趋化因子，也称为小诱导型细胞因子A21，exodus-2，SLD(次级淋巴细胞细胞因子)，TCA4(胸腺来源的趋化剂4)或6Ckine。
CCL21抑制血细胞生成，并且刺激胸腺细胞的趋化性，激活T细胞和树突细胞，但是不激活B细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。它显示了对幼稚T细胞优先的活性。它也是有效的肾小球系膜细胞(mesangia cell)化学引诱物。(根据物种)CCL21结合趋化因子受体CCR7和CXCR3。在生理学剪切下，它可以触发快速的依赖于整联蛋白的淋巴细胞滚动抑制作用，并且其被高内皮小静脉(high endothelial venules)高度地表达。
在人肺癌SCID小鼠模型(Arenberg等，Cancer Immunol.Immunother.49587-92(2001))和小鼠结肠癌肿瘤模型中(Vicari等，J.Immunol.1651992-2000(2001))，鼠CCL21抑制肿瘤生长和血管生成。在大鼠角膜微囊试验中也检测到鼠CCL21的angiostatic活性(Soto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 958205-10(1998)。
也证明在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4被上调，并且在代表乳腺癌转移的第一目的地的器官中高度表达CCL21和CXCL12及各自的配体(Müller等.(Nature 41050-6(2001))。体外，通过中和性抗CCL21抗体可以阻断CCL21介导的趋化性，同样地CXCR4介导的趋化性也可以被相应抗体阻断。因此，抗CCL21免疫提供了治疗癌症，更特别是乳腺癌中瘤转移扩散的方法。
在小鼠和人类中分泌的CCL21分别具有110或111个氨基酸。在SwissprotSY21人类中和在SwissprotSY21_小鼠中示出了各自的序列。与其它CC细胞因子不同，CCL21确实在C末端延伸区域中多包含2个半胱氨酸。推测所有半胱氨酸都参与了二硫键。
在下文中，描述了用于制备包含CCL21抗原决定簇的本发明组合物的构建体和表达系统。在同源蛋白质Eotaxin的NMR结构中，N和C末端都暴露于溶剂。在一些实施方式中，在蛋白质C末端添加包含作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头。已经表达了(在CCL21的C末端)与碱性磷酸酶融合的蛋白质，并且证明其是功能性的，表明在CCL21的C末端的融合与受体结合相容。在具体实施方式
中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末端。
已经描述了用于CCL21产生的几种表达系统(例如，Hedrick等，J.Immunol.1591589-93(1997))。例如，可以在杆状病毒系统中表达CCL21(Nagira等，J.Biol.Chem.27219518-24(1997))。
在相关实施方式中，抗原决定簇是基质来源的因子1(SDF-1)，现在称为CXCL12。CXCL12是骨髓基质细胞产生的趋化因子，并且最初被鉴定为前B细胞的刺激因子。
如上所述，已经证明在乳腺癌细胞中趋化因子受体CCR7和CXCR4上调，并且在代表乳腺癌转移的第一个目的地的器官中高度表达CCL21和SDF-1及各自的配体(Müller等.Nature 41050-6(2001))。体外，通过中和性抗SDF-1和抗CXCR4抗体，可以抑制SDF-1/CXCR-4介导的趋化性。
在利用人MDA-MB-231乳腺癌细胞系的SCID小鼠乳腺癌转移模型中，当用抗CXCR4抗体治疗小鼠时观察到了显著减少的肺转移。在引流淋巴结中，观察到了向腹股沟淋巴结和腋淋巴结转移的减少(38％而不是在对照中的100％的转移)。因此，抗CXCL12免疫提供了抗癌，更具体地抗乳腺癌转移的治疗方法。
已经证明SDF-1/CXCR4趋化因子-受体对可以增加更原始的造血祖先细胞归巢成为骨髓的效力。此外，推测CXCR4和SDF-1影响慢性淋巴细胞性白血病细胞的分布。这些细胞总是浸润患者的骨髓，并且证明这些细胞在骨髓中的迁移是CXCR4依赖性的。如果慢性淋巴细胞性白血病细胞不与基质细胞共培养，它们将出现细胞程序死亡。SDF-1阻断性抗体可以抑制基质细胞的这种保护性作用(Burger等，Blood 962655-63(2000))。因此，抗CXCL12免疫提供了抗慢性淋巴细胞性白血病的治疗方法。
已经证明CXCR4是HIV进入到T细胞的共同受体。SDF-1抑制X4(依赖于CXCR4)HIV株系对CD4+细胞的感染(Oberlin等，Nature 382833-5(1996)；Bleul等，Nature 382829-33(1996)，Rusconi等，Antivir.Ther.5199-204(2000))。已经证明SDF-1的合成肽类似物有效地抑制HIV-1借助于CXCR受体的进入和感染(WO059928A1)。因此，抗CXCL12免疫提供了阻断HIV进入T细胞的方法和由此治疗AIDS的方法。
也报道了SDF-1-CXCR4相互作用在类风湿性关节炎滑膜内CD4+T细胞聚积中起重要作用(Nanki等，2000)。因此，抗SDF-1免疫提供了抗类风湿性关节炎的治疗方法。
已知人和鼠SDF-1通过单基因的不同剪接，以两种形式SDF-1α和SDF-1β出现。它们有4个C末端氨基酸不同，SDF-1β(74个氨基酸)中存在这4个C末端氨基酸，而SDF-1α(70个氨基酸)中不存在这4个C未端氨基酸。在SwissprotSDF1_人类中示出了人类SDF-1序列，在SwissprotSDF1_小鼠中示出了小鼠SDF-1序列。SDF-1含有形成2个分子内二硫键的4个保守性半胱氨酸。SDF晶体结构显示非共价连接的二聚体(Dealwis等，PNAS 956941-46(1998))。SDF-1结构也显示了长N末端延伸。
丙氨酸扫描诱变被用于鉴定SDF-1上的受体结合位点(部分)(Ohnishi等，J Interferon Cytokine Res.20691-700(2000))，Elisseeva等.(J.Biol.Chem.27526799-805(2000))和Heveker等.(Curr.Biol.8369-76(1998))描述了抑制受体结合(和HIV进入)的SDF-1衍生肽。
在下文中，描述了适于产生与SDF-1有关的本发明组合物的构建体和表达系统。SDF-1的N和C末端均暴露于溶剂。因此，在具体实施方式
中，含有作为第二附着位点的半胱氨酸的氨基酸接头融合到蛋白质序列C末端，而在其它具体实施方式
中，含有作为第二附着位点的半胱氨酸的氨基酸接头融合到蛋白质序列N末端。含有半胱氨酸的氨基酸接头可以融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末端。可以在适宜的表达载体中克隆编码这些特异构建体的基因。
已经描述了SDF-1在鸡胚成纤维细胞中在仙台病毒系统中的表达(Moriya等，FEBS Lett.425105-11(1998))，此外大肠杆菌中(Holmes等，Prot.Expr.Purif.21367-77(2001))SDF-1的表达，和SDF-1的化学合成(Dealwis等，PNAS 956941-46(2001))也已有描述。
在本发明另一个实施方式中，抗原决定簇是B淋巴细胞化学引诱物(BLC，CXCL13)。BLC在脾脏、淋巴集结和淋巴结中表达(Gunn等，1998)。在生发中心中其表达最强，B细胞在此经受体细胞突变和亲和力成熟。BLC属于CXC趋化因子家族，并且它的最接近同系物是GROα(Gunn等，Nature 391799-803(1998))。人BLC与鼠BLC具有64％同源性。它的受体是CXCR5。BLC也与IL-8有同源性。在次级淋巴器官诸如脾脏和淋巴集结中，BLC向滤泡募集B细胞。BLC对于向富含滤泡树空细胞(FDCs)的淋巴结区室募集B细胞也是必需的(Ansel等，Nature 406309-314(2000))。BLC也诱导在募集的B细胞上增加的淋巴毒素α1β2(LTα1β2)表达。由于LTα1β2促进BLC表达，这就提供了正反馈循环(Ansel等，Nature 406309-314(2000))。也已证明BLC能诱导淋巴新生(Lymphoidneogenesis)(Luther等，Immunity 12471-481(2000))。看起来FDCs也表达BLC。因此，抗BLC免疫可以提供涉及淋巴新生的自身免疫病诸如类风湿性滑膜炎和类风湿性关节炎或I型糖尿病的治疗方法。已经描述了具有C末端His标签的BLC构建体，并且该构建体是功能性的(Ansel，K.M.等，J.Exp.Med.1901123-1134(1999))。
在本发明一个实施方式中，组合物包含含有作为第二附着位点的半胱氨酸残基的接头，并且该接头融合在BLC序列的C末端。
在与BLC同源的IL-8中，N和C末端都是游离的。含有作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头和BLC的N末端融合产生了本发明的一个实施方式。
在本发明其它实施方式中，组合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接头，并且该接头融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末端。可以在适宜表达载体中克隆和相应地表达编码这些特定构建体的基因。在记录号NP_006410中示出了人类BLC序列。该序列的氨基酸1-22是信号肽。在记录号NP_061354中示出了小鼠序列。氨基酸1-21是信号肽。在一些实施方式中，具有BLC做为抗原决定簇的本发明组合物利用了成熟形式的蛋白质来产生本发明的组合物。
在另一个具体实施方式
中，抗原决定簇是Eotaxin。Eotaxin是对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞上存在的趋化因子受体3特异的趋化因子。然而，看起来Eotaxin对嗜酸性粒细胞具有高度特异性(ZimmermanJ.Immunol.1655839-46(2000))。尽管在剔除Eotaxin-1的小鼠中，嗜酸性粒细胞迁移减少70％，但是其还可以发生嗜酸性粒细胞增多(Rothenberg等，J.Exp.Med 185785-90(1997))。IL-5看起来负责嗜酸性粒细胞从骨髓向血液的迁移，而Eotaxin与组织中的局部迁移有关(Humbles等，J.Exp.Med.186601-12(1997))。
人类基因组含有3种Eotaxin基因，Eotaxin1-3。它们相互有30％同源性。目前在小鼠中已知2种基因Eotaxin1和Eotaxin2(Zimmerman等，J.Immunol.1655839-46(2000))。它们有38％同源性。鼠Eotaxin2与人Eotaxin2有59％同源性。在小鼠中，看起来Eotaxin1在胃肠道中普遍地表达，而Eotaxin2似乎主要在空肠中表达(Zimmerman等，J.Immunol.1655839-46(2000))。Eotaxin1存在于支气管肺泡液中(Teixeira等，J.Clin.Invest.1001657-66(1997))。Eotaxin具有8.3kDa的MW。在多种条件下，它在单体和二聚体之间保持平衡，在37℃具有估算的1.3mM Kd(Crump等，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。然而，单体形式是主要的。通过NMR光谱学已经阐述了Eotaxin的结构。与受体CCR3的结合位点在N末端，并且第一个半胱氨酸之前的区域是至关重要的(Crump等，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。结合Eotaxin的趋化因子受体肽证实了该发现。Eotaxin具有形成2个二硫键的4个半胱氨酸。因此，在一个实施方式中，本发明组合物包含含有作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头，并且在一个实施方式中，该接头融合到Eotaxin序列C末端。在另外的实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末端。可以在适宜的表达载体中克隆编码这些特定构建体的基因。
可以化学合成Eotaxin(Clark-Lewis等，Biochemistry 303128-3135(1991))。已经描述了大肠杆菌细胞质中Eotaxin1的表达(Crump等，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。也已描述了大肠杆菌中Eotaxin2作为包函体的表达，及随后的重折叠(Mayer等，Biochemistry 39；8382-95(2000))，和Eotaxin2的昆虫细胞表达(Forssmann等，J.Exp.Med.1852171-6(1997))，并且这些可以用于达到本发明具体的实施方式。
在本发明另一个具体实施方式
中，抗原决定簇是巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF或CSF-1)。M-CSF或CSF-1是巨噬细胞和其骨髓祖先细胞增殖、分化和生存的调节物。M-CSF的受体是原癌基因cFMS编码的细胞表面酪氨酸激酶受体。M-CSF和其受体升高的表达与几种上皮癌(诸如乳腺癌、子宫癌和卵巢癌)中的不良预后有关。在由易患乳腺癌的转基因小鼠(PyMT)和含有csf-1基因隐性无效突变的小鼠杂交得到的小鼠株系中，研究了肿瘤进展。这些小鼠与PyMT小鼠比较显示了减弱的晚期侵入性癌和肺转移(Lin等，J.Exp.Med.193727-739(2001))。原因看起来是缺少向肿瘤组织募集巨噬细胞。在csf.1无效小鼠中Lewis肺癌的表下生长也受损。推测肿瘤生长的巨噬细胞增强机理是通过巨噬细胞产生的血管生成因子、生长因子和蛋白酶实现的。
可以得到M-CSF可溶形式的结构数据(晶体结构Pandit等，Scoence2581358-62(1992))，并且表明蛋白质N和C末端是可以接近的。然而，N末端接近与受体相互作用的位点。此外，M-CSF以可溶和细胞表面形式存在，其中跨膜区域在其C末端。因此，本发明的一些实施方式包含含有半胱氨酸的氨基酸接头，并且在一个实施方式中，该接头添加在M-CSF或其片段的C末端、可溶形式M-CSF的C末端。在其它实施方式中，含有半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质或可溶形式的蛋白质的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质或可溶形式蛋白质序列的N末端。M-CSF是二聚体，其中两个单体通过链间二硫键连接。
已经描述了用于M-CSF N末端149个氨基酸(功能性)片段的大肠杆菌表达系统(Koths等，Mol.Reprod.Dev.4631-37(1997))。按上述进行修饰的这个M-CSF片段代表根据本发明实施方式的一个抗原决定簇。在记录号NP_000748中示出了人类序列。本发明其它抗原决定簇包含对应于可溶形式受体的、由上述序列的残基33-181或33-185组成的N末端片段。
在记录号NP_031804中示出了小鼠序列。成熟序列在氨基酸33开始。因此，本发明一个抗原决定簇包含氨基酸33-181或33-185。
在一个实施方式中，抗原决定簇是抵抗素(Res)。用兔多克隆抗体进行被动免疫研究，其中该多克隆抗体抗细菌中表达的GST与小鼠抵抗素(mRes)的融合蛋白质而产生。该被动免疫在肥胖症/II型糖尿病动物模型中导致改进的葡萄糖摄取(Steppan等，Nature 409307-12(2001))。
抵抗素(Res)是约12KD的114个氨基酸的肽激素。它含有11个半胱氨酸，其中已证明最N端的半胱氨酸负责蛋白质的二聚化，而其它10个半胱氨酸被认为参与分子内二硫键形成(Banerjee和Lazar，J.Biol.Chem.27625970-3(2001))。第一个半胱氨酸突变为丙氨酸将废止mRes的二聚化。
动物模型中，在其C末端具有FLAG标签的mRes保留了活性(Steppan等，Nature 409307-12(2001))。相似地，C末端HA标记(血凝素标签)的抵抗素在组织培养测定中也显示了活性(Kim等，J.Biol.Chem.27611252-6(2001))。因此，在一个实施方式中，本发明组合物包含含有作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头，并且该接头融合在抵抗素序列的C末端。在另一个实施方式中，包含半胱氨酸的氨基酸接头融合到对应于加工后的蛋白质序列的序列的N末端，或者插入到信号肽C末端，即成熟形式蛋白质序列的N末端。
在本发明一个实施方式中，MRes或huRes也可以表达为Fc融合分子(其中在构建体的抵抗素和Fc部分之间插入蛋白酶切割位点)，诸如C末端为真核生物表达系统中融合蛋白的Fc部分的铰链区之一个或多个半胱氨酸残基，或者诸如这里所述的融合方式。切割融合蛋白可以释放抵抗素，此时抵抗素还包含含有半胱氨酸残基的氨基酸接头或者融合蛋白Fc部分的全部或部分铰链区(其在C末端包含适于偶联AP205 VLP的半胱氨酸残基)。在记录号AF323081中示出了人类抵抗素序列。在记录号AF323080中示出了鼠序列。本发明有利的实施方式是在其C末端融合了包含半胱氨酸残基的氨基酸接头的人抵抗素蛋白质。可以根据这里公开的教导产生人抵抗素构建体，并且通过在蛋白质序列比对中比较鼠和人抵抗素序列可以鉴定将要克隆到这里所述载体或其它适合表达载体中的人抵抗素序列部分。适于产生本发明组合物的人抵抗素构建体的例子是人抵抗素-C-Xa，人抵抗素-C-EK和人抵抗素-C。
这样产生的人抵抗素构建体是本发明的一个实施方式。因此，利用本发明上述组合物接种以对抗抵抗素，可以提供治疗II型糖尿病和肥胖症的方法。
在另一个实施方式中，抗原决定簇是淋巴毒素-β，抗淋巴毒素-β免疫可以用于治疗朊病毒介导的疾病。朊病毒是在大多数哺乳动物物种中存在的细胞蛋白质。朊病毒蛋白质以两种形式存在，通常存在于健康个体中的正常折叠形式(PrPc)和引起疾病的错误折叠形式(PrPSc)。目前朊病毒假说假设错误折叠的朊病毒PrPSc能催化健康朊病毒PrPc重折叠为引起疾病的PrPSc(A.Aguzzi，Haematologica 85，3-10(2000))。在一些罕见的例子中，这种转换也可以自发出现，在人类中引起经典的CJD。PrPc中一些突变与这种自发转换的增加有关，从而引起各种形式的家族性CJD。然而，PrPSc也可以具有传染性，可以通过输血或通过食物链传递。后一种形式的朊病毒介导的疾病称为库鲁病(Kuru Kuru)，过去该病出现在食人者中。然而，因为以自己个体为食的物种不多，所以这种通过口传递的疾病形式太罕见以致于没有有关其它物种的文献记载。
整个欧洲用牛肉产品大量饲养奶牛改变了受PrPSc可传染形式感染(引起BSE)的奶牛的状况和数量，最近几年奶牛感染数量急剧增加，几十万奶牛受到这种感染。这种大量BSE患病奶牛的突然出现在人群中引起了可以在人类中诱导相似疾病的极大恐慌。实际上，在1996年，已报道了第一例变异形式的CJD，其由食用PrPSc感染的牛肉引起。到现在，这种恐慌继续增加，因为在接下来的几年里受感染的人的数量持继地增加，并且没有治愈前景。而且，因为绵羊会死于称为瘙痒病的朊病毒介导的疾病，且因为其它哺乳动物物种也可以受PrPSc感染，所以BSE样疾病也可能在其它物种中发生。
据认为瘙痒病(朊病毒介导的疾病)因子的复制主要发生在淋巴组织中，并且已证明其依赖于表达朊病毒-蛋白质的滤泡树空细胞(FDCs)(Brown等，Nature Med 111308-1312(1999))。已经很详细地研究了朊病毒传递的机制。现在清楚朊病毒首先在感染的小鼠的淋巴器官中复制，随后向中枢神经系统转运。已证明在缺少功能性滤泡树空细胞的小鼠中，朊病毒在脾脏中的复制会受损且神经侵入出现(小)延迟(Montrasio等，Science 2881257-1259(2000))。这通过用可溶性淋巴毒素β受体-Fc-融合蛋白(LTβR-Fc)注射小鼠而达到。该可溶性受体构建体通过干扰T，B或NK细胞上的淋巴毒素β和FDC前体细胞上的淋巴毒素β受体的重要相互作用，可以抑制FDCs发育。FDC是很少研究的细胞类型，但是现在清楚它们的发育依赖于B细胞产生的淋巴毒素和/或TNF(F.Mackay，J.L.Browning，Nature 395，26-27(1998))。实际上，淋巴毒素缺陷的小鼠不显示FDCs(M.S.Matsumoto等，Science 264，703-707(1996))。除了FDCs外，抗体也可以在疾病的进展中起作用(S.Brandner，M.A.Klein，A.Aguzzi，Transfus Clin Biol 6，17-23(1999))。
因此，从淋巴器官消除FDCs的抗淋巴毒素β(也称为TNFγ)，LTα或LTβ受体的接种可以提供用于治疗或预防克-雅氏病(变异体形式)或其它朊病毒介导的疾病，诸如牛海绵状脑病(BSE)的疫苗，并且由此预防朊病毒的复制和神经侵入。
抗淋巴毒素β的免疫也可以提供治疗糖尿病的方法。非肥胖型糖尿病NOD小鼠中可溶性LTβR-Fc融合蛋白的转基因表达阻断了糖尿病发生而不阻断胰岛炎(Ettinger等，J.Exp.Med.1931333-40K(2001))。Wu等.(J.Exp.Med.1931327-32(2001))也利用NOD小鼠研究了淋巴毒素β的参与，但是代替利用转基因动物，他们在试验中注射LTβR-Fc融合蛋白。他们观察到对糖尿病发生的强抑制和对胰岛炎的抑制。最有趣地，通过融合蛋白治疗，他们甚至逆转了先前存在的胰岛炎。因此，在胰腺中，可以逆转淋巴滤泡结构的形成。因此，抗淋巴毒素β的接种可以提供抗I型糖尿病的治疗方法。
在一个实施方式中，本发明组合物包含含有半胱氨酸的氨基酸接头，并且该接头被添加到对应于加工形式的淋巴毒素β的序列的N末端，或者插入到对应于成熟形式蛋白质的序列的N末端和信号肽之间，即信号肽C末端。在本发明相关实施方式中，淋巴毒素β的细胞外部分表达为融合蛋白，其中该融合蛋白具有在淋巴毒素β的N端融合的谷胱甘肽-S-转移酶，或者该融合蛋白具有在淋巴毒素β细胞外部分的N端融合的6个组氨酸标签及随后的myc标签。含有蛋白酶切割位点的氨基酸间隔区及含有作为附着位点的半胱氨酸的接头序列(蛋白酶切割位点C端)融合到淋巴毒素β细胞外部分序列的N末端。在一个实施方式中，淋巴毒素β细胞外部分由对应于淋巴毒素β氨基酸49-306或126-306的片段组成。可以在pCEP-Pu真核载体中克隆和表达本发明的这些特定的组合物。在一些实施方式中，本发明组合物包含含有适于作为第二附着位点的半胱氨酸残基的氨基酸接头，并且该接头融合到淋巴毒素β或淋巴毒素β片段的C末端。在特别有利的实施方式中，氨基酸序列LACGG包含氨基酸接头ACGG，该接头本身含有用于偶联AP205 VLP的半胱氨酸残基，将该氨基酸序列融合到淋巴毒素β细胞外部分或淋巴毒素β细胞外部分的片段的N末端，用肠激酶切割在载体pCEP-SP-GST-EK或载体pCP-SP-his-myc-EK中表达的相应融合蛋白后，产生人C-LTβ49-306和人C-LTβ126-306蛋白质。
在一个实施方式中，抗原或抗原决定簇是朊病毒蛋白，其片段，特别是朊病毒蛋白的肽。在本发明的一个实施方式中，抗原决定簇是朊病毒蛋白或其片段。抗朊病毒蛋白的免疫可以提供治疗或预防克-雅氏病(变异体形式)或其它朊病毒介导的疾病的方法。对应于鼠朊病毒蛋白片段和序列CSAMSRPMIHFGNDWEDRYYRENMYR(SEQ ID NO17)(″cprplong″)和CGNDWEDRYYRENMYR(″cprpshort″)(SEQ ID NO18)的鼠肽包含用于化学偶联AP205 VLP的添加的N末端半胱氨酸残基，并且产生了本发明一个实施方式。在一个实施方式中，朊病毒蛋白是人朊病毒蛋白。在整个申请中给出了如何修饰人朊病毒蛋白以连接AP205 VLP的指导。公开了小鼠朊病毒蛋白构建体，并且也可以制备人朊病毒蛋白构建体。包括整个人朊病毒蛋白序列和人朊病毒蛋白的其它片段的其它构建体也是本发明的组合物。抗朊病毒蛋白的免疫可以提供治疗或预防克-雅氏病(变异体形式)或其它朊病毒介导的疾病的方法。利用包含朊病毒蛋白的本发明组合物进行免疫也可以提供治疗其他动物中朊病毒介导的疾病的方法。对应于上述鼠肽和氨基酸序列CSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHR(″人类cprplong″)(SEQ ID NO19)和CGSDYEDRYYRENMHR(″人类cprpshort″)(SEQ ID NO20)的人朊病毒蛋白肽产生了本发明的实施方式。这些肽包含被添加用于偶联AP205 VLP的N末端半胱氨酸残基。相应的牛和绵羊肽是CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMHR(″牛cprplong″)(SEQ ID NO21)和CGNDYEDRYYRENMHR(″牛cprpshort″)(SEQ ID NO22)和CSAMSRPLIHFGNDYEDRYYRENMYR(″绵羊cprplong″)(SEQ ID NO23)和CGNDYEDRYYRENMYR(″绵羊cprpshort″)(SEQ ID NO24)，所用这些都构成本发明实施方式。
在本发明一个实施方式中，抗原决定簇是肿瘤坏死因子(TNF-α)，其片段或TNF-α肽。特别地，通过用分别包含本发明的这种肽或片段的疫苗和组合物免疫人和动物，TNF-α肽或片段可以用于诱导抗整个蛋白质的自身特异性免疫应答。下面的鼠肽是人肽的鼠源同系物，已经证明该肽可以与中和TNF-α活性的抗体结合(Yone等.J.Biol.Chem.27019509-19515)，并且在本发明另一个实施方式中，该肽用半胱氨酸残基修饰以便与AP205 VLP偶联。
MuTNFα肽在由成熟鼠TNF-α氨基酸残基22-32组成的表位的N末端添加序列CGG，产生了序列CGGVEEQLEWLSQR(SEQ ID NO25)。
3’TNFII肽在由成熟鼠TNF-α氨基酸残基4-22组成的表位的C末端融合序列GGC，并且将谷氨酰胺21突变为甘氨酸。由此得到的肽序列是SSQNSSDKPVAHVVANHGVGGC(SEQ ID NO26)。
