通过包含载体肽和活性剂的双特异性抗体和半抗原构建体的方式进行药物前靶向定位的制作方法

专利名称：：通过包含载体肽和活性剂的双特异性抗体和半抗原构建体的方式进行药物前靶向定位的制作方法本申请是1999年8月23日申请的美国专利No.09/382,186和2001年4月3日申请的美国专利No.09/823,746的后续申请，所述两个申请是1999年6月22日申请的美国专利No.09/337,756的后续申请，所述文献在此全文引作参考。
背景技术：
：发明领域。本发明涉及治疗用途的免疫试剂，例如，放射免疫治疗(RAIT)，和诊断用途，例如，放射免疫检测(RAIT)和磁共振成像(MRI)。更具体地，本发明涉及双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)，其中所述抗体或抗体片段有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂。另外，本发明涉及针对特异免疫原的单克隆抗体、人源化和嵌合的单克隆双特异性抗体和抗体片段，其中所述抗体或抗体片段有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，还涉及编码所述抗体和抗体片段的DNAs、和表达所述DNAs的载体。先前的临时申请U.S.S.N.60/090,142和U.S.S.N.60/104,156公开了本发明的一部分，在此全文引作参考。相关技术癌症治疗和诊断方面的进展包括将抗体或抗体片段直接用于疾病组织，其中抗体或抗体片段能够将诊断剂或治疗剂靶向定位于疾病位点。正在研究的该方法的一个进展，包括bsAbs的应用，该bsAbs有至少一个特异性结合疾病靶组织的臂和至少另外一个特异性结合低分子量半抗原的臂。在该方法中，给予一种bsAb，使之定位于靶组织，并清除正常组织。一段时间之后，给予放射标记的低分子量半抗原，其可以被bsAb的第二个特异性识别，同样也使其定位于原来的靶组织。虽然低分子量半抗原与bsAbs联合使用具有多种特征成像和治疗用途，但对于潜在的应用的来说，制备单个的bsAbs几乎是不可能的。而且，应用bsAb/低分子量半抗原系统还必须克服另外几个问题。第一个是，bsAb的臂与低分子量半抗原的结合必须具有很高的结合亲和力，因为预先设计的低分子量半抗原如果没有被bsAb结合的话，会快速从活组织中清除出去。第二个是，非-bsAb结合的低分子量半抗原事实上需要快速从活组织中清除出去，以避免被非靶组织吸收并潴留。第三个是，在使用bsAb的方案中，检测和/或治疗剂在bsAb方案应用中必须与低分子量半抗原保持相关。关于bsAbs的一个令人感兴趣的进展是，使用具有合适双特异性的Abs直接将螯合剂和金属螯合络合物介导到肿瘤。所使用的螯合剂和金属螯合络合物一般具有放射性，使用放射性核素，如钴-57(Goodwin等，美国专利No.4,863,713)，铟-111(Barbet等，美国专利No.5,256,395和No.5,274,076，Goodwin等，J.Nucl.Med.，331366-1372(1992)和Kranenborg等，CancerRes(suppl.)，555864s-5867s(1995)和Cancer(suppl.)802390-2397(1997)))，和镓-68(Boden等，BioconjugateChem.，6373-379，(1995)和Schuhmacher等，CancerRes.，55115-123(1995))进行放射免疫成像。因为Abs抗体是针对螯合剂和金属螯合络合物的，因而抗体对其所针对的络合物具有非常显著的特异性。事实上，Boden等的bsAbs对于螯合剂和金属-螯合络合物对映混合物的单个对映体具有特异性。高特异性经证实在一个方面是不利的，也就是，其中所使用的核素不能轻易替换为其它核素，如用其它可获得的试剂替换进行放射免疫治疗(RAIT)的钇-90和铋-213和进行MRI的钆。因此在第二步靶向定位过程中采用了碘-131，一种非金属，来进行RAIT，其中使用了I-131标记的铟-金属-螯合络合物。该方法的第二个缺点是，需要为每种用于诊断和治疗的试剂生产抗体。在癌成像和治疗方面，前靶向定位(Pretargeting)方法受到了相当多的注意。不同于直接靶向定位的将一种效应分子(如一种放射性核素或一种与小的载体连接的药物)直接连接到靶向试剂，在前靶向定位系统中，效应分子是在靶向试剂之后一段时间才施用。这段时间可以使靶向试剂定位于肿瘤病灶，和更重要的是，易于从身体内清除。因为大多靶向试剂是抗体蛋白，因此与较小的效应分子(通常几分钟)相比，一般从身体中清除的更慢(通常几天)。在包括治疗性核素的直接靶向系统中，身体，特别是极易受损害的红骨髓，在靶向试剂在肿瘤中慢慢到达最大水平并从身体清除期间，全部暴露在射线之下。在前靶向定位系统中，放射性核素通常结合到一种小的“效应”分子如螯合剂或肽上，这些小的效应分子可以非常快地从身体清除出去，因此将正常组织的暴露时间减至最小程度。而且，因为小分子能够快速穿越肿瘤血管并结合到初级靶向试剂，因此肿瘤能够快速到达核素吸收最大量。此外，较小的尺寸有助于在肿瘤中更加均匀的分布。前靶向定位方法有多种不同的实施方案，但大多包括亲合素/链霉抗生物素蛋白-生物素识别系统或可被肿瘤抗原和效应分子共同识别的双特异性抗体。亲合素/链霉抗生物素蛋白系统是高度可变的，并已经以不同方式被应用。抗体能够与链霉抗生物素蛋白或生物素相偶联，用作初级靶向试剂。一段时间以后，施用效应分子，其分别与生物素或亲合素/链霉抗生物素蛋白结合。另外一种方式有3个步骤，首先靶向定位生物素-结合抗体，然后桥接链霉抗生物素蛋白/亲合素，最后给予生物素-结合效应物。根据所使用的效应物，这些系统可以很容易地进行改变，只要效应物和靶向试剂能够与所使用的生物素或链霉抗生物素蛋白/亲合素结构相偶联。因为具有可变性适用于多种靶向位置，并在亲合素/链霉抗生物素蛋白和生物素之间具有高度结合亲和力，因此该类前靶向定位系统比其它系统具有更大的优点。然而，生物素和链霉抗生物素是外源蛋白，因而是免疫原性的，在临床应用中这限制了它们的施用次数。从这个角度来说，bsAbs具有能够作为相对非-免疫原性的人源化的蛋白来使用的优点。