5’TNFII肽在由成熟鼠TNF-α氨基酸残基4-22组成的表位的N末端融合半胱氨酸残基，并且将谷氨酰胺21突变为甘氨酸。由此得到的肽序列是CSSQNSSDKPVAHVVANHGV(SEQ ID NO27)。
与4-22表位对应的人类序列是SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ ID NO28)。对于鼠源序列，在一个实施方式中，半胱氨酸融合在该表位N末端或者序列GGC融合在该表位C末端以便共价偶联本发明AP205 VLP。然而，将含有半胱氨酸的其它序列融合在表位的N或C末端，也在本发明范围内。一般地，在一个实施方式中，将一个或两个甘氨酸残基插在添加的半胱氨酸残基和表位序列之间。然而，也可以插入其它氨基酸而不是甘氨酸，并且这些氨基酸残基包括小氨基酸，诸如丝氨酸。
在本发明组合物的其它优选实施方式中，抗原或抗原决定簇是肿瘤坏死因子(TNF-α)、其片段或突变蛋白质，或者TNF-α肽或其片段或突变蛋白质的肽，其中具有所述第二附着位点的所述抗原或抗原决定簇具有选自如下的氨基酸序列a)CSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQ(SEQ IDNO100)氨基酸序列；b)SSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQGGC(SEQID NO101)氨基酸序列；和c)CGGQLQWLNRRANA(SEQ ID NO102)氨基酸片列。
对应于氨基酸残基22-32的人类序列是QLQWLNRRANA(SEQ IDNO29)。在一个相关实施方式中，序列CGG融合在该表位N末端以便共价偶联本发明AP205 VLP。适于本发明中使用的其它TNF-α表位也已经例如，由Yone等.(J.Biol.Chem.27019509-19515)描述和公开。本发明还包括含有这里所述的抗原或抗原决定簇的模拟表位的组合物。
本发明的一个特定组合物包含呈递在病毒样颗粒上用于诱导抗抗体免疫应答的抗体或抗体片段。在一个实施方式中，选择淋巴瘤细胞产生的抗体或抗体片段，将其和用于免疫的病毒样颗粒附着，以便诱导抗淋巴瘤的保护性免疫应答。
在其它进一步实施方式中，将模拟抗原的抗体或抗体片段附着在AP205 VLP上。这些模拟抗体或抗体片段可以通过免疫及随后分离此模拟抗体或抗体片段，或者通过本领域任何已知的方法诸如杂交瘤技术(Gherardi，E.等，J.Immunol.Methods 12661-68(1990))，噬菌体展示(Harrison等，Methods Enzymol.26783-109(1996))，核糖体展示(Hanes，J.等，Nat.Biotechnol.181287-1292(2000)，酵母双杂交(Visintin，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611723-11728(1999))，酵母表面展示(Boder，ET.& Wittrup，KD.Methods.Enzym.328430-444(2000))，细菌表面展示(Daugherty，PS.等，Protein Eng.12613-621(1999))产生。也可以利用本领域已知的方法从抗体文库或幼稚抗体文库( antibody library)分离模拟抗体。
在进一步实施方式中，使用识别另一个抗体的结合位点的抗体，即，抗独特型抗体，也称为免疫性抗体(immunizing antibody)。抗独特型抗体识别的抗体也称为中和抗体。因此，通过免疫以抵抗抗独特型抗体，可以在原位产生具有中和抗体特异性的分子；我们也将这些产生的抗体称为诱导型抗体。在另一个实施方式中，选择免疫性抗体使它与免疫作用所要对抗的靶分子的配体分子相互作用。配体分子可以是与靶分子相互作用的任何分子，但是在一个实施方式中，优选地，配体分子与这样的靶分子位点相互作用，其中为了抑制该靶分子的功能而产生的抗体应针对该靶分子位点。配体分子可以是靶分子的天然配体或者可以是具有适宜结合特性的基因工程改造的、设计的或分离的任何配体。
免疫性抗体可以来自于人，诸如从幼稚或免疫人类抗体文库分离，或者可以从产生自其它动物来源，例如鼠源的文库分离。
通过暴露的二硫键(例如，Fab片段中CH1和Cκ或Cλ之间的链间二硫键)的有限还原，或者在另一个实施方式中，通过在抗体或抗体片段C末端融合含有半胱氨酸残基的接头，实现抗体或抗体片段与AP205 VLP的偶联。在另一实施方式中，含有半胱氨酸残基的接头融合到抗体或抗体片段的N末端以附着VLP或菌毛蛋白质。
如同产生和鉴定特定表位的模拟表位的方法，利用模拟表位的大量疫苗组合物也是本领域已知的。例如，Arnon等，Immunology 101555-562(2000)(这里将整个公开文献并入为参考文献)描述了抗曼氏裂体吸虫(Schistosoma Mansoni)的基于模拟表位肽的疫苗。这些疫苗中使用的模拟表位通过筛选固相8mer随机肽文库以鉴定抗曼氏裂体吸虫保护性单克隆抗体识别的表位的模拟表位而获得。相似地，Olszewska等，Virology 27298-105(2000)(这里将整个公开文献并入为参考文献)描述了f小鼠。此外，Zuercher等，Eur.J.Immunol.30128-135(2000)(这里将整个公开文献并入为参考文献)描述了利用表位展示噬菌体进行口服抗IgE免疫的组合物和方法。具体地，表位展示M13噬菌体用做口服抗IgE疫苗的载体。试验的疫苗组合物含有单克隆抗IgE抗体BSW17的模拟表位和表位。
本发明的实施方式包括含有引发针对特定抗原的免疫应答的模拟表位的疫苗组合物，及组成这些疫苗组合物的单个模拟表位/AP205 VLP缀合物，及这些疫苗组合物在引发抗特定抗原或抗原决定簇的免疫应答中的用途。模拟表位也可以是多肽，诸如抗独特型抗体。因此，在本发明另一实施方式中，抗原或抗原决定簇是抗独特型抗体或抗独特型抗体片段。
本发明还包括含有这里所述的抗原或抗原决定簇的模拟表位的组合物。可以通过大量方法(包括筛选随机肽噬菌体展示文库(参见，例如WO 97/31948，这里将整个公开文献并入为参考文献))产生和鉴定特定抗原的模拟表位。常常会进行这种文库的筛选以鉴定结合一种或多种对特定抗原具有特异性的抗体的肽。
适于用在本发明疫苗组合物中的模拟表位可以是线性或环状肽。线性或环状肽模拟表位可以通过非肽键连接非天然分子支架或核心颗粒或VLP。
如上所述，已经鉴定了可以引发抗人IgE分子的免疫应答的大量人IgE模拟表位和表位(参见，例如WO 97/31948)。因此，在一些实施方式中，本发明疫苗组合物包括引发抗免疫球蛋白分子(例如，IgE分子)的免疫应答的组合物。
可以用于激发这种免疫应答的肽包括蛋白质、蛋白质亚基、IgE分子结构域和能激发对IgE分子具有特异性的抗体产生的模拟表位。一般地，用于制备疫苗组合物的IgE分子部分将来源于组合物将要施用的物种的IgE分子。例如，打算给予人类的疫苗组合物将常常含有人类IgE分子的一个或多个部分，和/或能激发抗人类IgE分子的免疫应答的一种或多种模拟表位。
在
具体实施例方式
中，施用给人类的本发明疫苗组合物将含有记录号AAB59424中所述IgE重链恒定区的至少一部分。在更具体实施方式
中，用于制备本发明疫苗组合物的IgE肽包含或者可替代地其组成为具有下面氨基酸序列的肽CGGVNLTWSRASG(SEQ ID NO30)。
在其它特定实施方式中，本发明疫苗组合物将含有至少一种能激发免疫应答从而导致对特定抗原具有特异性的抗体产生的模拟表位。适于在本发明疫苗组合物制备中使用的IgE模拟表位的例子包括具有下面氨基酸序列的肽

疫苗和免疫原的制备噬菌体AP205 VLP可以用于产生疫苗构建体，并且使与其附着的抗原具有高度免疫原性。本发明提供了将抗原附着于AP205 VLP上的方法。在一个实施方式中，利用异双官能交联剂，通过化学交联的方法，将抗原附着于VLP上。本领域已知几种异双官能交联剂。在一些实施方式中，异双官能交联剂含有可以与VLP赖氨酸残基侧链氨基反应的官能基团和可以与抗原上的半胱氨酸残基反应的官能基团，其中半胱氨酸残基或天然存在或可以通过还原用于反应，或者通过基因工程改造而存在并任选地通过还原而可以用于反应。该方法的第一步骤称为衍生化，是VLP和交联剂的反应。该反应的产物是活化的VLP，也称为活化的载体。在第二步骤中，利用常用方法诸如凝胶过滤或透析除去未反应的交联剂。在第三步骤中，抗原与活化的VLP反应，并且该步骤称为偶联步骤。可选地，在第四步骤中除去未反应的抗原。本领域已知几种异双官能交联剂。这些异双官能交联剂包括交联剂SMPH(Pierce)，磺基-MBS，磺基-EMCS，磺基-GMBS，磺基-SIAB，磺基-SMPB，磺基-SMCC，SVSB，SIA和可来源于PierceChemical Company(Rockford，IL，USA)并且具有对氨基具有活性的一个官能基团和对半胱氨酸残基具有活性的一个官能基团的其它交联剂。上述所有交联剂都引起了硫醚键的形成。适于在本发明实践中使用的另一类交联剂的特征在于一旦偶联就在抗原和VLP之间引入二硫键。属于该类的交联剂包括，例如SPDP和磺基-LC-SPDP(Pierce)。基于有机化学领域中的反应理论，众所周知VLP被交联剂衍化的程度受变化的试验条件(诸如每种反应成分的浓度，一种试剂相对于另一种试剂的过量，pH，温度和离子强度)的影响。可以通过改变上述试验条件调整偶联的程度，即每亚单位AP205 VLP的抗原量，以满足疫苗的要求。抗原的溶解度可能对每个亚单位上可以偶联的抗原量产生限制，并且当所获疫苗是不溶的时，降低每个亚单位的抗原量是有益的。
抗原与AP205 VLP附着的一个方法是AP205 VLP表面上的赖氨酸残基和抗原上的半胱氨酸残基连接。在一些实施方式中，需要用含有半胱氨酸残基的氨基酸接头改造抗原以便偶联AP205 VLP。做为可替代方案，可以通过插入或突变在抗原内引入半胱氨酸。
在本发明优选的实施方式中，组合物包含氨基酸接头。优选地，所述氨基酸接头通过至少一个共价键和至少一个抗原、抗原决定簇和有机分子结合。氨基酸接头的选择将取决于抗原的性质、它的生物化学特性诸如pI，电荷分布或糖基化。一般地，柔性氨基酸接头是有利的实施方式。氨基酸接头的例子是免疫球蛋白铰链区，甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n(SEQID NO49)，和甘氨酸接头(G)n，所有这些接头都还包含作为第二附着位点的半胱氨酸残基和可选地甘氨酸残基。(下面是这种氨基酸接头的例子N-末端γ1CGDKTHTSPP(SEQ ID NO50)C-末端γ1DKTHTSPPCG(SEQ ID NO51)M-末端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP(SEQ ID NO52)C-末端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQ ID NO53)N-末端甘氨酸接头GCGGGG(SEQ ID NO54)
C-末端甘氨酸接头GGGGCG(SEQ ID NO55)C-末端甘氨酸-赖氨酸接头GGKKGC(SEQ ID NO56)N-末端甘氨酸-赖氨酸接头CGKKGG(SEQ ID NO57)。
对于肽，已经证明在肽C末端的GGCG(SEQ ID NO58)、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)接头，或N末端CGG是有用的。在一些实施方式中，将甘氨酸残基插入到大的氨基酸和将要用做第二附着位点的半胱氨酸之间。
氨基酸接头的优选实施方式选自(a)CGG；(b)N-末端γ1接头；(c)N-末端γ3接头；(d)Ig铰链区；(e)N-末端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12和k＝0-5(SEQ ID NO93)；(g)N-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ ID NO94)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1接头；(m)C-末端γ3接头；(n)C-末端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，n＝0-12和k＝0-5(SEQ ID NO95)；(p)C-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，和o＝0-8(SEQ ID NO96)。
在一些实施方式中，抗原或抗原决定簇包含能与AP205 VLP或VLP亚单位上的第一附着位点缔合的单一第二附着位点或单一反应性附着位点。这确保了至少一个，但是通常一个以上，优选地10，20，40，80，120个以上的抗原与AP205 VLP发生确定和均一的结合或缔合。因此，抗原上单一第二附着位点或单一反应性附着位点的提供将确保单一且一致的结合或缔合，从而产生高度有序和重复的阵列。例如，如果通过赖氨酸(做为第一附着位点)和半胱氨酸(做为第二附着位点)相互作用的方式实现结合和缔合，则根据本发明这种优选的实施方式，将确保每个抗原只有一个半胱氨酸残基能结合或缔合AP205 VLP或AP205 VLP的第一附着位点，而且这与这个半胱氨酸残基是天然还是非天然存在于抗原上无关。
抗原上存在的半胱氨酸残基必须处于还原状态以便与活化的VLP上的异双官能交联剂反应，即，必须可获得游离的半胱氨酸或者具有游离巯基的半胱氨酸残基。在起第二附着位点作用的半胱氨酸残基是氧化形式的情况下，例如，如果它形成二硫键的情况下，需要用例如DTT，TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。
根据上述方法通过利用异双官能交联剂使抗原和AP205 VLP附着，将允许抗原以定向方式偶联在AP205 VLP上。使抗原和AP205 VLP缔合的其它方法包括利用碳化二亚胺EDC和NHS，使抗原与AP205 VLP交联。抗原或抗原决定簇也可以首先通过与例如SATA，SATP或iminothiolane反应而硫醇化。如下所述，然后抗原或抗原决定簇(如果需要在脱保护后)可以偶联AP205 VLP。分离过量硫醇化试剂后，抗原或抗原决定簇与先已用异双官能交联剂活化的AP205 VLP反应，该异双官能交联剂包含半胱氨酸活性部分并且由此展示出对半胱氨酸残基具有活性的至少一个或几个官能基团，而硫醇化的抗原或抗原决定簇可以与该官能基团反应(如上所述)。可选地，反应混合物中包含低量的还原试剂。在其它方法中，利用同双官能交联剂诸如戊二醛，DSG，BM[PEO]4，BS3(Pierce Chemical Company，Rockford，IL，USA)或具有对AP205 VLP的氨基或羧基具有活性的官能基团的其它已知同双官能交联剂，将抗原附着于AP205 VLP上。
在另一实施方式中，通过修饰糖基化抗原或抗原决定簇上存在的碳水化合物部分，并且随后与AP205 VLP反应，使抗原或抗原决定簇结合AP205 VLP。在一个实施方式中，在碳水化合物部分的温和氧化反应中，使糖基化抗原或抗原决定簇与高碘酸钠反应，产生具有一个或多个醛官能基团的活化抗原或抗原决定簇。从过量高碘酸钠分离这种活化的抗原或抗原决定簇，并且进一步与AP205 VLP反应，其中AP205 VLP或至少一个AP205 VLP亚单位的赖氨酸残基与抗原或抗原决定簇上先已形成的醛官能基团反应，例如，按Hermanson，G.T.《Bioconjugate Techniques》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，USA所述反应。如前述公开出版物中所述，可以通过调节pH控制活化抗原或抗原决定簇的自聚合。优选地，用氰基硼氢钠进一步还原形成的席夫碱，随后用凝胶过滤或透析除去氰基硼氢钠。做为可替代方案，AP205 VLP或至少一个AP205 VLP亚单位的羧基可以与EDC和二酰肼(dihydrazyde)，诸如己二酸二酰肼反应，以产生可用于与活化抗原或抗原决定簇上存在的一个或多个醛官能基团反应的酰肼部分。用氰基硼氢钠可以进一步还原这样形成的腙。做为可替代方案，具有一个或多个醛官能基团的活化抗原或抗原决定簇与半胱胺反应，在抗原或抗原决定簇中引入半胱氨酸基团。在Hermanson，G.T.《Bioconjugate Techniques》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，USA中可以找到适于使抗原或抗原决定簇与AP205 VLP结合的其它交联方法和交联剂，和关于如何进行偶联反应及应用化学交联剂和化学交联方法的指导。
使VLP与抗原结合的其它方法包括生物素酰化VLP并且将抗原表达为链霉抗生物素蛋白融合蛋白的方法，或者生物素酰化抗原和VLP两者的方法。在这种情况下，抗原可以首先结合链霉抗生物素蛋白或亲和素，其中，通过调节抗原和链霉抗生物素蛋白的比率，使得自由结合位点仍旧可以获得用于与下一步骤添加的VIP结合。做为可替代方案，可以在“一个容器”反应中混合所有成分。其它配体-受体对也可以用作结合试剂用于抗原和VIP的结合，其中可得到该受体和配体的可溶形式，并且它们能与VLP或抗原交联。在本发明优选的实施方式中，所述第一和/或所述第二附着位点选自(a)抗原和其抗体或抗体片段；(b)生物素和亲和素；链霉抗生物素蛋白和生物素；(c)受体和其配体；(d)结合配体的蛋白质和其配体；(e)相互作用的亮氨酸拉链多肽；(f)氨基和对其有反应性的化学基团；(g)羧基和对其有反应性的化学基团；(h)巯基和对其有反应性的化学基团；和(i)它们的联合。
免疫应答免疫应答的性质或类型不是本公开的限制因素。根据本领域熟知的原理，治疗或预防性免疫应答所期望的结果可以根据疾病而变化。例如，抗感染物的免疫应答可以完全防止感染物的定居和复制，从而实现“无菌免疫”和消除任何疾状况状。然而，如果抗传染物的疫苗减少了症状的数量、严重性或持继期；如果它减少了具有这种症状的群体中的个体数量；或者减少了感染物的传递，则可以认为这种疫苗是有效的。类似地，抗癌症、变应原或自身抗原的免疫应答可以完全治愈疾病，可以减缓症状，或者可以是全面的抗疾病治疗干预方案的一个方面。例如，可以将刺激抗癌症免疫应答与手术、化学治疗、放射性、激素和其它免疫学方法联合以实现治疗。
而且，可能期望根据疾病和本领域已知的原理刺激不同类型的免疫应答。例如，熟知一些免疫应答比其它免疫应答更适合于特定抗原。实际上，一些免疫应答是不适当的，并且可能引起病态，诸如对感染、变态反应和自身免疫疾病应答的病理炎症，这里对这些做了进一步描述。尽管不要求特定的免疫应答，但是本发明可以针对治疗或预防目的刺激免疫应答。本发明另一特定的实施方式包括产生能对抗病理免疫应答作用的免疫应答。
可以通过抗原性质、引入到体内的途径、剂量、给药方案、抗原重复的性质、宿主背景和免疫系统的信号传递因子影响免疫应答的性质。这种知识是本领域所熟知的。同样地，可以通过本领域已知理论和常规试验的应用调整免疫应答。
尽管不希望受理论束缚，本发明作为产生免疫应答的药物组合物成分，特别是作为疫苗，提供了特别新和令人惊奇的优点。
首先，本领域已知的其它载体包括BSA、匙孔戚血蓝蛋白、破伤风类毒素、细菌外膜蛋白质、霍乱毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A和细菌菌毛可能不适于用在个体中，特别是人中。前述载体可以诱导变应性反应，或者刺激病理免疫应答(例如，霍乱毒素，KLH，BSA)。前述载体可能要求诸如完全弗氏佐剂等现在认为不适于人类的佐剂存在。大量载体可能是目前疫苗的成分(例如，破伤风类毒素、霍乱毒素、外毒素A)，或者代表通常所遇到的抗原(例如，细菌菌毛、外毒素A、外膜蛋白质)。因此，个体可能对这些载体具有高水平先已存在的免疫性，这样用抗原-载体缀合物免疫将诱导比对新抗原更大的对载体的免疫应答。因为这些原因(单独或做为整体地)，AP205做为载体蛋白质的用途可以代表对目前载体蛋白质有用的改进。不用完全弗氏佐剂，也没有病理免疫应答的迹象，AP205-DerP1缀合物组合物能刺激抗DerP1的免疫应答。
在AP205做为载体蛋白质的应用中，抗原呈递细胞可以摄取缀合AP205的抗原，即AP205-抗原，并由此刺激T辅助细胞以诱导免疫应答。而且，正常地无免疫原性的半抗原也可以偶联AP205，由此产生抗这种半抗原的免疫应答。
本发明另一个有利的特征是抗原可以以规则、重复阵列形式呈递在VLP表面，该阵列能在有或无T细胞辅助下诱导有效的免疫应答。本发明的这个特征是特别有利的。
因此，通过增加将要用于免疫的抗原的重复程度(通过抗原结合AP205VLP)，本发明提供了改进特别是抗自身抗原的接种效力的方法。
组合物、疫苗及其给药和治疗方法本发明提供了可以用于预防和/或减轻疾病或状况的疫苗组合物。本发明还提供了用于预防和/或减轻个体中的疾病或状况的接种方法。
在一个实施方式中，本发明提供了用于预防多种物种，特别是哺乳动物物种诸如人类、猴子、奶牛、狗、猫、马、猪等的感染性疾病的疫苗。可以设计疫苗以治疗病毒病因学的感染诸如HIV，流感、疱疹、病毒性肝炎、EB、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等；或细菌病因学的感染，诸如肺炎、结核病、梅毒等；或者寄生虫病因学的感染，诸如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于预防和治疗多种物种，特别是哺乳动物物种诸如人类、猴子、奶牛、狗、猫、马、猪等的癌症的疫苗。可以设计疫苗以治疗所有类型癌症淋巴瘤、癌、肉瘤、黑素瘤等。
在本发明另一个实施方式中，本发明的缀合物、组合物和方法可以用于设计治疗变态反应的疫苗。IgE同种型抗体是变应性反应的重要成分。肥大细胞在其表面上结合IgE抗体，并且一旦特异性抗原与在肥大细胞表面上结合的IgE分子结合，那么该肥大细胞就释放组胺和其它变态反应介质。因此，抑制IgE抗体产生是防止变态反应的有希望的靶。通过获得期望的T辅助细胞应答，应该可以达到这个目的。T辅助细胞应答可以分成类型1(TH1)和类型2(TH2)T辅助细胞应答(Romagnani，Immunol.Today18263-266(1997))。TH1细胞分泌干扰素γ和其它细胞因子。相反，TH2细胞产生的至关重要的细胞因子是IL-4，其驱动B细胞产生IgE。在许多实验系统中，TH1和TH2应答的发展相互排斥，因为TH1细胞抑制TH2细胞的诱导，反之亦然。因此，触发强TH1应答的抗原同时将抑制TH2应答的发展和由此的IgE抗体产生。本发明发现AP205 VLP诱导TH1型免疫应答。因此，通过利用本发明的方法，可以用各种变应原修饰AP205VLP，并且用于免疫。由于变应原和AP205 VLP的偶联，将激发TH1应答，产生“保护性”IgG抗体，阻止引起变应性反应的IgE抗体的产生。因为变应原由VLP呈递，而识别VLP的辅助T细胞群与识别变应原的辅助T细胞群不同，所以，即使在含有先已存在的变应原特异性TH2细胞的变应性个体中，也可能将诱导变应原特异的IgG抗体。高浓度IgG抗体的存在可以阻止变应原与结合肥大细胞的IgE结合，由此抑制组胺的释放。因此，IgG抗体的存在可以防止IgE介导的变应性反应。引起变态反应的通常物质包括但不限于花粉(例如，草、豚草、桦树和雪松)、屋尘和尘螨、哺乳动物表皮变应原和动物毛皮屑、霉菌和真菌、昆虫身体和昆虫毒液、毛发、唾液、血清、羽毛、食物或药物(例如，青霉素)，参见，例如Shough，H.等，REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES，19版，(82章)，Mack Publishing Company，Mack PublishingGroup，Easton，Pennsylvania(1995)，这里将其整个内容并入为参考文献。
在具体实施方式
中，本发明提供了预防和/或减弱由“自身”基因产物(例如，肿瘤坏死因子)，即此处所用的“自身抗原”，引起或加重的疾病或状况的方法。在相关实施方式中，本发明提供了用于在个体中诱导免疫应答的方法，该免疫应答导致可以预防和/或减弱由“自身”基因产物引起或加重的疾病或状况的抗体产生。这种疾病或状况的例子包括移植物抗宿主病、IgE介导的变应性反应，过敏反应，成人呼吸窘迫综合征，局限性回肠炎、变应性哮喘、急性成淋巴细胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，突眼性甲状腺肿，炎性自身免疫性疾病，重症肌无力，系统性红斑狼疮(SLE)，免疫增生性疾病淋巴结病(IPL)，血管免疫增生性淋巴结病(AIL)，免疫母细胞性淋巴结病(IBL)，类风湿性关节炎，糖尿病，多发性硬化，骨质疏松症和阿尔茨海默氏病。
如本领域普通技术人员将理解的，当将本发明组合物给予个体时，它们可以是含有盐、缓冲液、佐剂或期望用于改进组合物效力的其它物质的组合物。在大量文献，包括REMINGTON’S PHARMACEUTICALSCIENCES(Osol，A，编辑，Mack Publishing Co.，(1990))中提供了适用于制备药物组合物的材料例子。
如果接受个体能耐受本发明组合物给药，那么就将它们说成是“药物学上可接受的”。而且，本发明组合物将以“治疗有效量”(即，产生期望生理学效果的量)给药。
可以通过本领域已知的各种方法施用本发明组合物，但是通常通过注射、输注、吸入、口服给药或其它适合的物理方法给药。可替代地，可以肌内、静脉内、经粘膜、经皮或皮下给药组合物。用于给药的组合物的成分包括无菌水性(例如，生理盐水)或非水性溶液和悬浮液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射的有机酯类诸如油酸乙酯。载体或封闭敷料可以用于增加皮肤穿透性和增强抗原吸收。
本发明其它实施方式包括本发明组合物的生产方法和利用这些组合物的药物治疗方法。应理解，前述一般性描述和下面详细描述都仅仅是示例说明性的，旨在对权利要求的发明提供进一步解释。
除了疫苗技术，本发明其它实施方式涉及癌症和变态反应的药物治疗方法，和由“自身”基因产物引起或加重的疾病或状况的治疗方法。
将这里提到的所有专利和出版物整体并入为参考文献。
试剂盒在其它实施方式中，本发明组合物可以组装成试剂盒，用于试验或工业设置的测定中，用于诊断或检测疾病、状况或病症。根据本发明的这种试剂盒可以包括至少一个容器含有一种或多种上述缀合物或组合物，包括AP205缀合物和抗这种缀合物的免疫分子和抗体。可选地，本发明试剂盒还可以包含至少另外一个容器，该容器可以含有例如一种或多种抗原、一种或多种半抗原、一种或多种核心颗粒、一种或多种本发明缀合物/组合物、一种或多种药物学上可接受的载体或赋形剂、一种或多种缓冲液、一种或多种蛋白质、一种或多种核酸分子等。
相关领域的普通技术人员将理解，对这里所述的方法和应用的其它适宜修饰和调整将是显而易见的，并且可以进行这样的修饰和调整而不背离本发明或其任何实施方式的范围。现在已经详细地描述了本发明，通过参考下面实施例将可以更清楚地理解本发明，这里所包括的实施例仅仅是用于示例的目的，不意味着限制本发明。
实施例实施例1AP205外壳蛋白基因的克隆利用逆转录PCR技术并且在商购质粒pCR 4-TOPO中克隆用于测序，从产生于噬菌体AP205 RNA的2个cDNA片段装配了AP205外壳蛋白(CP)cDNA。逆转录技术是相关领域普通技术人员所熟知的。第一个片段包含在质粒p205-246中，含有CP序列上游269个核苷酸和编码CP最初24个N末端氨基酸的74个核苷酸。第二个片段包含在质粒p205-262中，含有编码CP氨基酸12-131的364个核苷酸和CP序列下游的额外162个核苷酸。
为了将来源于质粒p205-246和p205-262的两个CP片段融合为一条全条CP序列，通过两步PCR设计质粒283-58。利用含有用于克隆到质粒pQb185中的NcoI位点的上游引物p1.44，或者含有用于克隆到质粒pQb10中的XbaI位点的p1.45，和含有HindIII限制位点的下游引物p1.46(下划线是限制酶识别序列)p1.44 5’-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3’(SEQ ID NO59)
p1.45 5’-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3’(SEQ ID NO60)p1.46 5’-AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3’(SEQ IDNO61)在第一次PCR中利用两个额外引物，p1.47和p1.48扩增片段，其中p1.47在p205-262所含片段的5’末端退火，p1.48在质粒p205-246所含片段的3’末端退火。引物p1.47和p1.48互相互补。
p1.475’-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3’(SEQ ID NO62)p1.485’-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3’(SEQ ID NO63)在这头两个PCR反应中，产生两个片段。用引物p1.45和p1.48和模板p205-246产生第一片段。用引物p1.47和p1.46和模板p205-262产生第二片段。将这两个片段用做第二次PCR反应的模板，用引物联合p1.45和p1.46或者p1.44和p1.46，进行拼接重叠延伸。分别用XbaI或NcoI和HindIII消化这两个第二步PCR反应的产物，用相同限制位点分别克隆到两个pGEM来源的表达载体pQb10或pQb185中，位于大肠杆菌色氨酸操纵子启动子控制下。
获得两个质粒，pAP283-58(SEQ ID NO.2)(其在pQb10中含有编码野生型AP205 CP(SEQ ID NO1)的基因)，和pAP281-32(SEQ ID NO4)。(其在pQb185中含有SEQ ID NO125核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有从Pro5到Thr突变的突变蛋白质，该突变蛋白质具有SEQ ID NO.3的氨基酸序列)。通过DNA测序证实了外壳蛋白序列。PAP283-58含有位于CP的ATG密码子上游及XbaI位点下游的49个核苷酸，并且含有外壳蛋白mRNA的推定原始核糖体结合位点。
实施例2重组AP205 VLP的表达和纯化A.重组AP205 VLP的表达用质粒pAP283-58转化大肠杆菌JM109。用单个菌落接种5ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，并且在37℃温育16-24小时，不振荡。
在100-300ml含有20μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中1∶100稀释制备的接种物，并且在37℃温育过夜，不振荡。在含有0.2％葡萄糖和磷酸缓冲盐的2TY培养基中1∶50稀释由此获得的第二接种物，在37℃振荡器上温育过夜。通过离心收集细胞，并且在-80℃冷冻。
B.重组AP205 VLP的纯化溶液和缓冲液1.裂解缓冲液含有5mM EDTA、0.1％Triton X 100和5μg/ml PMSF的50mM Tris-HCl pH8.02.SAS水中饱和的硫酸铵3.缓冲液NET含有5mM EDTA和150mM NaCl的20mM Tris-HCl pH7.84.PEGNET中40％(w/v)聚乙二醇6000裂解以2ml/g细胞在裂解缓冲液中重悬浮冷冻的细胞。用22kH超声处理混合物5次，15秒，同时中间具有1分钟间隔以在冰上冷却溶液。利用F34-6-38转子(Ependorf)，以12000rpm离心裂解液20分钟。除了另外说明外，利用相同转子进行所有下述离心步骤。在4℃贮藏上清液，而用裂解缓冲液洗细胞残渣2次。离心后，将裂解物上清液和洗涤级分合并。
可以进一步利用硫酸铵沉淀纯化AP205 VLP。在第一步骤中，选择AP205 VLP不沉淀的硫酸铵浓度。弃去所得到的沉淀。在下一步骤中，选择AP205 VLP定量沉淀的硫酸铵浓度，并且通过离心(14000rpm，20分钟)从该沉淀步骤的沉淀分离AP205 VLP。在NET缓冲液中溶解所得沉淀。
层析在Sepharose 4B柱子(2.8×70cm)上加样来自于合并的上清液的外壳蛋白，并且以4ml/小时/级分，用NET缓冲液洗脱该外壳蛋白。收集级分28-40，并且用60％饱和度的硫酸铵沉淀。沉淀前，用对AP205 VLP外壳蛋白特异的抗血清，通过SDS-PAGE和Western印迹分析级分。在NET缓冲液中再溶解通过离心分离的沉淀，并且将其加样到Sepharose 2B柱子(2.3×65cm)上，并且以3ml/小时/级分洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，并且收集、合并和用60％饱和度的硫酸铵沉淀级分44-50。在NET缓冲液中再溶解通过离心分离的沉淀，并且在Sepharose 6B柱子(2.5×47cm)上纯化，以3ml/小时/级分洗脱。通过SDS-PAGE分析级分。收集级分23-27，将盐浓度调节到0.5M，并且用PEG 6000(添加水中的40％母液，使得终浓度达到13.3％)沉淀。在NET缓冲液中再溶解通过离心分离的沉淀，并且将其加样到上述相同的Sepharose 2B柱子上，用相同的方式洗脱。通过SDS-PAGE分析级分。收集级分43-53，并且用60％饱和度的硫酸铵沉淀。在水中再溶解通过离心分离的沉淀，利用大量水透析所获得的蛋白质溶液。每克细胞大约可以分离10mg纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE和Western印迹分析，可以显示AP205 VLP的纯化。可以在还原条件下进行银染色SDS-PAGE电泳，并用对AP205 VLP外壳蛋白特异的抗血清进行Western印迹，以显示第一个Sepharose 4B层析步骤和最后一个Sepharose 2B层析步骤的重组Ap205 VLP级分。
在电子显微镜术中对病毒样颗粒的检查表明它们与噬菌体颗粒相同(图1A和1B)。
图1A显示AP205噬菌体颗粒的EM图片，而图1B中示出了重组AP205 VLP自装配颗粒的EM图片。
为了简便起见，实施例部分中所用术语“AP205病毒样颗粒”和术语“AP205 VLP”指如实施例2中所述表达和纯化的病毒样颗粒，其由具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的外壳蛋白组成。
实施例3Derp1.2和Flag肽抗原与AP205 VLP的偶联，及用偶联有AP205 VLP的Derp1.2肽免疫小鼠A.Derp1.2肽和Flag肽与重组AP205 VLP的偶联根据本领域已知的方法，化学合成肽Derp1.2(序列CQIYPPNANKIREALAQTHSA″Der p 1 p117″；氨基酸117-137(SEQ IDNO64))和Flag(序列CGGDYKDDDDK(SEQ ID NO65))。如实施例2中所述表达和纯化的AP205 VLP再溶解于20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.4缓冲液(HBS缓冲液)中。然后，在室温(RT)下，再溶解的AP205VLP以2mg/ml的浓度(在Bradford测定法中测定的)与2.85mM SMPH(Pierce)反应30分钟。然后，利用HBS缓冲液透析反应混合物，之后与0.714mM Derp 1.2或Flag(从DMSO中的50mM母液稀释在反应混合物中)反应。在15℃，进行偶联反应2小时，并利用1000倍体积的HBS透析反应混合物2×2小时，在液氮中等份试样急骤冷冻，使用前在-80℃贮藏。
融化该等份贮藏物，通过SDS-PAGE估测抗原与AP205亚单位的偶联，并且在Bradford测定法中测定蛋白质浓度。图2中示出了Derp 1.2和AP205 VLP偶联反应的结果。AP205 VLP单体亚单位分子量是14kDa。除了单体形式亚单位外，SDS-PAGE中还检测到用交联剂衍生化AP205VLP后，交联产生的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。
图2表示AP205 VLP和Qβ VLP与Derp 1.2肽偶联反应的SDS-PAGE分析。在16％Tris-甘氨酸凝胶上，在还原条件下电泳这些样品。泳道1是蛋白质标记物，具有在凝胶左侧边缘标明的相应分子量；泳道2，衍生的Qβ衣壳蛋白；泳道3，Qβ衣壳蛋白和Derp1.2肽偶联反应的上清液；泳道4，Qβ衣壳蛋白和Derp1.2肽偶联反应的沉淀；泳道5，衍生的AP205VLP；泳道6AP205 VLP和Derp1.2肽偶联反应的上清液；泳道7，AP205VLP和Derp1.2肽偶联反应的沉淀。在图中，用箭头标明了对应于每个单体与1，2，3，4或5个肽偶联的偶联产物。与Qβ衣壳蛋白比较，更多数量的表位可能以AP205 VLP偶联。
B.用偶联重组AP205 VLP的Derp1.2肽免疫小鼠，免疫应答分析和IgG亚型测定在第0和14天给小鼠皮下注射偶联Derp1.2肽的AP205 VLP或偶联Derp1.2肽的Qβ VLP(每次3只小鼠)。利用与A中所述用于偶联AP205VLP的相同条件，使Derp1.2肽偶联Qβ衣壳蛋白。用在PBS中稀释到200μl的10μg疫苗免疫每只小鼠。在第20天，从小鼠眼眶后取血，并且在抗Derp1.2肽的ELISA中测定对Derp1.2肽特异的抗体效价。利用化学交联剂磺基-SPDP，使Der pI肽“Der p I p 52”偶联牛RNA酶A。用偶联的RNA酶制备物，以10μg/ml的浓度包被ELISA板。封闭板，然后将其与系列稀释的小鼠血清温育。用对各亚型特异的酶学标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。做为对照，也检测了相同小鼠免疫前的血清(未示出数据)。在图3中示出了这些结果。
图3显示对免疫小鼠血清中“Derp1.2”特异的IgG抗体的ELISA分析，其中分别用与AP205 VLP或Qβ衣壳蛋白偶联的Derp1.2肽免疫小鼠。测定了总IgG效价和IgG亚型效价。在分析了每种IgG亚型的任何一个免疫前血清中均没有检测到对Derp1.2特异的抗体。该图表明对于AP205和Qβ，均诱导了Th1免疫应答典型的抗体亚型，因为IgG2a效价比IgG1效价高得多。用偶联两种VLP的肽获得了强的特异性抗肽免疫应答。通过ELISA也测定了对载体特异的抗体，并且对两种载体，这些抗体相当。
实施例4用于抗原和VLP偶联的模块化真核生物表达系统产生该系统以向抗原添加含有半胱氨酸残基的各种氨基酸接头序列以便化学偶联VLP。
A.编码含有半胱氨酸的氨基酸接头和可切割的Fc标签的EBNA衍生表达系统的构建用KpnI和Bam HI消化pCep-Pu(Wuttke等.J.Biol.Chem.27636839-48(2001))，并且用退火的寡核苷酸PH37和PH38引入新的多克隆位点，产生pCep-MCS。
如下，产生含有以几个甘氨酸、蛋白酶切割位点和人IgG1恒定区为侧翼的游离半胱氨酸的模块系统。用Bsp120I和HindIII消化pSec2/Hygro B(Invitrogen目录号.V910-20)，并且与退火的寡核苷酸SU7和SU8连接，产生构建体pSec-B-MCS。然后，用NheI和HindIII消化pSec-B-MCS，并且与退火的寡核苷酸PH29和PH30连接，产生构建体pSec 29/30。通过下面片段的3片段连接产生构建体pSec-FL-EK-Fc*用Eco RI和Hind III消化的pSec 29/30，退火的寡核苷酸PH31和PH32，和含有修饰形式的人IgG1恒定区的质粒(PSP-FC*-C1)的Bgl I/EcoRI片段(人IgG1序列的详细情况参见最终构建体pCep-Xa-Fc*的序列(图4A-4C))。由此得到的构建体命名为pSec-FL-EK-Fc*。通过Nhe I，Pme I消化，从该质粒切下接头区和人IgG1 Fc部分，并且克隆到用Nhe I和Pme I消化的pCep-MCS中，产生构建体pCep-FL-EK-Fc*。由此产生了模块化载体，其中用退火的寡核苷酸可以容易地交换该载体中位于NheI和HindIII位点之间的接头序列和蛋白酶切割位点。为了产生可切割的融合蛋白，用NheI和HindIII消化pCep-FL-EK-Fc*，并且用退火的寡核苷酸PH35和PH36引入具有氨基酸GGGGCG(SEQ ID NO55)N末端侧翼的因子Xa切割位点，并用退火的寡核苷酸PH39和PH40引入具有GGGGCG(SEQ ID NO55)N末端侧翼的肠激酶位点，分别产生构建体pCep-Xa-Fc*(图4A，如SEQ ID NO103中所述核苷酸序列，如SEQ ID NO104中所述氨基酸序列)和pCep-EK-Fc*(图4B，如SEQ ID NO105中所述核苷酸序列，如SEQ IDNO106中所述氨基酸序列)。通过KpnI/BamHI消化的pCep-EK-Fc*、退火的寡PH41和PH42和退火的寡PH43和PH44三个片段的连接产生还含有真核生物信号肽的构建体pCep-SP-EK-Fc*(图4C，如SEQ IDNO107中所述核苷酸序列，如SEQ ID NO108中所述氨基酸序列)。
B.融合蛋白的大规模生产对于不同融合蛋白的大规模生产，根据制造商的说明书，用脂质转染胺2000试剂(Invitrogen Corporation；Carlsabad，CA)和不同pCep表达质粒转染293-EBNA细胞(Invitrogen)。转染后24-36h，在添加有10％FCS的DMEM中，在嘌呤霉素筛选(1μg/ml)下，细胞以1∶3的比率传代培养。然后，抗性细胞在选择性培养基中扩大。为了收获融合蛋白，将抗性细胞群传代到聚-L-赖氨酸包被的培养皿上。一旦细胞已经达到铺满，用PBS冲洗它们2次，并且向平板添加无血清培养基(DMEM)。在多达1个月的期间，每2到4天收集组织培养上清液，并且用新鲜DMEM置换。在4℃保存收集的上清液。
C.融合蛋白的纯化利用蛋白质A Sepharose CL-4B(Amersham Pharmacia Biotech AG)，通过亲和层析纯化重组Fc融合蛋白。简而言之，用1-3ml蛋白质A树脂填充层析柱，并且用蠕动泵以0.5-1.5ml/min的流动速率将含有重组蛋白质的组织培养上清液施加到柱子上。然后，用20-50ml PBS洗柱子。根据融合蛋白质，在柱子上进行蛋白酶切割，或者如下所述洗脱蛋白质。用添加有150mM NaCl的柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH3.8)洗脱重组融合蛋白，合并含有蛋白质的级分，用Ultrafrec离心过滤器(Millipore Corporation；Bedford，MA)浓缩。
D.重组融合蛋白的蛋白酶切割(因子Xa，肠激酶)根据制造商的说明书，利用EKmax系统(Invitrogen)切割含有肠激酶(EK)切割位点的洗脱的重组融合蛋白。通过与蛋白质A温育除去从融合蛋白切下的Fc部分。然后，根据制造商的说明书，利用EK-Away系统(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)除去肠激酶。相似地，根据制造商的说明书，利用限制性蛋白酶因子Xa切割和移除试剂盒(Roche)切割含有因子Xa(Xa)切割位点的融合蛋白。通过与蛋白质A温育除去切下的Fc部分，并且用该试剂盒提供的链霉抗生物素蛋白树脂除去蛋白酶。
用Ultrafrec离心过滤器(Millipore Corporation；Bedford，MA)浓缩不同融合蛋白质，用UV分光光度法定量，并且用于随后的偶联反应。
图4A-4C显示所用的不同真核生物表达载体的部分序列。仅仅示出了修饰的序列。
图4ApCep-Xa-Fc*表示从BamHI位点起的序列，翻译序列(SEQID NO103和SEQ ID NO104)上方显示了不同特征。箭头表示因子Xa蛋白酶的切割位点。
图4BpCep-EK-Fc*表示从BamHI位点起的序列，翻译序列(SEQID NO105和SEQ ID NO106)上方显示了不同特征。箭头指示肠激酶的切割位点。HindIII位点下游序列与图4A中所示序列相同。
图4CpCep-SP-EK-Fc*表示从信号肽起始的序列，翻译序列(SEQID NO107和SEQ ID NO108)上方显示了不同特征。用粗体指示信号肽酶切割的信号肽序列。箭头指示肠激酶切割位点。HindIII位点下游序列与图4A中所述序列相同。
实施例5小鼠抵抗素和AP205 VLP的真核生物表达和偶联A.小鼠抵抗素的克隆利用Qiagen RNeasy试剂盒，根据制造商的说明书，从60mg小鼠脂肪组织分离总RNA。将RNA洗脱在40μl水中。利用ThermoScriptTMRT-PCR系统(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)，根据制造商的说明书，用寡dT引物进行总RNA逆转录。在50℃温育样品1小时，加热到85℃5分钟，在37℃用RNA酶H处理20分钟。
2μl RT反应物用于小鼠抵抗素的PCR扩增。利用引物PH19和PH20，利用Platinium TAQ(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)根据制造商的说明书，进行PCR。引物PH19对应于小鼠抵抗素序列位置58-77，引物PH20对应于位置454-435。首先，在94℃，变性PCR混合物2分钟，然后如下进行35个循环94℃，30秒；56℃，30秒；72℃，1分钟，在最后，样品在72℃放置10分钟。纯化PCR片段，通过TA克隆，亚克隆到pGEMTeasy载体(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)中，产生pGEMT-mRes。为了添加适合的限制位点，利用上述相同的循环程序，用引物PH21和PH22引物，对pGEMT-mRes进行第二PCR。正向引物PH21含有BamHI位点和小鼠抵抗素序列的核苷酸81-102。反向引物PH22含有XbaI位点和小鼠抵抗素序列的核苷酸426-406。所述位置参照小鼠抵抗素序列基因记录号AF323080。纯化PCR产物，并且用BamHI和XbaI消化，并且亚克隆到用BamHI和XbaI消化的pcmv-Fc*-C1中，产生构建体pcmv-mRes-Fc*。
通过BamHI/XbaI消化，从pcmv-Res-Fc*切下抵抗素开放读框，并且克隆到用BamHI和NheI消化的pCep-Xa-Fc*和pCep-EK-Fc*(参见实施例4，B部分)中，分别产生构建体pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*。
B.抵抗素的产生、纯化和切割然后，pCep-mRes-Xa-Fc*和pCep-mRes-EK-Fc*构建体用于转染293-EBNA细胞，以便如实施例4，B部分中所述生产重组蛋白质。如实施例4，C部分中所述纯化组织培养物上清液。然后，如实施例4，D部分中所述切割纯化的蛋白质。根据所用的载体，命名所获得的重组蛋白质为“抵抗素-C-Xa”或“Res-C-Xa”和“抵抗素-C-EK”或“Res-C-EK”。通过SDS PAGE分析纯化的蛋白质。凝胶上，对应于纯化的抵抗素-C-EK和纯化的抵抗素-C-Xa的条带清楚可见。SEQ ID NO109，SEQ ID NO110，SEQ ID NO111，和SEQ ID NO112显示用于表达的前体重组小鼠抵抗素蛋白质的序列。在WO 02/056905的图2A和2B中示出了用于偶联的加工后重组小鼠抵抗素，即Res-C-Xa和Res-C-EK。斜体表示由信号肽酶在蛋白质分泌后切割的抵抗素信号序列。粗体表示由信号肽酶和特异性蛋白酶(因子Xa或肠激酶)切割产生的氨基酸序列。
C.抵抗素-C-Xa和抵抗素-C-EK与AP205 VLP的偶联在25℃，在摇摆振荡器上，0.2ml于20mM Hepes，150mM NaCl pH7.4中的2mg/ml AP205 VLP溶液与5.6μl DMSO中的100mM SMPH(Pierce)溶液反应30分钟。随后在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.4，透析反应溶液2次，2小时。然后，在25℃，在摇摆振荡器上，8μl透析的AP205衣壳蛋白反应混合物与32μl抵抗素-C-Xa溶液(产生0.39mg/ml抵抗素终浓度)反应4小时，并且13μl AP205衣壳蛋白反应混合物与27μl抵抗素-C-EK溶液(产生0.67mg/ml抵抗素终浓度)反应4小时。在还原条件下，用SDS-PAGE和Western印迹分析偶联的产物。
实施例6鼠淋巴毒素β构建体的表达、纯化和与AP205 VLP的偶联A.小鼠淋巴毒素β中引入含有cys的接头，及其表达和纯化重组表达小鼠淋巴毒素β(LT-β)的细胞外部分，在其N末端添加CGG氨基酸接头。该接头含有用于偶联VLP的一个半胱氨酸。长(氨基酸49-306)和短(氨基酸126-306)形式的蛋白质在它们的N末端融合用于纯化的谷胱甘肽S-转移酶(GST)或组氨酸-myc标签。插入肠激酶(EK)切割位点用于标签的切割。
C-LT-β49-306和C-LT-β126-306的构建从插在pFB-LIB中的小鼠脾脏cDNA文库，利用寡5’-LT-β和3’-LT-β，PCR扩增小鼠LT-β49-306。对于PCR反应，在50μl反应混合物(1单位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用每种引物各0.5μg，200ng模板DNA。温度循环如下94℃，2分钟，接着94℃(15秒)、68℃(30秒)、68℃(1分钟)共25个循环，接着68℃10分钟。用T4激酶磷酸化PCR产物，并且连接到已经用EcoRV切割和去磷酸化的pEntrylA(Life technologies)中。由此得到的质粒命名为pEntrylA-LT-β49-306。
利用pEntrylA-LT-β49-306做为模板，分别用寡5’LT-βlong-NheI和3’LT-βstop-NotI，5’LT-βshort-NheI和3’LT-βstop-NotI进行第二PCR反应。5’LT-βlong-NheI和5’LT-βshort-NheI有内部NheI位点并且包含编码Cys-Gly-Gly接头的密码子，3’LT-βstop-NotI有内部NotI位点并且含有终止密码子。对于第二PCR反应，在50μl反应混合物(1单位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用每种引物各0.5μg，150ng模板DNA。温度循环如下94℃，2分钟，接着94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(1分钟)共5个循环，接着94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(1分钟)共20个循环，接着68℃10分钟。
用NheI和NotI消化PCR产物，并且插入到pCEP-SP-GST-EK或pCEP-SP-his-myc-EK (Wuttke等.J.Biol.Chem.27636839-48(2001))中。由此得到的质粒分别命名为pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β126-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β126-306。GST代表谷胱甘肽S-转移酶，EK代表肠激酶，his代表6个组氨酸标签，myc代表抗c-myc表位。C表示含有额外半胱氨酸的CGG接头。
通过标准分子生物学方法进行所有其它步骤。
寡核苷酸序列5’LT-β5’-CTT GGT GCC GCA GGA TCA G-3’(SEQ ID NO66)3’LT-β5’-CAG ATG GCT GTC ACC CCA C-3’(SEQ ID NO67)5’LT-βlong-NheI5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTC AGG ATC AGG GAC GTC G-3’(SEQ IDNO68)5’LT-βshort-NheI5’-GCC CGC TAG CCT GCG GTG GTT CTC CAG CTG CGGATT C-3’(SEQ IDNO69)3’LT-βstop-NotI5’-CAA TGA CTG CGG CCG CTTACC CCA CCA TCA CCG-3’(SEQ ID NO70)B.GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306的表达和产生如实施例4中所述，将质粒pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-GST-EK-C-LT-β126-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β49-306，pCEP-SP-his-myc-EK-C-LT-β126-306转染到293-EBNA细胞(Invitrogen)中用于蛋白质生产。由此得到的蛋白质命名为GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306。从cDNA序列GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306，翻译LT-β融合蛋白质的蛋白质序列。