虽然bsAb的结合亲和力(通常为10-9到10-10M)比不上链霉抗生物素蛋白/亲合素-生物素亲和的非常高的亲和力(～10-15M)，这两种前靶向定位系统都依赖于初级靶向试剂的结合亲和力，因此具有较高亲和力的链霉抗生物素蛋白/亲合素-生物素系统并不比bsAb前靶向定位系统更具有实际上的优点。然而，多数bsAbs仅有一个用于结合初级靶的臂，而链霉抗生物素蛋白/亲合素-生物素前靶向定位系统一般使用具有两个臂的完整IgG，两个臂均用于结合靶，这加强了与靶的结合。通过使用一种二价肽，加强了其亲和力，与单价肽相比，能够大大提高肽结合到靶位点的能力。因此，这两种系统均能够提供较高的具有合适潴留的靶向定位比率。使用bsAb的前靶向定位还需要抗体有一个识别效应分子的臂。迄今报道的多数放射性核素靶向定位依赖抗体对金属螯合络合物的识别，如抗体对装载了铟的DTPA的识别或抗体对其它螯合剂的识别。因为抗体对特定金属螯合络合物通常是高度选择性的，因此需要构建与特定效应抗体相适应的新的bsAbs。如果抗体对效应物不是特异性的，而是与其它成分反应，则不需要所述过程。这样的话，可以制造多个效应物，只要它们包含抗体识别成分。我们发展了以前Janevik-Ivanovska等公开的前靶向定位系统，在所述文献中将一种直接识别组胺衍生物、组胺-琥珀酰-甘氨酰(HSG)的抗体作为识别系统，其中可以制备多个效应物成分。已经报道了使用放射性碘和铼标记的包含HSG的二价肽，所获得的卓越的前靶向定位效果。在本申请中，我们扩展了该系统，使之包括适用于放射标记90Y、111In、177Lu的肽，和可选择的99mTc-结合肽。因此，需要一种这样的免疫试剂，其能够被直接用于病灶组织并能够与随后施用的靶向诊断或治疗结合物结合，同时需要一种灵活的系统，不需要对双特异性或多重特异性抗体进行改变，即可容纳不同的诊断和治疗剂。发明目的本发明的一个目的是，提供一种多重特异性的抗体或抗体片段，其有至少一个特异性结合靶组织的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，其中靶向构建体能够根据多种不同的诊断和治疗应用而被加以修饰。本发明的另外一个目的是，提供联合使用多重特异性抗体和靶向构建体的前靶向定位诊断和治疗方法，提供制造多重特异性的方法，和该方法中所使用的试剂盒。在完成所述目的过程中，本发明人发现针对靶向构建体的多重特异性Abs是有优势的，其能够携带一个或多个诊断和治疗剂。通过使用该项技术，可以改变螯合剂、金属螯合络合物、治疗剂或诊断剂的特性，以适应不同的用途，而不必为每个新用途准备新的多重特异性Abs。而且，在该过程中，两种或多种不同的螯合剂、金属螯合络合物、诊断或治疗剂可以与本发明多重特异性Ab一起使用。发明概述本发明涉及多重特异性或双特异性抗体或抗体片段，其至少有一个特异性结合靶组织的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂。提供了一种具有通式X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2(SEQIDNO1)的化合物，其中该化合物包括位于X或Y位置上的硬酸阳离子螯合剂，和位于剩下的X或Y位置上的软酸阳离子螯合剂。硬酸阳离子螯合剂可包括羧基或胺基基团，还可包括如NOTA、DOTA、DTPA、和TETA的螯合剂。软酸阳离子螯合剂可包括硫醇基团，还包括如Tscg-Cys和Tsca-Cys的螯合剂。该化合物的一个优选实施方案是DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)，也被称作IMP245。所述化合物中，将硬酸阳离子螯合剂和软酸阳离子螯合剂的位置进行交换就构成了另外一个实施方案，即(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)。化合物还可以包括结合到不同螯合部分上的阳离子。例如，硬酸阳离子可以包括IIa和IIIa族的金属阳离子，其通常结合到硬酸螯合剂中。结合到软酸螯合剂上的软酸阳离子包括过渡金属、镧系元素、锕系元素、和/或Bi。这样的软酸阳离子非穷尽的例子包括Tc、Re、和Bi。本发明还提供了一种靶向构建体，其包括X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH-R(SEQIDNO1)。在此，硬酸阳离子螯合剂即可位于X，也可位于Y，同时软酸阳离子螯合剂位于剩下的X或Y。靶向构建体还包括将化合物与治疗或诊断剂或酶“R”连接到一起的接头。该接头至少有一个氨基酸，用于R基团与化合物的连接。治疗剂的例子包括药物、药物前体(如表柔比星葡糖苷酸，CPT-11，依托泊甙葡糖苷酸，柔红霉素葡糖苷酸和阿霉素葡糖苷酸)或毒素(如蓖麻毒素，相思豆毒蛋白，核糖核酸酶，DNaseI，葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素-A，美洲商陆抗病毒蛋白，gelonin，白喉毒素，假单胞杆菌属(Pseudomonas)外毒素，和假单胞菌属内毒素)。另外，治疗剂的例子包括阿霉素、SN-38、氨甲碟呤、6-巯基嘌呤和/或依托泊甙磷酸盐。诊断剂包括核素、一种或多种用于光促治疗的试剂(如光敏剂，如苯卟啉一元酸环A(BPD-MA)、本红紫素锡(SnET2)、磺化酞菁铝(AlSPc)和德卟啉(texaphyrin)镥(Lutex)、对照试剂和用于磁共振成像(MRI)和计算机化体层摄影(CT)的影像增强试剂。R基团可以是酶，其能够将靶位点上的药物前体转化为药物；或能够将去除毒性的药物中间体复原为毒性形式，提高所述药物在靶位点的毒性。在一个实施方案中，本发明提供了治疗、诊断和/或鉴定患者病灶组织的方法，包含(A)给患者施用双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；(B)可选择地，给患者施用清除组合物，并使组合物将没有定位的抗体或抗体片段从循环中清除出去。(C)给患者施用包含载体部分的第一靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少一个可被双特异性抗体或抗体片段的至少另外一个臂识别的表位，和一个或多个已缀合的治疗或诊断剂、或酶；和(D)当靶向构建体包含酶时，给患者进一步施用1)药物前体，当酶能够在靶位点将药物前体转化为药物的情况下；或2)在患者体内能够被解毒，形成低毒性中间体的药物，当酶能够将解毒的中间体复原为毒性形式，并从而提高药物在靶位点的毒性的情况下，或3)药物前体，其在患者体内经过自然过程被活化，并通过转化为一种低毒性中间体的方式被解毒，当酶能够将解毒的中间体重新转换为毒性形式，并从而提高药物在靶位点的毒性的情况下，或4)包含载体部分的第二靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少一个可被双特异性抗体或抗体片段的至少另外一个臂识别的表位，当酶能够在靶位点将药物前体转化为药物的情况下。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或鉴定患者病灶组织的试剂盒，其包括(A)双特异性抗体或抗体片段，其具有至少一个特异性结合靶组织的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；(B)包含载体部分的第一靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少一个可被双特异性抗体或抗体片段的至少另外一个臂识别的表位，和一个或多个缀合的治疗或诊断剂、或酶；和(C)可选择地，一种清除组合物，用于清除没有定位的抗体和抗体片段；和(D)可选择地，当第一靶向构建体包含一种酶时，1)药物前体，当酶能够在靶位点将药物前体转化为药物的情况下；或2)在患者体内能够被解毒，形成低毒性中间体的药物，当酶能够将解毒的中间体复原为毒性形式，并从而提高药物在靶位点的毒性的情况下，或3)药物前体，其在患者体内经过自然过程被活化，并通过转化为一种低毒性中间体的方式被解毒，当酶能够将解毒的中间体重新转换为毒性形式，并从而提高药物在靶位点的毒性的情况下，或4)包含载体部分的第二靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少一个可被双特异性抗体或抗体片段的至少另外一个臂识别的表位，当酶能够在靶位点将药物前体转化为药物的情况下。本发明的另一个实施方案是，提供编码所述抗体或抗体片段的DNA构建体。尤其是能够产生可变区域的DNA构建体，所述可变区域能够提供与靶向构建体和病灶组织反应的有利特性。同时本发明在该方面还提供了一种重组DNA构建体，其包含能够在宿主细胞中产生双特异性抗体或抗体片段的表达组件，所述抗体或抗体片段有至少一个特异性结合靶组织的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，其中该重组DNA构建体包含，在宿主细胞中起作用的从5’到3’方向转录的转录起始调控区、在宿主细胞中起作用的翻译起始调控区、编码双特异性抗体或抗体片段的DNA序列、和在宿主细胞中起作用的转录、翻译终止调控区，其中双特异性抗体或抗体片段受调控区的控制。本发明另外一个实施方案提供了通过重组技术制备抗体或抗体片段的方法。同时本发明在该方面还提供了制备具有至少一个特异性结合靶组织的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂的双特异性抗体或抗体片段的方法，其包括(A)将前面所述的重组DNA构建体转导到宿主细胞；(B)培养细胞并分离抗体或抗体片段。在本发明的另外一个实施方案中，提供了制备双特异性融合蛋白的方法，所述融合蛋白具有至少一个特异性结合靶组织的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，所述方法包括(1)(A)将重组DNA构建体转导到宿主细胞，该重组DNA构建体包含能够在宿主细胞中产生双特异性融合蛋白片段的表达组件，其中构建体还包含，在宿主细胞中起作用的从5’到3’方向转录的转录起始调控区、在宿主细胞中起作用的翻译起始调控区、编码与免疫球蛋白轻链抗体片段连接的scFv的DNA序列、和在宿主细胞中起作用的转录、翻译终止调控区，其中双特异性融合蛋白片段受调控区的控制；(B)将重组DNA构建体共转导到宿主细胞，该重组DNA构建体包含能够在宿主细胞中产生Fd片段的表达组件，其中Fd片段与(A)中的免疫球蛋白轻链抗体片段互补，并且当与轻链抗体片段连接时形成Fab片段，该Fab片段上的结合位点对于靶组织来说是特异性的，其中构建体还包含，在宿主细胞中起作用的从5’到3’方向转录的转录起始调控区、在宿主细胞中起作用的翻译起始调控区、编码Fd片段的DNA序列、和在宿主细胞中起作用的转录、翻译终止调控区，其中Fd片段受调控区的控制；(C)培养细胞并分离双特异性融合蛋白，或(2)(A)将重组DNA构建体转导到第一宿主细胞，该重组DNA构建体包含能够在第一宿主细胞中产生双特异性融合蛋白片段的表达组件，其中构建体还包含，在第一宿主细胞中起作用的从5’到3’方向转录的转录起始调控区、在第一宿主细胞中起作用的翻译起始调控区、编码与轻链抗体片段连接的scFv的DNA序列、和在第一宿主细胞中起作用的转录、翻译终止调控区，其中双特异性融合蛋白片段受调控区的控制；(B)将重组DNA构建体转导到第二宿主细胞，该重组DNA构建体包含能够在第二宿主细胞中产生Fd片段的表达组件，其中Fd片段与(2)(A)中的轻链抗体片段互补，并且当与轻链抗体片段连接时形成Fab片段，该Fab片段上的结合位点对于靶组织来说是特异性的，其中构建体还包含，在第二宿主细胞中起作用的从5’到3’方向转录的转录起始调控区、在第二宿主细胞中起作用的翻译起始调控区、编码Fd片段的DNA序列、和在第二宿主细胞中起作用的转录、翻译终止调控区，其中Fd片段受调控区的控制；(C)培养第一和第二宿主细胞；(D)选择性分离双特异性融合蛋白片段和Fd片段；和(E)将片段进行连接，产生双特异性融合蛋白，并分离双特异性融合蛋白。可使用多种宿主细胞来制备双特异性抗体或抗体片段，包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和细菌细胞。在一个实施方案中，使用了哺乳动物受精卵，经重组DNA构建体的转导，产生了能够生产双特异性抗体或抗体片段的转基因动物。本发明还尝试提供的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体和抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，所述靶向构建体可以根据不同的诊断和治疗用途而加以修饰。