在还原条件下，在12％SDS-PAGE凝胶上分析融合蛋白。将凝胶转印迹到硝酸纤维素膜上。封闭膜，与单克隆小鼠抗myc抗体或者与抗GST抗体温育。随后将印迹与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG或辣根过氧化物酶缀合的兔抗山羊IgG温育。可以证实LT-β融合蛋白的表达。在还原条件下，在12％SDS-PAGE凝胶上分析LT-β融合蛋白。将凝胶转印迹到硝酸纤维素膜上。封闭膜，与单克隆小鼠抗myc抗体(稀释度1∶2000)或与抗GST抗体(稀释度1∶2000)温育。随后，印迹与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠IgG(稀释度1∶4000)或辣根过氧化物酶缀合的兔抗山羊IgG(稀释度1∶4000)温育。用抗GST抗体可以分别在62kDa和48kDa分子量检测到GST-EK-C-LT-β49-306和GST-EK-C-LT-β126-306。用抗myc抗体可以分别在40-56kDa和33-39kDa检测到his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306。
C.GST-EK-C-LT-β49-306，GST-EK-C-LT-β126-306，his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306的纯化利用标准纯化方法，在谷胱甘肽Sepharose柱子上纯化GST-EK-C-LT-β49-306和GST-EK-C-LT-β126-306，并在Ni-NTA Sepharose柱子上纯化his-myc-EK-C-LT-β49-306和his-myc-EK-C-LT-β126-306。用肠激酶切割纯化的蛋白质，并且在还原条件下，在16％SDS-PAGE凝胶上分析。
D.C-LT-β49-306和C-LT-β126-306与AP205 VLP的偶联在25℃，在摇动振荡器上，在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM AP205 VLP溶液与25倍摩尔过量SMPH(Pierce)(从DMSO中的母液稀释)反应30分钟。随后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析反应溶液2次，2小时。然后，在25℃，在摇动振荡器上，透析的AP205 VLP反应混合物与C-LT-β49-306和C-LT-β126-306溶液(终浓度60μM AP205 VLP，60μM C-LT-β49-306和C-LT-β126-306)反应4小时。在还原条件下，通过SDS-PAGE和Western印迹分析偶联产物。
实施例7MIF的克隆、表达、纯化和与AP205 VLP的偶联
A.在大鼠巨噬细胞移动抑制因子MIF中引入含cys的接头、及其表达、纯化大鼠巨噬细胞移动抑制因子(rMIF)重组地表达，其具有融合在其C末端的3个不同氨基酸接头C1，C2和C3。每个接头都含有一个半胱氨酸用于偶联VLP。
rMIF-C1，rMIF-C2，rMIF-C3的构建为了将pET22b(+)(Novagen，Inc.)的MCS改变为GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC(SEQ ID NO71)，用退火的寡聚引物MCS-1F和引物MCS-1R(在15mM Tris HCl，pH 8的缓冲液中退火)置换从NdeI位点到XhoI位点的原始序列。由此得到的质粒称为pMod00，其在它的MCS中有NdeI，BamHI，NheI，XhoI，PmeI和NotI限制位点。退火对寡核苷酸Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R，及退火对寡核苷酸1F-C-甘氨酸接头和寡核苷酸1R-C-甘氨酸接头一起连接到BamHI-NotI消化的pMod00中，产生pModEC1，其具有N端6个组氨酸标签、肠激酶切割位点和含有一个半胱氨酸残基的C端甘氨酸氨基酸接头。退火对oligo Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R与退火对oligo1F-C-γ1接头和oligo 1R-C-γ1接头一起连接到BamHI-NotI消化的pMod00中，产生pModEC2，其有N端6个组氨酸标签、肠激酶切割位点和来源于人免疫球蛋白γ1铰链区且含有一个半胱氨酸残基的C端γ1接头。退火对oligo Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EK-Nhe-R、退火对oligo 1FA-C-γ3接头和oligo 1RA-C-γ3接头、和退火对oligo 1FB-C-γ3接头和oligo1RB-C-γ3接头一起连接到BamHI-NotI消化的pMod00中，产生pModEC3，其具有N末端6个组氨酸标签、肠激酶切割位点和来源于小鼠免疫球蛋白γ3铰链区且含有一个半胱氨酸残基的C末端γ3接头。
用oligo rMIF-F和rMIF-Xho-R，通过PCR扩增含有大鼠MIF cDNA的pBS-rMIF。rMIF-F有内部NdeI位点，rMIF-Xho-R有内部XhoI位点。用NdeI和XhoI消化PCR产物，并且分别地连接到用相同酶消化的pModEC1，pModEC2和pModEC3中。所得质粒分别命名为pMod-rMIF-C1、pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3。
对于这些PCR反应，在50μl反应混合物(2单位PFX聚合酶，0.3mMdNTPs和2mM MgSO4)中使用15pmol每种寡聚物和1ng模板DNA。温度循环如下94℃，2分钟，接着94℃(30秒)、60℃(30秒)、68℃(30秒)共30个循环，接着68℃，2分钟。
通过标准分子生物学方法进行所有其它步骤。
寡核苷酸序列引物MCS-1F5’-TAT GGA TCC GGC TAG CGC TCG AGG GTT TAA ACG GCG GCC GCA T-3’(SEQ ID NO72)引物MCS-1R5’-TCG AAT GCG GCC GCC GTT TAA ACC CTC GAG CGC TAG CCG GATCCA-3’(SEQ ID NO73)Bamhis6-EK-Nhe-F5’-GAT CCA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GGT TCT GGT GAC GAC GATGAC AAA GCG CTA GCC C-3’(SEQ ID NO74)Bamhis6-EK-Nhe-R5’-TCG AGG GCT AGC GCT TTG TCA TCG TCG TCA CCA GAA CCG TGGTGG TGG TGG TGG TGT G-3’(SEQ ID NO75)oligo 1F-C-甘氨酸接头5’-TCG AGG GTG GTG GTG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO76)oligo 1R-C-甘氨酸接头5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCA CCA CCA CCC-3’(SEQ ID NO77)oligo 1F-C-γ1接头
5’-TCG AGG ATA AAA CCC ACA CCT CTC CGC CGT GTG GTT AAT AAGTTT AAA CGC-3’(SEQ ID NO78)oligo 1R-C-γ1接头5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCA CAC GGC GGA GAG GTG TGGGTT TTA TCC-3’(SEQ ID NO79)oligo 1FA-C-γ3接头5’-TCG AGC CGA AAC CGT CTA CCC CGC CGG GTT CTT CTG-3’(SEQ IDNO80)oligo 1RA-C-γ3接头5’-CAC CAC CAG AAG AAC CCG GCG GGG TAG ACG GTT TCG GC-3’(SEQID NO81)oligo 2FB-C-γ3接头5’-GTG GTG CTC CGG GTG GTT GCG GTT AAT AAG TTT AAA CGC-3’(SEQID NO82)oligo 2RB-C-γ3接头5’-GGC CGC GTT TAA ACT TAT TAA CCG CAA CCA CCC GGA G-3’(SEQ IDNO83)rMIF-F5’-GGA ATT CCA TAT GCC TAT GTT CAT CGT GAA CAC-3’(SEQ ID NO84)rMIF-Xho-R5’-CCC GCT CGA GAG CGA AGG TGG AAC CGT TC-3’(SEQ ID NO85)rMIF-C的表达和纯化用质粒pMod-rMIF-C1，pMod-rMIF-C2和pMod-rMIF-C3转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在液体培养基(含有150mM MOPS，pH 7.0，200ug/ml Amp，0.5％葡萄糖的SB)中扩增来源于含有氨苄青霉素(Amp)的琼脂平板的单菌落，用220rpm振荡在30℃过夜温育。然后，用过夜培养物1∶50v/v接种1升SB(150mM MOPS，pH 7.0，200ug/ml Amp)，在30℃，培养到OD600＝2.5。用2mM IPTG诱导表达。过夜培养后收集细胞，在6000rpm离心。在含有0.8mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA和0.25％Tween-20)中悬浮细胞沉淀，超声处理和用benzonase处理。然后，将2ml裂解液过20ml Q XL和20ml SP XL柱子。蛋白质rMIF-C1，rMIF-C2和rMIF-C3直流。
从cDNA序列翻译rMIF-C的蛋白质序列。
rMIF-C1(SEQ ID NO114；C1是GGGGCG(SEQ ID NO55))rMIF-C2(SEQ ID NO115；C2是PKPSTPPGSSGGAPGGCG(SEQID NO116))rMIF-C3(SEQ ID NO117；C3是DKTHTSPPCG(SEQ ID NO118))。
图5A显示MIF构建体的示意图，该构建体具有含有半胱氨酸残基的添加的氨基酸接头。MIF可以是来源于任何哺乳动物的蛋白质，包括但不限于人类MIF(SEQ ID NO119)，大鼠MIF(SEQ ID NO120)或小鼠MIF(SEQ ID NO121)。SEQ ID NO122-124中示出了含有C末端氨基酸接头C1，C2或C3的人类MIF序列。图5B显示在还原条件下电泳并且用考马斯亮蓝染色的纯化MIF构建体的SDS-PAGE分析。凝胶上的加样是图5A中所示纯化的大鼠构建体rMIF-C1(SEQ ID NO114)，rMIF-C2(SEQ ID NO115)和rMIF-C3(SEQ ID NO117)。
实施例8RANKL的克隆、表达、纯化和偶联A.小鼠RANKL中含有半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，及其表达和纯化重组地表达带有N端接头的核因子κb受体活化因子配体(RANKL)(其也被命名为破骨细胞分化因子、骨保护素配体和肿瘤坏死因子相关活化诱导细胞因子)，其N末端接头含有一个半胱氨酸用于偶联VLP。
表达质粒的构建用oligo RANKL-UP和RANKL-DOWN，通过PCR扩增RANKL基因的C末端编码区。RANKL-UP有内部ApaI位点，RANKL-DOWN有内部XhoI位点。用ApaI和XhoI消化PCR产物，并且连接到pGEX-6p1(Amersham Pharmacia)中。由此得到的质粒命名为pGEX-RANKL。通过标准分子生物学方法进行所有这些步骤，并且验证该序列。质粒pGEX-RANKL编码谷胱甘肽S-转移酶-Prescission切割位点-含有半胱氨酸的氨基酸接头-RANKL的融合蛋白(GST-PS-C-RANKL)。含有半胱氨酸的氨基酸接头具有序列GCGGG。该构建体也含有6个组氨酸标签，该标签位于含有半胱氨酸的氨基酸接头和RANKL序列之间。
寡聚物RANKL-UP5’CTGCCAGGGGCCCGGGTGCGGCGGTGGCCATCATCACCACCATCACCAGCGCTTCTCAGGAG-3’(SEQ ID NO86)RANKL-DOWN5 5’-CCGCTCGAGTTAGTCTATGTCCTGAACTTTGAAAG-3’(SEQ ID NO87)GST-PS-C-RANKL的蛋白质序列和GST-PS-C-RANKL的cDNA序列C-RANKL的表达和纯化用质粒pGEX-RANKL转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在液体培养基(LB培养基，30μg/ml卡那霉素，50μg/ml氯霉素)中扩增来源于含有卡那霉素和氯霉素的琼脂平板的单菌落，并且在30℃，以220rpm振荡过夜温育。然后，用过夜培养物1∶100v/v接种1升LB(含有30μg/ml卡那霉素)，并且在24℃，培养到OD600＝1。用0.4mM IPTG.诱导表达。16小时后收集细胞，并且以5000rpm离心。在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH＝8；25％蔗糖；1mM EDTA，1％NaN3；10mM DTT；5mM MgCl2；1mg/ml溶菌酶；0.4u/ml DNA酶)中悬浮细胞沉淀30分钟。然后，添加2.5体积缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH＝8.0；1％Triton X100；100mM NaCl；0.1％NaN3；10mM DTT；1mM PMSF)，并且在37℃温育15分钟。超声处理细胞，并且以9000rpm沉淀15分钟。上清液立即用于GST亲和层析。
在PBS，pH 7.3(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4)中平衡5ml GST-Trap FF柱子(Amersham Pharmacia)。将上清液加样到5ml GST-Trap FF柱子上，随后用5柱体积的PBS洗柱子。用含有10mM GSH的50mM Tris-HCl，pH＝8.0洗脱蛋白质GST-PS-C-RANKL。
用蛋白酶PreScission(Amersham Pharmacia)消化纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白质。利用GST-PS-C-RANKL比PreScission为500/1的摩尔比率，在37℃消化1小时。
而且，利用HiPrep 26/10脱盐柱(Amersham Pharmacia)交换蛋白酶消化反应物的缓冲液，合并含有蛋白质的级分，并且利用前述相同的条件，立即将其用于另一个GST亲和层析步骤。在SDS-PAGE凝胶上分析C-RANKL的纯化。用考马斯亮蓝染色凝胶。切割的C-RANKL存在于直流物(未结合级分)中，而未切割的GST-PS-C-RANKL、切割的GST-PS和PreScission仍结合柱子。获得高纯度的22kDa期望大小的C-RANKL蛋白质。
凝胶上加样的样品如下泳道1低分子量标记物。泳道2和3用0.4mM IPTG诱导16小时后，分别用空载体pGEX6p1和pGEX-RANKL转化的BL21/DE3细胞的细胞裂解物上清液。泳道4GST-Trap FF柱子后纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白质。泳道5GST-Trap FF柱子未结合的级分。泳道6用PreScission蛋白酶切割后纯化的GST-PS-C-RANKL蛋白质。泳道7加样有GST-RANKL消化物的GST-Trap FF柱子的未结合的级分，其含有纯化的C-RANKL。泳道8加样有GST-PS-C-RANKL消化物并且用GSH洗脱的GST-Trap FF柱子的结合级分。
B.C-RANKL与AP205 VLP的偶联在25℃，在摇边振荡器上，在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM AP205 VLP溶液与25倍摩尔过量SMPH(Pierce)(从DMSO中的母液稀释)反应30分钟。随后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析反应溶液2次2小时。然后，在25℃，在摇动振荡器上，透析的AP205 VLP反应混合物与C-RANKL溶液(终浓度60μM AP205VLP，60μM C-RANKL)反应4小时。在还原条件下，通过SDS-PAGE和Western印迹分析偶联产物。
实施例9IL-5(具有包含半胱氨酸残基的N末端氨基酸接头)的克隆、表达和纯化，与VLP的偶联和小鼠中免疫应答的引发A.小鼠His-C-IL-5的克隆和在大肠杆菌中表达为包函体利用下面两个引物Spelinker3-F1(SEQ ID NO90)和I15StopXho-R(SEQ ID NO91)，通过PCR从ATCC克隆(pmIL5-4G；ATCC号37562)扩增IL-5。该PCR产物用做第二PCR的模板，利用引物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO92)和Il5StopXho-R扩增。用SpeI和NotI消化插入片段。将该插入片段连接到先前用NheI和NotI消化的pET载体衍生物(pMODEC3-8载体)中，并且转化到大肠杆菌TG1细胞中。通过将IL-5克隆到pMODEC3-8中产生的构建体从其N末端起包含6个组氨酸标签(有利于纯化)、肠激酶切割位点、含有半胱氨酸残基的γ3衍生的氨基酸接头(N末端侧翼为氨基酸ALV，C末端侧翼为AS)和编码成熟形式IL-5蛋白质的DNA。通过DNA测序证实克隆方法的忠实性。通过用肠激酶切割释放的蛋白质称为“小鼠C-IL-5-E”。
上述含有IL-5的构建体命名为pMODC6-IL5.2(也称为pMODC6-IL5)，并且将其转化到大肠杆菌株系BL21-DE3中。大肠杆菌中表达的重组蛋白质命名为His-C-IL5。
在含有1mg/L氨苄青霉素的5ml LB中过夜培养含有pMODC6-IL5的克隆BL21-DE3细胞。将该培养物的2ml等份试样稀释到含有1mg/L氨苄青霉素的100ml Terrific肉汤(TB)中。将该培养物培养到0.7-1.0 OD600的光密度，并且通过添加0.1ml 1.0M异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)母液诱导表达4小时。每2小时取一次样品。重组His-C-IL5以不溶形式表达，并且位于所诱导细胞的包函体级分中。用下面的方法证实His-C-IL5的表达。诱导后4小时取10ml培养物样品，并且以4000xg离心10分钟。在组成为50mM Tris-HCl、2mM EDTA、0.1％Triton X-100(pH 8.0)的0.5ml裂解缓冲液中悬浮沉淀。向悬浮液添加20μl溶菌酶(40mg/ml)，30分钟后，在4℃超声处理2分钟。添加1ml等份的benzonase和100μl等份的50mM MgCl2，并且在室温下温育30分钟。以13000xg离心15分钟后，弃去上清液，在100μl SDS加样缓冲液中，在98℃加热沉淀5分钟。然后，在还原条件下，通过SDS-PAGE分析此10μl的等份试样。SDS-PAGE分析证明了对应于IL-5质量的17kDa蛋白质条带。做为对照，在没有IPTG的情况下，培养含有pMODC6-IL5的BL21-DE2细胞，并且如上所述，从不溶细胞级分制备提取物。
B.小鼠His-C-IL5的纯化和重折叠在BL21-DE3细胞中自克隆pMODC6-IL5大规模表达IL5，以获得足够量的纯IL-5用于疫苗生产。过夜培养培养物，并且稀释到含有1.0mg/L氨苄青霉素的100ml或1L体积的TB培养基中。由此，制备总计3升培养物，并且在37℃培养直到OD600达到0.7，这时添加IPTG至1.0mM的终浓度。4小时孵育后，通过在10000xg离心30分钟收集细胞。收集后，在PBS中重悬浮沉淀(5.0ml/g湿重)，并且以10000xg离心15分钟。使用前在-20℃贮藏该洗过的沉淀。
利用Dounce匀浆器，在PBS中悬浮细菌沉淀(2.0ml/g细胞湿重)。向悬浮液添加溶菌酶(0.8mg/ml)，并且在室温下温育30分钟。在冰上超声处理悬浮液1分钟，3次，然后添加benzonase和MgCl2(10mM的终浓度)，并且在室温下温育30分钟。添加Triton X-100至1％(w/v)终浓度，混合物在室温下轻轻搅拌30分钟。在20000xg离心溶液20分钟(SS34管)，弃去上清液。利用Dounce匀浆器在洗涤缓冲液(含有2M尿素和1％(w/v)Triton X-100的PBS)中悬浮含有包函体的沉淀(5.0ml/g湿重)，并且搅拌5分钟。在20000xg离心溶液20分钟，并且弃去上清液。如上所述，再洗涤和离心沉淀2次。在不存在Triton X-100的情况下，用洗涤缓冲液进行最后的包函体洗涤。
在变性缓冲液(100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，6.0M盐酸胍，pH 8.0)中溶解沉淀的包函体中存在的His-C-IL-5(5.0ml/g细胞湿重)，并且在25℃轻轻搅拌1小时。在20000xg离心悬浮液20分钟，并且混合上清液和Ni-NTA树脂(QIAgen，用溶解缓冲液平衡)。在4℃轻轻搅拌3小时后，将浆液倾倒到玻璃柱子(C10/10)中，并且用100ml的100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0M盐酸胍(pH 6.3)洗树脂。用15ml的100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0M盐酸胍(pH 5.9)进行额外的洗涤步骤。通过施用20ml的100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0 M盐酸胍(pH 4.5)从树脂洗脱小鼠His-C-IL-5。通过SDS-PAGE分析纯化。
合并从洗脱步骤得到的含有His-C-IL-5的级分，并且在4℃利用10kDa截断膜，利用包含8.0M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液透析。透析后，利用下面公式蛋白质(mg/ml)＝(1.55×A280nm)-(0.76×A260nm)，分光光度法测定蛋白质浓度。用透析缓冲液将蛋白质浓度稀释到0.2mg/ml。然后，在4℃，利用含有2.0M尿素，50mM NaH2PO4，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％(v/v)甘油的重折叠缓冲液1(pH 8.5)，用3.5kDa膜透析该溶液24小时，并且利用含有50mM NaH2PO4，5mM还原的谷胱甘肽，0.5mM氧化的谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％(v/v)甘油的重折叠缓冲液2(pH 8.5)再透析24小时。最后，在4℃，利用PBS，pH8.0透析蛋白质24小时，然后在10000xg离心30分钟。通过Bradford测定法估测上清液的蛋白质含量。
为了进一步纯化His-C-IL5，用Hitrap Q树脂(Amersham Pharmacia，Uppsala Sweeden)进行阴离子交换。利用Centrifugal Filter (Ultrafree-15Millipore，10kDa截断值)将His-C-IL5浓缩到1mg/ml，利用50mM磷酸缓冲液，pH 8.4透析14小时。将溶液加样到Hitrap Q柱子上，并且用50mM磷酸缓冲液，pH 8.4洗涤。通过施用从0-1M的NaCl梯度，从柱子洗脱His-C-IL5。在100mM NaCl从柱上洗脱His-C-IL5。通过SDS-PAGE进行纯化分析，并且通过Bradford测定法测定浓度。通过在非还原条件下进行的SDS-PAGE估测蛋白质的四级结构，其表明His-C-IL5以二聚体形式存在于制备物中。
C.疫苗生产His-C-IL5与AP205 VLP的偶联可以试验各种条件以优化偶联反应的效率。这些条件包括向His-C-IL5添加还原剂(TCEP)和改变偶联反应中AP205 VLP亚单位单体和His-C-IL5的摩尔比。如下所述产生AP205-His-C-IL5疫苗。在pH8.0 PBS中，用等摩尔量的TCEP还原纯化的His-C-IL5(40μM)1小时。在22℃，在总体积700μl中，还原的IL-5(20μM)与10μM用SMPH衍生的Qβ温育4小时。利用300kDa截断透析膜，利用pH8.0的PBS，透析该反应物12小时。用抗His和抗AP205的抗体(多克隆兔抗血清)，通过SDS-PAGE和Western印迹分析偶联反应。通过Bradford测定蛋白质浓度。通过对考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE上相应条带的光密度分析，测定偶联效率[即，Qβ-IL5摩尔数/Qβ单体摩尔数(总)]。