本发明进一步的实施方案涉及将本发明抗体或抗体片段用于光动力学治疗。本发明进一步的实施方案涉及将本发明抗体或抗体片段用于放射免疫成像中的正电子发射体层摄影(PET)。本发明的进一步实施方案涉及将本发明抗体或抗体片段用于放射免疫成像中的单光子发射。本发明进一步的实施方案涉及将本发明抗体或抗体片段用于磁共振成像(MRI)。本发明进一步实施方案涉及将本发明抗体或抗体片段用于X-射线、计算机化体层摄影(CT)或超声波成像。本发明进一步实施方案涉及将本发明抗体或抗体片段用于手术中的、内窥镜的、或血管内检测和/或治疗。本发明进一步的实施方案涉及将本发明的抗体或抗体片段用于硼中子捕获治疗(BNC7)。本发明进一步实施方案涉及将本发明抗体或抗体片段用于诊断或治疗病灶组织(例如癌症、感染、炎症、血块、动脉粥样硬化、梗死)、正常组织(如脾、甲状旁腺、胸腺、骨髓)、异位组织(如子宫内膜异位症)、和病原体。此外，本发明提供了前靶向定位诊断和治疗方法，其中联合使用双特异性抗体和以下靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)以及制备双特异性的方法，和用于该方法的试剂盒。本发明人发现针对靶向构建体的bsAbs是有优势的，其能够携带一个或多个诊断或治疗剂。通过使用该技术，可以改变螯合剂、金属螯合络合物、治疗剂或诊断剂的特性，以适应不同的用途，而不必为每个用途准备新的bsAbs。而且，通过该方法两种或多种不同的螯合剂、金属螯合络合物或治疗剂可以与本发明的bsAb一起使用。本发明涉及治疗或鉴定受试者病灶组织的方法，其包括(A)给所述受试者施用双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合包含至少两个HSG半抗原的靶向构建体的臂；(B)可选择地，给所述受试者施用清除组合物，并使所述组合物将没有定位的抗体或抗体片段从循环中清除出去。(C)给所述受试者施用包含载体部分的靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少两个HSG半抗原，和至少一个螯合剂，并可以包含至少一个诊断和/或治疗的阳离子，和/或一个或多个螯合的或化学结合的治疗或诊断剂，或酶；和(D)当所述靶向构建体包含酶时，给受试者进一步施用1)药物前体，当所述酶能够在靶位点将药物前体转化为药物的情况下；或2)在所述受试者体内能够被解毒，形成低毒性中间体的药物，当所述酶能够将解毒的中间体复原为毒性形式，并从而提高药物在靶位点的毒性的情况下，或3)药物前体，其在受试者体内经过自然过程被活化，并通过转化为一种低毒性中间体的方式被解毒，当酶能够将解毒的中间体重新转换为毒性形式，并从而提高药物在靶位点的毒性的情况下。本发明还涉及检测或治疗哺乳动物靶细胞、组织或病原体的方法，其包括施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织、或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分；和施用选自下列的靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本发明还涉及治疗或鉴定受试者病灶组织的方法，包含给所述受试者施用双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；可选择地，给所述受试者施用清除组合物，并使所述组合物将没有定位的抗体或抗体片段从循环中清除出去；和给所述受试者施用选自下列的靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本发明还涉及用于治疗或鉴定受试者病灶组织的试剂盒，包含(A)一种双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，其中所述构建体选自(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)(B)包含载体部分的靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少一个能够被所述双特异性抗体或抗体片段的所述至少另外一个臂识别的表位，和一个或多个缀合的治疗或诊断剂、或酶；和(C)可选择地，清除组合物，用于清除没有定位的抗体和抗体片段；和(D)可选择地，当所述第一靶向构建体包含一种酶时1)药物前体，当所述酶能够在靶位点将所述药物前体转化为药物的情况下；或2)在所述受试者体内能够被解毒，形成低毒性中间体的药物，当所述酶能够将所述解毒的中间体复原为毒性形式，并从而提高所述药物在靶位点的毒性的情况下，或3)药物前体，其在所述受试者体内经过自然过程被活化，并通过转化为一种低毒性中间体的方式被解毒，在所述酶能够将所述解毒的中间体重新转换为毒性形式，并从而提高所述药物在靶位点的毒性的情况下。本发明还涉及选自下列的靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本发明还涉及筛选靶向构建体的方法，其包括将所述靶向构建体与双特异性抗体或抗体片段接触，形成混合物，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合所述靶向构建体的臂；其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织、或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分；和可选择地，孵育所述混合物；和分析所述混合物。