D.IL-5活性测定B细胞淋巴瘤系BCL1应答鼠IL-5增殖的能力用于检查重折叠的重组His-C-IL5的生物学活性(Harriman G.R.(1991)Current Protocols inImmunology 6.5.1-6.5.5 John Wiley and Sons Inc)。也可以估测共价偶联AP205 VLP的His-C-IL5的增殖活性。重组鼠IL-5(R&D systems，Minneapolis USA)用做对照。在平底96孔板中以每孔2×104BCL1细胞，温育各种形式的重组IL-5，并且在37℃，5％CO2下温育24小时。向每个孔添加1μCi3H-胸腺嘧啶脱氧核苷(Hartmann Analytic，Switzerland)，并且在37℃，5％CO2下温育平板另外6小时。收获并洗涤细胞，并且通过用液体闪烁计数仪计数β发射测定胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入。该试验证明了His-C-IL5是活性的。
E.免疫方案为了产生针对小鼠IL-5的自身反应性抗体，在第0和14天，用200μlPBS中25μg AP205-His-C-IL5疫苗皮下注射4只BalbC小鼠。作为阴性对照，在第0和14天，用PBS中不共价偶联的6.4μg AP205 VLP和16μgIL5(AP205+His-C-IL-5)的简单混合物免疫5只小鼠。免疫前和在免疫方案的第21天从小鼠取血。通过ELISA分析血清。
F.血清分析ELISA在4℃，用50μl纯化His-C-IL-5(3μg/ml)包被Maxisorp ELISA板(Nunc)。用PBS洗该板3次，并且在37℃，用PBS中2％BSA封闭该板2小时，然后用PBS洗两次。在含有2％BSA和0.1％FCS的PBS中添加5倍稀释的血清，并且在室温下温育1小时。随后，用PBS洗该板3次，并且室温下与缀合HRP的抗小鼠IgG(1∶1000稀释度)温育1小时。用PBS再次洗该板3次，并且添加100μl/孔的显影溶液(0.066M Na2HPO4，0.035M柠檬酸，0.032％H2O2，0.4％1，2-苯二胺二盐酸盐)。在室温下反应5分钟后，用5μl/孔5％H2SO4终止ELISA。在Spectramax分光光度计(Molecular Devices)上，在450nm测定吸光度。
实施例10小鼠朊病毒蛋白的克隆、表达和偶联A.截短形式的小鼠朊病毒蛋白中含有半胱氨酸残基的氨基酸接头的引入，及其表达和纯化重组地表达小鼠朊病毒蛋白(称为mPrPt)的截短形式(氨基酸121-230)，其具有融合在其C末端用于偶联AP205 VLP的GGGGCG氨基酸接头(SEQ ID NO55)。蛋白质与人Fc片段的N端融合以便纯化。EK切割位点后引入肠激酶(EK)切割位点以在纯化后切下融合蛋白质的Fc部分。
mPrPt-EK-Fc*的构建利用质粒pBPCMVPrP-Fc做为模板，用引物5’PrP-BamHI和3’PrP-NheI，通过PCR扩增小鼠PrPt。pBPCMVPrP-Fc含有小鼠朊病毒蛋白野生型序列。5’PrP-BamHI有内部BamHI位点并含有ATG，3’PrP-NheI有内部NheI位点。
对于PCR反应，在50μl反应混合物(1单位PFX Platinum聚合酶，0.3mM dNTPs和2mM MgSO4)中使用每种引物各0.5μg和200ng模板DNA。温度循环如下94℃，2分钟，接着94℃(15秒)、50℃(30秒)、68℃(45秒)共5个循环，接着94℃(15秒)、64℃(30秒)、68℃(45秒)共20个循环，接着68℃，10分钟。
用BamHI和NheI消化PCR产物，并且插入到在EK切割序列5’末端含有GGGGCG接头序列(SEQ ID NO55)的pCEP-SP-EK-Fc*中。由此得到的质粒命名为pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*。
通过标准分子生物学方法进行所有其它步骤。
寡聚物引物5’PrP-BamHI5′-CGG GAT CCC ACC ATG GTG GGG GGC CTT GG-3′(SEQ IDNO88)引物3’PrP-NheI5′-CTA GCT AGC CTG GAT CTT CTC CCG-3′(SEQ ID NO89)mPrPt-EK-Fc*的表达和纯化如实施例4中所述，将质粒pCEP-SP-mPrPt-EK-Fc*转染到293-EBNA细胞(Invitrogen)中，并且在蛋白质A-Sepharose柱上纯化。切割后，mPrPt具有SEQ ID NO324中所标识的序列(在其C末端具有GGGGCG接头)。用肠激酶切割纯化的融合蛋白质mPrPt-EK-Fc*，并且在肠激酶切割前和后，在还原条件下在16％SDS-PAGE上分析。用考马斯亮蓝染色凝胶。可以检测到mPrPt-EK-Fc*融合蛋白为50kDa条带。可以检测到含有融合在其C末端的GGGGCG氨基酸接头(SEQ ID NO55)的切割的mPrPt蛋白质，为18至25kDa的宽带。通过Western印迹证实mPrPt的身份(未示出数据)。因此，可以表达和纯化具有含有半胱氨酸残基的C末端氨基酸接头的mPrPt，以用于偶联AP205 VLP。
加样在凝胶上的样品如下泳道1分子量标记物。泳道2切割前的mPrPt-EK-Fc*。泳道3切割后的mPrPt。
B.mPrPt与AP205 VLP的偶联在25℃，在摇动振荡器上，在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的120μM AP205 VLP溶液与25倍摩尔过量SMPH(Pierce)(从DMSO中的母液稀释)反应30分钟。随后，在4℃，利用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析反应溶液2次2小时。然后，在25℃，在摇动振荡器上，透析的AP205 VLP反应混合物与mPrPt溶液(终浓度60μM AP205 VLP，60μM mPrPt)反应4小时。在还原条件下，通过SDS-PAGE和Western印迹分析偶联产物。
实施例11rMIF与AP205 VLP的偶联如实施例7中所述表达和纯化的RMIF-C1(SEQ ID NO114)在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的0.18mM溶液，在偶联反应中使用以前，在室温下与1摩尔当量的TCEP温育1小时。在室温下，2.5mg/ml的1ml AP205 VLP溶液与2.3倍摩尔过量的SMPH反应1小时。利用2升20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2，透析衍生的AP205 VLP 2次，2小时。随后，在室温下，820μl透析的衍生AP205 VLP(0.18mM)与上述先已用TCEP处理的820μl 0.18mM rMIF-C1溶液反应3小时。在偶联反应最后没有观察到沉淀，并且在还原条件下，通过SDS-PAGE分析样品，用考马斯亮蓝染色凝胶。图6中示出了偶联反应的结果。MIF分子量是，而AP205VLP亚单位分子量是14kDa，而rMIF-C1分子量是13。如图6中所示，偶联产物如所预期的迁移，具有表观分子量27。
图6显示rMIF-C1与AP205 VLP偶联反应的结果。泳道1分子标记物。泳道2AP205 VLP。泳道3衍生的AP205 VLP。泳道4透析后衍生的AP205 VLP。泳道5透析后衍生的AP205 VLP。泳道6rMIF-C1与AP205 VLP的偶联反应。在图中用箭头标明了偶联产物。在凝胶左侧边缘标出了标记蛋白质的分子量。
实施例12用偶联AP205 VLP的rMIF免疫小鼠和大鼠A.用偶联rMIF-C1的AP205 VLP免疫小鼠在第0和14天，给雌性Balb/c小鼠(3只小鼠)皮下注射偶联rMIF-C1的AP205 VLP(来源于实施例11)。用在PBS中稀释到200μl的10μg疫苗免疫每只小鼠。在21天，从小鼠眶后取血，如下所述，在对rMIF-C1特异的ELISA中测定对rMIF-C1特异的抗体效价。
用rMIF-C1以5μg/ml的浓度包被ELISA平板。封闭该板，然后与系列稀释的小鼠血清温育。用酶学标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。做为对照，也检测了相同小鼠免疫前的血清。
用偶联AP205 VLP的rMIF-C1免疫导致了抗rMIF-C1的强特异性免疫应答(图7)，由此，3只小鼠抗rMIF-C1的平均效价是1∶31000(该效价定义为产生半最大OD值的血清稀释度)。因此rMIF-C1正确地展示在AP205 VLP上，并且可接近免疫系统以产生强免疫应答。
图7所示是在用偶联AP205 VLP的rMIF-C1免疫的小鼠血清中，通过ELISA对rMIF-C1特异的IgG应答的分析。一式两份地进行第21天3只小鼠(M1，M2和M3)血清的分析。向孔中施加3倍稀释度的血清。“preimm”代表随后用偶联AP205 VLP的rMIF-C1免疫的1只小鼠在免疫前的血清。
B.用偶联rMIF-C1的AP205 VLP免疫大鼠在没有佐剂的情况下，在第0和28天，给大鼠(每次3只)皮下注射偶联rMIF-C1的AP205 VLP(来源于实施例12)。用在PBS中稀释到200μl的50μg疫苗免疫每只大鼠。在第42天从大鼠取血，并且如上所述(除了利用酶学标记的抗大鼠IgG第二抗体)，在对rMIF-C1特异的ELISA中测定对rMIF-C1特异的抗体效价。
实施例13Angio I肽与AP205 VLP的偶联和小鼠的免疫A.Angio I肽与AP205 VLP的偶联化学合成Angio I肽，其具有在其N末端与接头序列CGG融合的血管紧张肽II序列(DRVYIHPF)(SEQ ID NO13)，该接头序列含有半胱氨酸残基用于偶联活化的VLP。将按照实施例2中所述表达和纯化的AP205VLP重新溶解在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2缓冲液(HBS缓冲液)中。然后，在室温(RT)下，重溶解的AP205 VLP以2mg/ml的浓度(在Bradford测定法中测定)与1.43mM SMPH(Pierce)反应30分钟。然后，在4℃，用HBS缓冲液透析反应混合物2次2小时，并且与1.144mM AngioI肽(序列CGGDRVYIHPF(SEQ ID NO12)，游离的胺和游离的酸)(DMSO中的50mM母液在反应混合物中稀释)反应。在15℃，使偶联反应进行2小时，利用1000倍体积HBS透析反应混合物2×2小时，并且将等份试样在液氮中急骤冷冻，使用前贮藏在-80℃。
融化等份反应混合物，并且通过SDS-PAGE分析抗原和AP205亚单位的偶联，并在Bradford测定法中测定蛋白质浓度。肽和AP205 VLP的偶联效率(定义为相应于每个单体亚单位偶联1，2或3个肽的条带的强度总和除以偶联和未偶联的AP205单体亚单位总和)是88％。如测定偶联效率一样相似地测定表位密度，修改之处是在分数的分子中，偶联条带的强度乘以各个条带中每个亚单位偶联的肽的个数。表位密度是每个AP205VLP亚单位为1.6 Angio I肽。
B.用偶联Angio I肽的AP205 VLP免疫小鼠在没有佐剂的情况下，在第0和14天，给3只小鼠皮下注射如A部分中所述产生的偶联Angio I肽的AP205 VLP。用在PBS中稀释到200μl的25μg疫苗免疫每只小鼠。在第21天从小鼠眶后取血，通过ELISA测定对Angio I肽特异的抗体效价。利用化学交联剂磺基-SPDP，使Angio I肽偶联牛RNA酶A。以10μg/ml的浓度，用偶联Angio I的RNA酶包被ELISA板。封闭该平板，然后与系列稀释的小鼠血清温育。用酶学标记的抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。做为对照，也检测了相同小鼠免疫前的血清。结果如图8所示。
图8显示在第0和14天免疫的3只小鼠(1-3)血清中，对Angio I肽特异的IgG抗体的ELISA分析，其中小鼠用与AP205 VLP偶联的AngioI肽免疫。在第21天血清中测定总IgG效价。在所分析的免疫前血清中没有检测到对Angio I特异的抗体。获得了抗Angio I的平均1∶69000的非常高特异性效价(表示为在450nm，产生半最大OD值的稀释度)，证明已经破坏了对于Angio I(小鼠中自身肽)的自身耐受性。该数据证明抗原和AP205 VLP偶联后可以获得具有非常高度的肽展示的疫苗。该数据也证明当将自身抗原与AP205 VLP偶联，并且随后在没有佐剂的情况下用所获得的疫苗进行免疫，可以获得抗这些自身抗原的非常高的效价。
为了澄清理解的目的，通过示例和实施例的方式，现在已经相当详细地全面描述了本发明，对本领域普通技术人员而言显而易见，在广泛的等同条件、方式和其它参数范围内可以修改或改变本发明，而不影响本发明范围和其任何特定实施方式，并且所附权利要求的范围意欲包括这些修改或改变。
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序列表<110> 希托斯生物技术股份公司(Cytos Biotechnology AG)<120> 使用衍生自AP205外壳蛋白的病毒样颗粒的分子抗原阵列<130> C62336PC<150> US 60/396,126<151> 2002-07-17<160> 125<170> PatentIn version 3.2<210> 1<211> 131<212> PRT<213> 噬菌体AP205<400> 1Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210> 2<211> 3635<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 质粒，pAP283-58，编码RNA 噬菌体AP205外壳蛋白<400> 2cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga 120ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt 180gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt 240taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg 300tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca 360atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg 420ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt 480ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata 540gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc 600taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc 660atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg 720taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc 780agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg 840gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 900gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 960tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg1020gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg atatggtgca ctctcagtac1080aatctgctct gatgccgcat agttaagcca actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg1140gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg1200gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca1260ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat1320ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg1380gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc1440tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta1500ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg1560ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg1620gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac1680
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg1740acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt1800actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg1860ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac1920cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt1980gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag2040caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc2100aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc2160ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta2220tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg2280ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga2340ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac2400ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa2460tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat2520cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc2580taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg2640gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc2700acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg2760ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg2820ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa2880cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg2940aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga3000gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct3060gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca3120gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc3180ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg3240ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc3300caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca3360tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct3420ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa3480ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac3540
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag3600tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 3635<210> 3<211> 131<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 噬菌体AP205突变体<400> 3Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210> 4<211> 3613<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 质粒pAP281-32<400> 4
cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga 60gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag 120acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta 180tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg 240aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accggaaggt 300tgtgcagatg cctgtgtcat tatgccgaat gaaaaccaat ccattcgcac agtgatttca 360gggtcagccg aaaacttggc taccttaaaa gcagaatggg aaactcacaa acgtaacgtt 420gacacactct tcgcgagcgg caacgccggt ttgggtttcc ttgaccctac tgcggctatc 480gtatcgtctg atactactgc ttaagcttgt attctatagt gtcacctaaa tcgtatgtgt 540atgatacata aggttatgta ttaattgtag ccgcgttcta acgacaatat gtacaagcct 600aattgtgtag catctggctt actgaagcag accctatcat ctctctcgta aactgccgtc 660agagtcggtt tggttggacg aaccttctga gtttctggta acgccgttcc gcaccccgga 720aatggtcacc gaaccaatca gcagggtcat cgctagccag atcctctacg ccggacgcat 780cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac 840cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat 900ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct 960tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc1020gcataaggga gagcgtcgat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag1080ttaagccaac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa1140cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg1200tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga1260ggcagcttga agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat1320aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat1380ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata1440aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct1500tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa1560agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa1620cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt1680taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg1740tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca1800tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa1860
cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt1920gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc1980cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa2040actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga2100ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc2160tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga2220tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga2280acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga2340ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat2400ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt2460ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct2520gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc2580ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc2640aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc2700gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc2760gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg2820aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata2880cctacagcgc gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta2940tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc3000ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg3060atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt3120cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt3180ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga3240gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc3300cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg tggtgtcatg gtcggtgatc gccagggtgc3360cgacgcgcat ctcgactgca tggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag3420ctgtggtatg gccgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact3480cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa3540tgagctgttg acaattaatc atcgaactag ttaactagta cgcaagttca cgtaaaaagg3600gtatcgcgga att 3613<210> 5
<211> 57<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 含有推定的AP205核糖体结合位点的序列<400> 5tctagaattt tctgcgcacc catcccgggt ggcgcccaaa gtgaggaaaa tcacatg57<210> 6<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 载体pQb185的Shine-Dalgarno序列<400> 6tctagattaa cccaacgcgt aggagtcagg ccatg35<210> 7<211> 42<212> PRT<213> 人(Homo sapiens)<400> 7Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210> 8<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Aβ 1-15 GGC<400> 8Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Gly1 5 10 15Gly Cys
<210> 9<211> 30<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Aβ 1-27 GGC<400> 9Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Gly Gly Cys20 25 30<210> 10<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Aβ 33-42突变体<400> 10Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile1 5 10 15Ala<210> 11<211> 14<212> PRT<213> 人<400> 11Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Val Ile His Asn1 5 10<210> 12<211> 10<212> PRT<213> 人<400> 12Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210> 13<211> 8<212> PRT
<213> 人<400> 13Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5<210> 14<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CGG-血管紧张肽I<400> 14Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe1 5 10<210> 15<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CGG-血管紧张肽I肽<400> 15Cys Gly Gly Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu1 5 10<210> 16<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 血管紧张肽-I GGC肽<400> 16Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His Leu Gly Gly Cys1 5 10<210> 17<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″cprplong″<400> 17
Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg20 25<210> 18<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″cprpshort″<400> 18Cys Gly Asn Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg1 5 10 15<210> 19<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒蛋白″人cprplong″<400> 19Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg20 25<210> 20<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″人cprpshort″<400> 20Cys Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg1 5 10 15<210> 21<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″牛cprplong″<400> 21Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Asn Asp Tyr Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg20 25<210> 22<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″牛cprpshort″<400> 22Cys Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg1 5 10 15<210> 23<211> 26<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″绵羊cprplong″<400> 23Cys Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Asn Asp Tyr Glu1 5 10 15Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg20 25<210> 24<211> 16<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 朊病毒肽″绵羊cprpshort″<400> 24Cys Gly Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg1 5 10 15<210> 25<211> 14
<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 鼠TNF-α突变体<400> 25Cys Gly Gly Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg1 5 10<210> 26<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 鼠TNF-α突变体<400> 26Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15His Gly Val Gly Gly Cys20<210> 27<211> 20<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 鼠TNF-α突变体肽<400> 27Cys Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala1 5 10 15Asn His Gly Val20<210> 28<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人TNF-α肽突变体<400> 28Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15
Pro Gln Ala Glu Gly Gln20<210> 29<211> 11<212> PRT<213> 人<400> 29Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala1 5 10<210> 30<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CGG-IgE肽突变体<400> 30Cys Gly Gly Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210> 31<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模拟表位<400> 31Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5<210> 32<211> 8<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模拟表位<400> 32Arg Asn His Arg Gly Tyr Trp Val1 5<210> 33
<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模拟表位<400> 33Arg Ser Arg Ser Gly Gly Tyr Trp Leu Trp1 5 10<210> 34<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> IgE模拟表位<400> 34Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210> 35<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3表位<400> 35Val Asn Leu Pro Trp Ser Arg Ala Ser Gly1 5 10<210> 36<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3表位<400> 36Val Asn Leu Thr Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210> 37<211> 10<212> PRT<213> 人工序列
<220>
<223> CeH3表位<400> 37Val Asn Leu Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210> 38<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 38Val Asn Arg Pro Trp Ser Phe Gly Leu Glu1 5 10<210> 39<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 39Val Lys Leu Pro Trp Arg Phe Tyr Gln Val1 5 10<210> 40<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 40Val Trp Thr Ala Cys Gly Tyr Gly Arg Met1 5 10<210> 41<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 41
Gly Thr Val Ser Thr Leu Ser1 5<210> 42<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 42Leu Leu Asp Ser Arg Tyr Trp1 5<210> 43<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 43Gln Pro Ala His Ser Leu Gly1 5<210> 44<211> 7<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 44Leu Trp Gly Met Gln Gly Arg1 5<210> 45<211> 15<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 45Leu Thr Leu Ser His Pro His Trp Val Leu Asn His Phe Val Ser1 5 10 15
<210> 46<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 46Ser Met Gly Pro Asp Gln Thr Leu Arg15<210> 47<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 47Val Asn Leu Thr Trp Ser1 5<210> 48<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> CeH3模拟表位<400> 48Gly Glu Phe Cys Ile Asn His Arg Gly Tyr Trp Val Cys Gly Asp Pro1 5 10 15Ala<210> 49<211> 5<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 甘氨酸丝氨酸接头<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(5)<223> 这些残基作为一组可以重复零次至任何次数
<400> 49Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210> 50<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端γ1接头<400> 50Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro1 5 10<210> 51<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端γ1接头<400> 51Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys1 5<210> 52<211> 17<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端γ3接头<400> 52Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala1 5 10 15Pro<210> 53<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端γ3接头
<400> 53Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210> 54<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸接头<400> 54Gly Cys Gly Gly Gly Gly1 5<210> 55<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸接头<400> 55Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5<210> 56<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸-赖氨酸接头<400> 56Gly Gly Lys Lys Gly Cys1 5<210> 57<211> 6<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸-赖氨酸接头
<400> 57Cys Gly Lys Lys Gly Gly1 5<210> 58<211> 4<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端接头<400> 58Gly Gly Cys Gly1<210> 59<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.44引物<400> 59aaccatggca aataagccaa tgcaa 25<210> 60<211> 30<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.45引物<400> 60aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg 30<210> 61<211> 31<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.46引物<400> 61aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac g31<210> 62<211> 43<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> p1.47引物<400> 62gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg43<210> 63<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> p1.4 8引物<400> 63cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc43<210> 64<211> 21<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Derp1 117-137肽突变体<400> 64Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn Lys Ile Arg Glu Ala Leu Ala1 5 10 15Gln Thr His Ser Ala20<210> 65<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Flag<400> 65Cys Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5 10<210> 66<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 5′LT-b引物
<400> 66cttggtgccg caggatcag19<210> 67<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 3′LT-b引物<400> 67cagatggctg tcaccccac 19<210> 68<211> 37<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 5′LT-blong-NheI引物<400> 68gcccgctagc ctgcggtggt caggatcagg gacgtcg 37<210> 69<211> 37<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 5′LT-sbhort-NheI引物<400> 69gcccgctagc ctgcggtggt tctccagctg cggattc 37<210> 70<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 3′LT-bstop-NotI引物<400> 70caatgactgc ggccgcttac cccaccatca ccg 33<210> 71<211> 74<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pET22b(+)载体的MCS
<400> 71gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg gatccggcta gcgctcgagg gtttaaacgg60cggccgcatg cacc 74<210> 72<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物MCS-1F<400> 72tatggatccg gctagcgctc gagggtttaa acggcggccg cat 43<210> 73<211> 45<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物MCS-1R<400> 73tcgaatgcgg ccgccgttta aaccctcgag cgctagccgg atcca 45<210> 74<211> 58<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Bamhis6-EK-Nhe-F引物<400> 74gatccacacc accaccacca ccacggttct ggtgacgacg atgacaaagc gctagccc 58<210> 75<211> 58<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Bamhis6-EK-Nhe-R<400> 75tcgagggcta gcgctttgtc atcgtcgtca ccagaaccgt ggtggtggtg gtggtgtg 58<210> 76<211> 42<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> oligo1F-C-甘氨酸-接头<400> 76tcgagggtgg tggtggtggt tgcggttaat aagtttaaac gc 42<210> 77<211> 42<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1R-C-甘氨酸-接头<400> 77ggccgcgttt aaacttatta accgcaacca ccaccaccac cc 42<210> 78<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1F-C-γ1-接头<400> 78tcgaggataa aacccacacc tctccgccgt gtggttaata agtttaaacg c51<210> 79<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1R-C-γ1-接头<400> 79ggccgcgttt aaacttatta accacacggc ggagaggtgt gggttttatc c51<210> 80<211> 36<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo1FA-C-γ3-接头<400> 80tcgagccgaa accgtctacc ccgccgggtt cttctg 36<210> 81<211> 38<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> oligo1RA-C-γ3-接头<400> 81caccaccaga agaacccggc ggggtagacg gtttcggc 38<210> 82<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo2FB-C-γ3-接头<400> 82gtggtgctcc gggtggttgc ggttaataag tttaaacgc39<210> 83<211> 37<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> oligo2RB-C-γ3-接头<400> 83ggccgcgttt aaacttatta accgcaacca cccggag 37<210> 84<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> rMIF-F<400> 84ggaattccat atgcctatgt tcatcgtgaa cac 33<210> 85<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> rMIF-Xho-R<400> 85cccgctcgag agcgaaggtg gaaccgttc29<210> 86<211> 62<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> RANKL-UP寡核苷酸<400> 86ctgccagggg cccgggtgcg gcggtggcca tcatcaccac catcaccagc gcttctcagg 60ag 62<210> 87<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> RANKL-DOWN 寡核甘酸<400> 87ccgctcgagt tagtctatgt cctgaacttt gaaag 35<210> 88<211> 29<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物5′PrP-BamHI<400> 88cgggatccca ccatggtggg gggccttgg 29<210> 89<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物3′PrP-NheI<400> 89ctagctagcc tggatcttct cccg 24<210> 90<211> 55<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物Spelinker3-F1<400> 90ccccgccggg ttcttctggc ggtgctccgg ctagcatgga gattcccatg agcac 55<210> 91<211> 49<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 引物IL5StopXho-R<400> 91ttttgcggcc gcgtttaaac tcgagttatt agccttccat tgcccactc 49<210> 92<211> 52<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 引物SpeNlinker3-F2<400> 92ttttactagt tggttgcggc ggcccgaaac cgagcacccc gccgggttct tc 52<210> 93<211> 3<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸接头<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重复零次至5次<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(3)<223> 甘氨酸可以重复零次至12次<400> 93Gly Cys Gly1<210> 94<211> 9<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> N-端甘氨酸-丝氨酸接头<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重复零次至5次
<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(3)<223> 甘氨酸可以重复零次至10次<220>
<221> REPEAT<222> (4)..(4)<223> 丝氨酸可以重复零次至2次<220>
<221> REPEAT<222> (5)..(9)<223> 这些残基作为一组可以重复零次至3次<400> 94Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210> 95<211> 3<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸接头<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重复零次至12次<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(3)<223> 甘氨酸可以重复零次至5次<400> 95Gly Cys Gly1<210> 96<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-端甘氨酸-丝氨酸接头<220>
<221> REPEAT<222> (1)..(1)<223> 甘氨酸可以重复零次至10次
<220>
<221> REPEAT<222> (2)..(2)<223> 丝氨酸可以重复零次至2次<220>
<221> REPEAT<222> (3)..(7)<223> 这些残基作为一组可以重复零次至3次<220>
<221> REPEAT<222> (8)..(8)<223> 甘氨酸可以重复零次至8次<220>
<221> REPEAT<222> (10)..(10)<223> 甘氨酸可以重复零次至5次<400> 96Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly1 5 10<210> 97<211> 23<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-Der p1肽突变体<400> 97Cys Gly Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys1 5 10 15Ala Ser Gln His Gly Cys His20<210> 98<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-血管紧张肽I肽<400> 98Cys Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe His1 5 10<210> 99<211> 26
<212> PRT<213> 人<400> 99Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu1 5 10 15Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys20 25<210> 100<211> 23<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C TNF-a肽突变体<400> 100Cys Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala15 10 15Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln20<210> 101<211> 25<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> TNF-a-C突变体<400> 101Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn1 5 10 15Pro Gln Ala Glu Gly Gln Gly Gly Cys20 25<210> 102<211> 14<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> C-TNF-a突变体<400> 102Cys Gly Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala
1 5 10<210> 103<211> 745<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pCep-Xa-Fc*<220>
<221> CDS<222> (1)..(741)<400> 103gat cca gca gct ggg ctc gag gtg cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg 48Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15atc gaa ggt cgc aag ctt act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 96Ile Glu Gly Arg Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag144Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys35 40 45gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg192Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val50 55 60gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac240Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp65 70 75 80ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac288Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr85 90 95aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac336Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp100 105 110tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc384Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu115 120 125cca gcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga432Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg130 135 140gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag480Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys145 150 155 160aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac528Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp165 170 175atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag576
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys180 185 190acc acg cct ccc gtg ttg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc624Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser195 200 205aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca672Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser210 215 220tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc720Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser225 230 235 240ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tgac745Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245<210> 104<211> 247<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> pCep-Xa-Fc*<400> 104Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15Ile Glu Gly Arg Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys35 40 45Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val50 55 60Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp65 70 75 80Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr85 90 95Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp100 105 110Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu115 120 125
Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg130 135 140Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys145 150 155 160Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp165 170 175Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys180 185 190Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser195 200 205Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser210 215 220Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser225 230 235 240Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245<210> 105<211> 96<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pCep-EK-Fc*<220>
<221> CDS<222> (1)..(96)<400> 105gat cca gca gct ggg ctc gag gtg cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg 48Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15gac gat gac gac aag ctt act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct 96Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30<210> 106<211> 32<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> pCep-EK-Fc*<400> 106Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly1 5 10 15Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro20 25 30<210> 107<211> 144<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> pCep-SP-EK-Fc*<220>
<221> CDS<222> (1)..(141)<400> 107atg gag aca gac aca ctc ctg cta tgg gta ctg ctg ctc tgg gtt cca 48Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15ggt tcc act ggt gac gcg gat cca gca gct ggg ctc gag gtg cta gcg 96Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala20 25 30gga ggg ggt gga tgt ggg gac gat gac gac aag ctt act cac aca tgc 144Gly Gly Gly Gly Cys GlV Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr35 40 45<210> 108<211> 47<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> pCep-SP-EK-Fc*<400> 108Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp Pro Ala Ala Gly Leu Glu Val Leu Ala20 25 30Gly Gly Gly Gly Cys Gly Asp Asp Asp Asp Lys Leu Thr His Thr35 40 45
<210> 109<211> 399<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-Xa<220>
<221> CDS<222> (10)..(399)<400> 109ggatccggg atg aag aac ctt tca ttt ccc ctc ctt ttc ctt ttc ttc ctt51Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu1 5 10gtc cct gaa ctg ctg ggc tcc agc atg cca ctg tgt ccc atc gat gaa 99Val Pro Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu15 20 25 30gcc atc gac aag aag atc aaa caa gac ttc aac tcc ctg ttt cca aat 147Ala Ile Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn35 40 45gca ata aag aac att ggc tta aat tgc tgg aca gtc tcc tcc aga ggg 195Ala Ile Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly50 55 60aag ttg gcc tcc tgc cca gaa ggc aca gca gtc ttg agc tgc tcc tgt 243Lys Leu Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys65 70 75ggc tct gcc tgt ggc tcg tgg gac att cgt gaa gaa aaa gtg tgt cac 291Gly Ser Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His80 85 90tgc cag tgt gca agg ata gac tgg aca gca gcc cgc tgc tgt aag ctg 339Cys Gln Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu95 100 105 110cag gtc gct tcc tct cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg atc gaa ggt 387Gln Val Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ile Glu Gly115 120 125cgc aag ctt actArg Lys Leu Thr130<210> 110<211> 130<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-Xa<400> 110
Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu Val Pro1 5 10 15Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu Ala Ile20 25 30Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn Ala Ile35 40 45Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly Lys Leu50 55 60Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys Gly Ser65 70 75 80Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His Cys Gln85 90 95Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu Gln Val100 105 110Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Ile Glu Gly Arg Lys115 120 125Leu Thr130<210> 111<211> 399<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-EK<220>