本发明还涉及哺乳动物正常组织成像的方法，包含施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分；和施用选自下列的靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本发明还涉及受试者病灶组织的手术中鉴定或治疗的方法，包含施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体和抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分；和施用选自下列的靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本发明还涉及受试者病灶组织的内镜鉴定或治疗的方法，包含施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体和抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分；和施用选自下列的靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本发明还涉及受试者病灶组织的血管内鉴定或治疗的方法，包含施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体和抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分；和施用选自下列的靶向构建体(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)本发明的其它方面、特征和优点将在下面的说明书中加以描述，在一定程度上来说所述内容在说明书中是显而易见的，或在实施本发明过程中可以体会到。本发明的实施方式和优点可以通过本发明的手段和组合，尤其是权利要求书中提到的，来实现并获得。附图简述附图1图解说明不同的Abs和bsAbs。附图2提供了纯化的hMN-14Fab-734scFv的SDS-PAGE分析结果。聚丙烯酰胺凝胶的浓度为4-20％，在非还原条件(泳道1和2)和还原条件下(泳道3和4)进行，bsAb(泳道2和4)和hMN-14IgG(泳道1和3)的用量为3μg。附图3图解说明两种双特异性融合蛋白。附图4图示用于制备hMN-14Fab-734scFv双特异性融合蛋白的DNA构建体。附图5图示用于制备hMN-14Fab-734scFv双特异性融合蛋白的DNA构建体。附图6显示hMN-14×m679bsMAb与111In-标记的IMP-241二价HSG-DOTA肽之间的结合特性。方格A只有111In-IMP-241的SE-HPLC结果；方格B111In-IMP-241与hMN-14×m679bsMAb混合后的SE-HPLC结果；方格C将111In-IMP-241加入含有hMN-14×679bsMAb和过量CEA的混合物后的结果。色谱结果表明111In-IMP-241与bsMAb(B)与bsMAb/CEA复合体(C)相关。附图7显示125I-mMu-9×m679F(ab′)2bsMAb和111In-IMP-241在GW-39肿瘤模型裸小鼠中的清除率。小鼠静脉注射放射标记的bsMAb，48小时之后静脉给予放射标记的肽。数值表示每克注射剂量的平均和标准偏差的百分数(每次时间间隔n＝5)。优选实施方案的详细说明I.概述本发明提供了一种双特异性抗体(bsAb)或抗体片段(bsFab)，其具有至少一个可与靶组织反应的臂，和至少另外一个可与靶向构建体反应的臂。靶向构建体包括肽，所述肽具有至少两个可识别半抗原单元。可识别半抗原的例子包括但不限于，组胺琥珀酰甘氨酰(HSG)和荧光素异硫氰酸盐。靶向构建体可以与多种用于治疗或鉴定病灶组织的试剂缀合。能够缀合的试剂包括但不限于，螯合剂、金属螯合络合物、药物、毒素(如蓖麻毒素、相思豆毒蛋白，核糖核酸酶(如RNase)，DNaseI，葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素-A，美洲商陆抗病毒蛋白，gelonin，白喉毒素，假单胞杆菌属(Pseudomonas)外毒素，和假单胞菌属内毒素)和其它效应分子。另外，活化药物前体或提高药物靶特异性毒性的酶也可以缀合到靶向构建体上。因此，使用可与靶向构建体反应的bsAb可以进行多种治疗和诊断应用，而不必为每个应用准备新的bsAb。双特异性抗体(bsAb)前靶向定位系统提供了一种诊断和治疗用途的潜在的非免疫原性、高度选择性的替代方法。另外，在此描述的bsAb前靶向定位系统比其它前靶向定位系统具有一个非常重要的优点，就是它可以与多种不同的成像或治疗剂一起应用。本系统所具有的灵活性归因于使用了直接抗组胺-琥珀酰-甘氨酰(HSG)的抗体和开发了含有HSG残基的肽。含有HSG的肽既可以用DOTA螯合111In、90Y、177Lu进行合成，也可以用锝/铼螯合剂进行合成。在前靶向定位中，联合使用这些肽和双特异性抗体，使用被抗-癌胚抗原(CEA)或抗-结肠-特异性抗原-P(CSAp)抗体的Fab’化学稳定的抗-HSGFab’，来提供对表达这些抗原的肿瘤的靶向能力。但是，其它的抗原靶还可以包括现有技术中已知的多种与肿瘤相关的抗原，如CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD30，CD74，CD80，HLA-DR，Ia，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，EGFR，HER2/neu，PAM-4，BrE3，TAG-72(B72.3，CC49)，EGP-1(如RS7)，EGP-2(如17-1A和其它Ep-CAM靶)，Le(y)(如B3)，A3，KS-1，S100，IL-2，T101，坏死抗原，叶酸受体，血管生成标记(如VEGF)，肌腱蛋白，PSMA，PSA，肿瘤相关细胞因子，MAGE，和/活其片段。组织特异性抗体(如抗骨髓细胞的，如CD34，CD74等，甲状旁腺球蛋白抗体等)和抗非恶性病灶组织的抗体，如血凝纤维蛋白，粥样斑块巨噬细胞抗原(如CD74抗体)，和特异性病原体抗体(如抗细菌的、抗病毒的、和抗寄生虫的)，在现有技术中是已知的。可以在温和条件下对肽进行标记以获得较高特异性活性，这样可避免纯化的需要。肿瘤模型裸鼠的体内研究表明，放射标记的肽在体内被快速清除，在肿瘤组织或正常组织中仅有极少量的潴留。在施用前靶向剂量的bsAbs之后1到2天时，肿瘤所摄取的放射标记肽的量升高了28-175倍，在注射肽3小时内，肿瘤/非肿瘤比率超过2∶1到8∶1，这表明比同时施用的99mTc-抗-CEAFab’具有显著的提高。抗-CSAp×抗-HSGF(ab′)2bsAb在肿瘤中具有最高和最持久的潴留，并且当与111In标记的肽联合使用时，以治疗放射核素如90Y和177Lu来估计照射剂量，结果显示可以给肿瘤施用相当12,000cGy的照射剂量，其中肾脏接受了1500cGy，而其它所有组织接受了500cGy。