<221> CDS<222> (10)..(399)<400> 111ggatccggg atg aag aac ctt tca ttt ccc ctc ctt ttc ctt ttc ttc ctt51Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu1 5 10gtc cct gaa ctg ctg ggc tcc agc atg cca ctg tgt ccc atc gat gaa 99Val Pro Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu15 20 25 30gcc atc gac aag aag atc aaa caa gac ttc aac tcc ctg ttt cca aat 147Ala Ile Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn35 40 45
gca ata aag aac att ggc tta aat tgc tgg aca gtc tcc tcc aga ggg 195Ala Ile Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly50 55 60aag ttg gcc tcc tgc cca gaa ggc aca gca gtc ttg agc tgc tcc tgt 243Lys Leu Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys65 70 75ggc tct gcc tgt ggc tcg tgg gac att cgt gaa gaa aaa gtg tgt cac 291Gly Ser Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His80 85 90tgc cag tgt gca agg ata gac tgg aca gca gcc cgc tgc tgt aag ctg 339Cys Gln Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu95 100 105 110cag gtc gct tcc tct cta gcg gga ggg ggt gga tgt ggg gac gat gac 387Gln Val Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Asp Asp Asp115 120 125gac aag ctt act 399Asp Lys Leu Thr130<210> 112<211> 130<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> Res-C-EK<400> 112Met Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu Val Pro1 5 10 15Glu Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro Ile Asp Glu Ala Ile20 25 30Asp Lys Lys Ile Lys Gln Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn Ala Ile35 40 45Lys Asn Ile Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly Lys Leu50 55 60Ala Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys Gly Ser65 70 75 80Ala Cys Gly Ser Trp Asp Ile Arg Glu Glu Lys Val Cys His Cys Gln85 90 95Cys Ala Arg Ile Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu Gln Val100 105 110
Ala Ser Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Asp Asp Asp Asp Lys115 120 125Leu Thr130<210> 113<211> 26<212> PRT<213> 小家鼠(Mus musculus)<400> 113Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Leu Asp Phe Thr Trp His1 5 10 15Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys Lys20 25<210> 114<211> 120<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 大鼠MIF-C1<400> 114Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110
Phe Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly115 120<210> 115<211> 132<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 大鼠MIF-C2<400> 115Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro115 120 125Gly Gly Cys Gly130<210> 116<211> 18<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 氨基酸接头C2<400> 116
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly1 5 10 15Cys Gly<210> 117<211> 124<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 大鼠MIF-C3<400> 117Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly115 120<210> 118<211> 10<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 氨基酸接头C3<400> 118Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly
1 5 10<210> 119<211> 114<212> PRT<213> 人<400> 119Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110Phe Ala<210> 120<211> 114<212> PRT<213> 褐家鼠(rattus norvegicus)<400> 120Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Ser Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile
50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala<210> 121<211> 114<212> PRT<213> 小家鼠<400> 121Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Ala Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Thr35 40 45Phe Ser Gly Thr Asn Asp Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Asn Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ser Asp Arg Leu His Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Gly Ser Thr100 105 110Phe Ala<210> 122<211> 120<212> PRT
<213> 人工序列<220>
<223> 人MIF-C1<400> 122Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110Phe Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly115 120<210> 123<211> 132<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人MIF-C2<400> 123Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45
Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110Phe Ala Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro115 120 125Gly Gly Cys Gly130<210> 124<211> 124<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人MIF-C3<400> 124Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val Pro Asp1 5 10 15Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala Thr Gly Lys20 25 30Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp Gln Leu Met Ala35 40 45Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cys Ala Leu Cys Ser Leu His Ser Ile50 55 60Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser Tyr Ser Lys Leu Leu Cys65 70 75 80Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile85 90 95Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala Asn Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr100 105 110
Phe Ala Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly115 120<210> 125<211> 396<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> AP205 P5T突变体<400> 125atggcaaata agacaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt gtggtcggat 60ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt taaagttggt120atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg tcctgcacct180aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca atccattcgc240acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg ggaaactcac300aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt ccttgaccct360actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaa 39权利要求
1.包含至少一种选自如下的蛋白质的病毒样颗粒(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白质；和(c)所述(a)或(b)蛋白的突变蛋白质。
2.如权利要求1所述的病毒样颗粒，其中所述蛋白质是重组蛋白。
3.如权利要求1或2所述的病毒样颗粒，其中所述突变蛋白质具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了至少1个氨基酸残基，优选地3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
4.如权利要求1至3任一项所述的病毒样颗粒，其中所述突变蛋白质具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中缺失或置换了至少1个半胱氨酸残基，优选地2个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
5.如权利要求1至4任一项所述的病毒样颗粒，其中所述突变蛋白质具有SEQ ID NO1中所述或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列，其中添加、缺失或置换了至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
6.具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的突变蛋白质。
7.SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的重组蛋白质的突变蛋白质。
8.如权利要求7所述的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了至少1个氨基酸残基，优选地3个氨基酸残基，更优选地2个氨基酸残基，甚至更优选地1个氨基酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
9.如权利要求7或8所述的突变蛋白质，其中缺失或置换了至少1个半胱氨酸残基，优选地2个半胱氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
10.如权利要求7至9任一项所述的突变蛋白质，其中添加、缺失或置换了至少1个赖氨酸残基，优选地3个赖氨酸残基，更优选地2个赖氨酸残基，甚至更优选地1个赖氨酸残基，其中优选地，所述至少1个置换是保守性置换。
11.用于产生AP205病毒样颗粒的载体，其包含与SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的核苷酸序列至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，甚至更优选地99％相同的核苷酸序列。
12.用于产生重组蛋白质的载体，其包含编码与选自如下的蛋白质融合的多肽的核苷酸序列(a)具有SEQ ID NO1中所述氨基酸序列的蛋白质；(b)具有SEQ ID NO3中所述氨基酸序列的蛋白质；和(c)所述(a)或(b)多肽的突变蛋白质。
13.一种组合物，其包含(a)选自如下的核心颗粒(i)AP205病毒颗粒；和(ii)AP205病毒样颗粒；和(b)有机分子，其中有机分子与核心颗粒结合。
14.如权利要求13所述的组合物，其中，所述有机分子和核心颗粒形成一个在核心颗粒表面上的有序重复的有机分子阵列。
15.如权利要求13或14所述的组合物，其中有机分子通过第三分子结合核心颗粒，所述第三分子将有机分子与核心颗粒连接在一起。
16.如权利要求13至15任一项所述的组合物，其中所述有机分子通过至少一个共价键结合核心颗粒，其中优选地所述共价键包括肽键。
17.如权利要求13至16任一项所述的组合物，其中所述有机分子通过至少一个共价键结合核心颗粒，其中优选地所述共价键包括非肽键。
18.如权利要求13至17任一项所述的组合物，其中有机分子包括或者优选地是半抗原、抗原或抗原决定簇，并且其中更优选地所述有机分子是抗原或抗原决定簇。
19.如权利要求13至18任一项所述的组合物，其中病毒样颗粒含有至少一个第一附着位点，并且有机分子含有至少一个第二附着位点，这样所述第二附着位点能够与所述第一附着位点缔合，优选地通过至少一个非肽键缔合，以形成有序重复的抗原阵列。
20.如权利要求13至19任一项所述的组合物，其中所述第一附着位点包含，优选地是氨基基团，并且其中优选地所述第一附着位点包含，优选地是赖氨酸残基，并且其中所述第二附着位点包含，优选地是巯基，并且其中优选地所述第二附着位点包含，优选地是半胱氨酸残基。
21.如权利要求13至20任一项所述的组合物，其中所述第二附着位点不天然出现在所述有机分子中。
22.如权利要求13至21任一项所述的组合物，其中所述组合物包含氨基酸接头，并且其中优选地所述氨基酸接头通过至少一个共价键，优选地通过至少一个肽键与所述抗原或所述抗原决定簇结合。
23.如权利要求13至22任一项所述的组合物，其中所述氨基酸接头包含所述第二附着位点。
24.如权利要求13至23任一项所述的组合物，其中所述氨基酸接头选自(a)CGG；(b)N-末端γ1接头；(c)N-末端γ3接头；(d)Ig铰链区；(e)N-末端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，n＝0-12且k＝0-5(SEQ ID NO93)；(g)N-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(SEQ IDNO94)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C-末端γ1接头；(m)C-末端γ3接头；(n)C-末端甘氨酸接头；(0)(G)nC(G)k，n＝0-12且k＝0-5(SEQ ID NO95)；(p)C-末端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，且o＝0-8(SEQ ID NO96)。
25.如权利要求13至24任一项所述的组合物，其中所述有机分子选自(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的有机分子；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的有机分子；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的有机分子；(d)适于诱导改进的抗自身抗原的应答的有机分子；(e)适于在农畜或宠物中诱导免疫应答的有机分子；和(f)适于诱导抗药物、激素或有毒化合物的应答的有机分子和(g)(a)-(f)中所述分子的片段、突变蛋白质或结构域。
26.如权利要求13至25任一项所述的组合物，其中有机分子是选自如下的抗原或抗原决定簇或者其片段或突变蛋白质(a)适于诱导抗癌细胞的免疫应答的抗原或抗原决定簇；(b)适于诱导抗感染性疾病的免疫应答的抗原或抗原决定簇；(c)适于诱导抗变应原的免疫应答的抗原或抗原决定簇；(d)适于诱导改进的抗自身抗原的应答的抗原或抗原决定簇；(e)适于在农畜或宠物中诱导免疫应答的抗原或抗原决定簇；和(f)适于诱导抗药物、激素或有毒化合物的应答的抗原或抗原决定簇；和(g)(a)-(f)中所述分子的片段或结构域。
27.如权利要求13至26任一项所述的组合物，其中所述有机分子是选自如下的抗原(a)HIV多肽，(b)流感病毒多肽，(c)丙型肝炎病毒多肽，(d)弓形体多肽，(e)恶性疟原虫多肽，(f)间日疟原虫多肽，(g)卵形疟原虫多肽，(h)三日疟原虫多肽，(i)乳腺癌细胞多肽，(j)肾癌细胞多肽，(k)前列腺癌细胞多肽，(l)皮肤癌细胞多肽，(m)脑癌细胞多肽，(n)白血病细胞多肽，(o)重组profiling，(p)蜂螫刺变态反应多肽，(q)坚果变态反应多肽，(r)食物变态反应多肽，(s)哮喘多肽，或(t)衣原体多肽，(u)Her2，(v)GD2，(w)EGF-R，(x)CEA，(y)CD52，(z)人黑素瘤gp100，(aa)人黑素瘤melanA/MART-1，(bb)酪氨酸酶，(cc)NA17-A nt，(dd)MAGE3，(ee)P53，和(ff)HPV16E7；和(gg)(a)至(z)及(aa)至(ff)的所述抗原的任何片段或突变蛋白质。
28.如权利要求13至27任一项所述的组合物，其中所述抗原或抗原决定簇是选自如下的肽、蛋白质，或者蛋白质或肽的片段或突变蛋白质a)磷脂酶A2蛋白质；b)人IgE；c)淋巴毒素；d)流感M2蛋白质；和e)DerpI肽。
29.如权利要求13至28任一项所述的组合物，其中所述有机分子是抗原或抗原决定簇，而且所述抗原或所述抗原决定簇是自身抗原或抗独特型抗体，或其片段。
30.如权利要求13至29任一项所述的组合物，其中所述自身抗原是选自如下的蛋白质、肽或者其任何片段或突变蛋白质a)淋巴毒素；b)淋巴毒素受体；c)RANKL；d)VEGF；e)VEGFR；f)白细胞介素5；g)白细胞介素8；h)白细胞介素17；i)白细胞介素13；j)血管紧张肽；k)CCL21；l)CXCL12；m)SDF-1；n)MCP-1；o)Endoglin；p)抵抗素；q)GHRH；r)LHRH；s)TRH；t)MIF；u)Eotaxin；v)缓激肽；w)BLC；x)M-CSF；x)肿瘤坏死因子α(TNFα)；y)淀粉样β肽(Aβ1-42)；和z)人IgE。
31.如权利要求13至30任一项所述的组合物，其中所述自身抗原是选自如下的淋巴毒素或其片段a)淋巴毒素α(LTα)；b)淋巴毒素β(LTβ)；和c)LTα和LTβ的混合或组合。
32.如权利要求13至31任一项所述的组合物，其中所述有机分子是适于诱导抗药物、激素或毒素的免疫应答的有机分子。
33.如权利要求13至32任一项所述的组合物，其中所述有机分子是适于诱导抗药物的免疫应答的有机分子。
34.如权利要求13至33任一项所述的组合物，其中所述药物选自(a)可待因；(b)芬太尼；(c)海洛因；(d)吗啡；(e)苯丙胺；(f)可卡因；(g)甲烯二氧甲苯丙胺；(h)甲苯丙胺；(i)哌醋甲酯；(j)烟碱；(k)LSD；(l)三甲氧苯乙胺；(M)叔胺吲哚磷酯；和(n)四氢大麻酚。
35.如权利要求13至34任一项所述的组合物，其中所述药物是烟碱。
36.如权利要求13至35任一项所述的组合物，其中有机分子适于诱导抗激素的免疫应答。
37.如权利要求13至36任一项所述的组合物，其中所述有机分子是激素，其选自包含如下激素的组，优选选自由如下激素组成的组(a)孕酮；(b)雌激素；(c)睾酮；(d)促卵泡激素；(e)促黑素激素(melanin stimulating hormone)；(f)肾上腺素；和(g)去甲肾上腺素。
38.如权利要求13至37任一项所述的组合物，其中有机分子适于诱导抗毒素的免疫应答。
39.如权利要求13至38任一项所述的组合物，其中有机分子是毒素，选自(a)黄曲霉毒素；(b)ciguetera毒素；(c)河豚毒素；(d)抗生素；和(e)抗癌剂。
40.一种药物组合物，其包含(a)权利要求13至39任一项所述的组合物和(b)可接受的药物载体。
41.一种疫苗组合物，其包含免疫有效量的权利要求13至39任一项所述的组合物。
42.一种免疫方法，该方法包括施用权利要求41所述的疫苗组合物。
43.如权利要求41所述的疫苗组合物，其还包含佐剂。
44.一种用于产生非天然的、有序重复抗原阵列的方法，该方法包括(a)提供包含核心颗粒的分子支架，该核心颗粒选自(i)AP205病毒；和(ii)AP205病毒样颗粒；和(b)提供适于诱导免疫应答的有机分子；(c)提供连接(a)和(b)的物质，所述物质可选地包含在(a)和/或(b)中，或者作为一个单独分子存在；和(d)组合(a)到(c)的元件，使所述有机分子与所述支架连接以形成有序重复的抗原阵列。
45.一种治疗或预防个体中疾病、病症或生理状况的方法，该方法包括向个体施用权利要求13至39任一项所述的组合物。
46.一种治疗或预防个体中疾病、病症或生理状况的方法，该方法包括向个体施用权利要求41所述的疫苗组合物。
47.一种核酸分子，其包含SEQ ID NO125中所述的核苷酸序列。
48.一种宿主细胞，其含有权利要求47所述的核酸或权利要求11所述的载体。
49.如权利要求48所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
50.一种产生权利要求1至5任一项所述的病毒样颗粒的方法，该方法包括步骤(a)提供权利要求47所述的核酸或权利要求11所述的载体；(b)向宿主细胞中引入所述核酸或所述载体；(c)在所述宿主细胞中表达所述核酸或所述载体的序列以获得能形成权利要求1所述的病毒样颗粒的蛋白质或突变蛋白质。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
全文摘要
本发明提供了包含AP205病毒样颗粒(VLP)和抗原的组合物。本发明也提供了制备结合AP205 VLP的抗原或抗原决定簇的方法。可以使用结合抗原的AP205 VLP制备用于诱导免疫应答的组合物，其中所述免疫应答可以用于预防或治疗疾病、病症或状况，包括感染性疾病、变态反应、癌症、药物成瘾、中毒，和有效地诱导自身特异性免疫应答，特别是抗体应答。
文档编号C07K14/54GK1668637SQ03816862
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月14日 优先权日2002年7月17日
发明者M·F·巴赫曼, A·蒂索, P·庞朋斯, I·西伦斯, R·伦霍法 申请人:希托斯生物技术股份公司