因此，该靶向定位系统具有高度灵活性，能够使用多种诊断成像和治疗所需的化合物，并因为获得了非常高的肿瘤吸收和靶向比率，而非常适用于所述用途。另外，本发明还包含一种检测和/或治疗哺乳动物靶细胞、组织或病原体的方法，其包括施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体和抗体片段包含至少一个特异性结合靶组织的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂。在此所使用的“病原体”包括但不限于，真菌(如小孢子菌属、发癣菌属、表皮癣菌属、Sporothrixschenckii、新型隐球菌、粗球孢菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎牙生菌、白色假丝酵母)、病毒(如人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流行性感冒病毒、B型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、Reo病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿病毒40、呼吸道合胞病毒、乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T-细胞白血病病毒、爱-巴病毒、鼠白血病病毒、流行性腮腺炎病毒、疱疹性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病病毒)、寄生虫、细菌(如炭疽杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓链球菌、埃希氏大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌、嗜血B-型流感、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁杆菌、结核分枝杆菌、和破伤风毒素)、支原体(关节炎支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、拉氏无胆甾原体、唾液支原体、和肺炎支原体)和原生动物(如镰状疟原虫、间日疟原虫、鼠弓形虫、让氏锥虫、克氏锥虫、罗德西亚锥虫、布氏锥虫、曼森血吸虫、日本血吸虫、牛巴贝虫、Elmeriatenella、旋盘尾丝虫、旋毛线虫、旋盘尾丝虫、小泰勒尔梨浆虫、水泡绦虫、羊绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球蚴、和科尔蒂中殖孔绦虫)。参见美国专利No.5,332,567。本文还提供了抗体和抗体片段。抗体片段是抗体中的抗原结合部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab等。抗体片段所结合的抗原与完整抗体所识别的抗原相同。例如，抗-CD22单克隆抗体片段结合到CD22的表位。术语“抗体片段”还包括任一合成的蛋白或基因工程蛋白，其与抗体相同，均是结合到特异性抗原形成复合物。例如，抗体片段包括分离的片段、由免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区组成的“Fv”片段、免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽接头连接在一起而形成的重组单链多肽分子(“sFv蛋白”)、和由模拟“高变区”的氨基酸残基组成的最小识别单元。在免疫球蛋白轻链区或重链区的每个可变区中发现了三个被称作“高变区”或“互补决定区”(CDR)的区域。每个CDR的两侧均连接有相对保守构架区(FR)。认为是FR维持着可变区的结构完整性。免疫球蛋白轻链的CDRs和相应重链的CDRs构成了抗原结合位点。CDRs的高度可变性与抗体特异性的变化多端相一致。在此所使用的术语“受试者”指的是任何动物(如脊椎动物和无脊椎动物)包括但不限于，人类和其它灵长类动物、啮齿类动物(如小鼠、大鼠、和豚鼠)、lagamorphs(如兔)、牛科动物(如牛)、绵羊科动物(如绵羊)、山羊科动物(如山羊)、猪科动物(如猪)、马科动物(如马)、犬科动物(如狗)、猫科动物(如猫)、家禽(如鸡、火鸡、鸭子、鹅、其它家禽等)，还有未驯化的或野生的动物，包括但不限于，如有蹄动物类(如鹿)、熊类、鱼类、lagamorphs、啮齿类动物、鸟类等。该术语对年龄和性别没有限制。因此成年的和新出生的受试者，还有胎儿，不管是雄性还是雌性，都包括在该术语范围内。II.抗体的靶向构建体有多种不同结构的靶向构建体，但在bsAb靶向定位方法中要选择那些不仅能减少诱发免疫反应而且在体内能够快速清除的靶向构建体。疏水试剂是诱发强烈免疫反应的最好的试剂，而亲水试剂则是在体内清除速率最快的试剂，因此需要在亲水和疏水之间建立一个平衡。本发明是通过如下方法实现所述目的的，一方面依靠使用亲水螯合试剂来抵消一些有机部分所固有的疏水性。还有，通过选择，使靶向构建体的亚基具有相反的溶解特性，例如，当亚基是含有氨基酸的肽时，可以一部分选择疏水性的，一部分选择亲水性的。除肽外，还可使用碳水化合物作为亚基。靶向构建体可以包括具有两个氨基酸残基的肽骨架，优选两个到10个氨基酸残基，其可以与其它部分如螯合试剂相偶联。靶向构建体应当是一种低分子量构建体，优选分子量小于50,000道尔顿，并优选小于约20,000道尔顿、10,000道尔顿、或5,000道尔顿，包括任一能够与螯合试剂结合的金属离子。例如，肽DTPA-Tyr-Lys(DTPA)-OH(其中DTPA是二亚乙基三胺五乙酸)已经被用于产生抗分子中铟-DTPA部分的抗体。不过，通过使用不含铟的分子，并通过合适的筛选，能够产生抗酪氨酰-赖氨酸二肽的新的Abs。通常情况下，靶向构建体的抗原肽具有四个或更多个残基，如肽DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)，其中DOTA是1，4，7，10-四氮杂环十二烷基四乙酸，HSG是具有如下分子式的组胺琥珀酰甘氨酰基团可以使用不包含金属的肽作为免疫原，筛选与Phe-Lys-Tyr-Lys(SEQIDNO2)骨架反应的Abs。靶向构建体的半抗原也能提供免疫原性识别部分，例如一种化学半抗原。使用化学半抗原，优选HSG半抗原，能够使抗体和构建体之间具有高度特异性。这是因为抗HSG半抗原的抗体是已知的，能够很容易地组合成合适的bsAb。因此半抗原与肽骨架的结合能够产生特异性结合bsAb或bsFab的靶向构建体。本发明还提出将非天然的氨基酸，如D-氨基酸，掺入肽骨架结构中，这样当与最终的bsAb/构建体系统一起使用时，能够确保bsAb的识别靶向构建体的臂对靶向构建体是完全特异性的。本发明还提出其它类型的骨架结构，如由非天然氨基酸和peptoids构成的结构。作为免疫原的肽在肽自动合成仪上可以很方便地合成，其中使用了固相支持物和标准的重复正交脱保护和偶联技术。使用如乙酰基的标准保护基团将肽中的游离胺基保护起来，肽中的游离胺基在后面用于螯合连接。这样的保护性基团对本领域技术人员来说是公知的。参见Greene和Wuts的“ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，1999(JohnWileyandSons，N.Y.)。当制备的肽用于bsAb系统时，将肽从树脂上切割下来，最好使其产生相应的C-末端酰胺基，目的是抑制体内羧肽酶的活性。III.螯合部分靶向构建体中的亲水螯合部位能够确保靶向构建体在体内快速清除。除了亲水性外，在选择螯合剂时，应当选择具有金属结合特性的，并且能够随着后面的情况而变化，这至少对于那些bsAb表位是肽的一部分或是一种非螯合化学半抗原的靶向构建体来说应当是这样，金属-螯合络合物的识别不再是个问题。可以使用的金属-螯合组合包括2-苄基-DTPA和它的单甲基、环己基类似物，其中使用47Sc、52Fe、55Co、67Ga、68Ga、111In、89Zr、90Y、161Tb、177Lu、212Bi、213Bi、和225Ac用于放射成像和RAIT。在本申请中与bsAbs共同使用的是与非放射性金属如Mn、Fe、和Gd络合并用于MRI的螯合剂相同的螯合剂。大环的螯合剂如NOTA(1，4，7-三氮-环壬烷-N，N′，N″-三乙酸)、DOTA、和TETA(p-溴乙酰胺-苄基-四乙胺四乙酸)能够与多种金属和放射性金属，特别是放射性核素Ga、Y、Cu进行螯合。DTPA和DOTA类螯合剂，因为配体包括硬碱螯合功能基团如羧化物和胺，因而能够有效螯合硬酸阳离子，尤其是IIa和IIIa族的金属阳离子。通过将环定做为与金属离子相适应的大小，而使所制备的金属-螯合络合物更加稳定。也可以选择其它类型的环状螯合剂，如大环聚醚能够与用于RAIT的223Ra核素稳定结合。卟啉螯合剂能够与多种放射性金属螯合，并且还能够作为特定的非放射性的金属络合物用于bsAb介导的免疫光疗。此外，还可在靶向构建体上缀合多种类型的螯合剂，以结合多种金属离子，如非放射性的金属、诊断用放射核素和/或治疗用放射性核素。能够结合到靶向构建体的螯合试剂上的诊断用放射性核素包括，但不限于，110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、或其它δ-、β-或正电子-发射物。优选地，诊断用放射性核素的衰变能在25-10,000keV之间，更优选在25-4,000keV之间，更加优选在20-1,000keV之间，更加优选在70-700keV之间。激发正电子发射放射性核素的总衰变能量优选＜2,000keV，更优选低于1,000keV，最优选＜700keV。使用γ-射线检测的用作诊断剂的放射性核素包括，但不限于Cr-51、Co-57、Co-58、Fe-59、Cu-67、Ga-67、Se-75、Ru-97、Tc-99m、In-111、In-114m、I-123、I-125、I-131、Yb-169、Hg-197和TI201。γ-射线激发的放射性核素的衰变能优选为20-2000keV，更优选为60-600keV，更加优选为100-300keV。能够与靶向结构的螯合试剂结合的治疗用放射性核素包括，但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、和211Pb。治疗用放射性核素的衰变能优选在25-10,000keV之间。β-粒子激发核素的衰变能优选为25-5,000keV之间，更优选为100-4,000keV，最优选为500-2,500keV。还优选以俄歇激发粒子衰变的放射性核素，如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m、和Ir-192。β-粒子激发核素的衰变能优选＜1,000keV，更优选＜100keV，最优选＜70keV。还优选衰变时产生α-粒子的放射性核素。这样的放射性核素包括，但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、和Fm-255。α-粒子激发放射性核素的衰变能优选为2,000-9,000keV，更优选为3,000-8,000keV，最优选为4,000-7,000keV。在美国专利No5,753,206中公开的螯合剂，尤其是缩氨基硫脲乙醛酰半胱氨酸(Tscg-Cys)和氨基硫脲-乙酰半胱氨酸(Tsca-Cys)螯合剂有利于结合软酸阳离子，如Tc、Re、Bi和其它过渡金属、镧系元素和锕系元素，所述元素能够紧密结合于弱碱性配体，尤其是含硫的或含磷的配体。可以在肽上连接一种以上的螯合剂，如结合In(111)阳离子的类似于DTPA的硬酸螯合剂，和结合Tc阳离子的软酸螯合剂(如含硫醇基团的螯合剂，如Tscg-Cys)。因为抗di-DTPA半抗原的抗体是已知的(Barbet′395，supra)，而且能够很容易地偶联到一种靶抗体形成bsAb，因此在靶向定位方案中，可以使用带有非放射性的di-DTPA螯合剂和另外一种螯合剂的肽半抗原来结合放射性同位素，即用于靶向放射性同位素。这种肽的一个实例是Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO7)。肽可以预先加载In(III)，然后用99-m-Tc阳离子标记，DTPA优先螯合In(III)离子，含硫醇基团的Tscg-Cys优先螯合Tc阳离子。其它硬酸螯合剂，如NOTA、DOTA、TETA等可以代替DTPA基团，可以使用模拟技术生产对它们特异性的Mabs，从而产生出抗di-DTPAMab。应当意识到，可以合并两种不同的硬酸或软酸螯合剂组成接头，例如，因为阳离子的尺寸、螯合环的几何性状和阳离子优选的复合离子结构是存在差别的，因此不同尺寸的螯合环可以在两种不同的硬酸阳离子或两种软酸阳离子中间进行选择性结合。这样可以使用两种不同的金属合并成为一个可被前靶向定位的bsAb捕获的接头，金属中的一种或两种可以是放射性的或是用于增强MRI的。优选的螯合剂包括NOTA、DOTA和Tscg及其组合。这些螯合剂掺入后形成具有如下结构的螯合剂-肽复合基序(a)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)；(b)DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)；(c)Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)；(d)DOTA-Phe-Lys(HsG)-D-Tyr-Lys(HsG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)；(e)(Tscg-Cys)-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(DOTA)-NH2(SEQIDNO1)；；和(SEQIDNO5)(SEQIDNO6)已经表明所述的螯合剂-肽缀合物(f)和(g)能够结合68Ga，因此可以用于正电子发射体层摄影(PET)。使用常用的化学方法使螯合剂与靶向构建体中的肽相偶联，其中的一些将在下面的实施例中加以详细描述。简要地说，在合成肽Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)过程中，首先将Aloc-Lys(Fmoc)-OH连接到肽合成仪Rink酰胺树脂上。在此所使用的保护性基团缩写“Aloc”和“Fmoc”，指的是烯丙氧基羰基和芴基甲氧基羰基。然后使用标准Fmoc自动合成方案将Fmoc-Cys(Trt)-OH和TscG加到赖氨酸的侧链，形成如下的肽Aloc-Lys(Tscg-Cys(Trt))-rink树脂。然后除去Aloc基团。然后在合成仪上合成如下的肽“Lys(Aloc)-D-Tyr-Lys(Aloc)-Lys(Tscg-Cys(Trt))-rink树脂(SEQIDNO4)。然后进行N-末端酰化作用，并除去侧链Aloc保护基团。然后用活化的N-三苯甲基-HSG-OH处理所得到的肽，直到用Kaiser在树脂中检测不到胺类为止。参见Karacay等BioconjugateChem.11842-845(2000)。Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)的合成将在以下作出详细描述。IV.制备金属螯合物的方法螯合剂-肽缀合物在固态时能够保存很长时间。可以把它们分成单位剂量用于与金属的结合反应，也可以以单位剂量的固态、液态、或半液态溶液、冷冻溶液或冻干制品的形式进行保存。可以通过公知的方法对它们进行标记。通常情况下，在进行螯合时，所采用的硬酸阳离子是以合适的盐溶液形式存在，它能够被硬酸螯合剂螯合，也能被软螯合剂螯合。但是，随后添加容易与软酸螯合剂螯合的软酸阳离子，其能够置换与软酸螯合剂已经螯合了的任何硬酸阳离子。例如，即使存在过量的不带放射性111InCl3，99m-Tc(V)葡庚糖酸盐或Tc阳离子(由氯化锡和Na99m-TcO4原位产生的)和Na99m-TcO4对软酸螯合剂的标记，仍然是定量进行的。其它软酸阳离子如186Re、188Re、213Bi和二价或三价的阳离子Mn、CO、Ni、Pb、Cu、Cd、Au、Fe、Ag(单价)、Zn、和Hg等，尤其是64Cu、和67Cu，其中的一些阳离子用于放射免疫检测或放射免疫治疗，所述阳离子通过类似的方法被装载到接头肽上。Re阳离子也能够由高价铼的盐和二价锡离子产生，或使用一种预还原铼葡庚糖酸盐或其它过渡螯合剂来生成Re。因为与还原Tc相比，还原高价铼需要更多的二价锡离子(最终浓度一般超过200μg/mL)，因此需要注意确保高浓度的二价锡不要还原二硫键环化肽中的敏感的二硫键。在铼放射性标记中，使用了与Tc-99m相似的过程进行标记。制备Tscg-Cys-配体的ReO金属络合物的方法之一是将肽与ReOCl3(P(Ph3)2进行反应，也可以使用其它还原性成分如ReO(乙二胺)2与肽进行反应。V.施用方法应当注意的是，以下讨论主要集中在使用本发明双特异性抗体和靶向构建体治疗病灶组织。本发明实现了将本发明双特异性抗体和靶向构建体用于治疗和/或正常组织或器官的成像，其中使用了美国专利号6126916、6077499、6010680、5776095、5776094、5776093、5772981、5753206、5746996、5697902、5328679、5128119、5101827和4735210中的方法，在此全文引入所述文献。在此所使用的术语“组织”指的是，但不限于卵巢组织、胸腺组织、甲状旁腺组织、骨髓组织或脾组织。在靶向正常组织时，一个重要的用途是鉴定和治疗组织的异位(即其位置发生了转移)，如子宫内膜异位症。施用bsAb和靶向构建体可以通过如下方式，在施用与接头部分连接的治疗剂之前一段时间，施用bsAb。本领域技术人员根据所使用试剂的特定性质，能够很容易地对试剂施用的剂量和时间间隔进行设计。如果首先给予的是bsAb-F(ab’)2衍生物，则在施用靶向构建体之前，应当等待1-6天。如果作为初级靶向载体的是IgG-Fab’bsAb缀合物，则在施用接头部分之前，需要等待较长一段时间，一般在3-15天。可选择地，bsAb和靶向构建体可以以一种鸡尾酒的形式同时施用，也可以依次施用。有多种诊断和治疗剂均能缀合到靶向构建体上。一般来说，诊断和治疗剂包括同位素、药物、毒素、细胞因子、细胞因子缀合物、激素、生长因子、缀合物、放射性核素、对照试剂、金属、细胞毒性药物、和免疫调节剂。例如，使用钆进行磁共振成像，缀合荧光素后用于光动力学治疗。另外，对照试剂可以是MRI对照试剂，如钆离子、镧离子、锰离子、铁离子、铬离子、铜离子、钴离子、镍离子、镝离子、铼离子、铕离子、铽离子、钬离子、钕离子、或其它可对照标记，也可以是CT对照试剂，和超声对照试剂。另外的诊断剂包括荧光标记化合物如荧光素异硫氰酸盐、若丹明、藻红素、藻青素、别藻蓝蛋白、荧光胺、化学发光化合物(包括鲁米诺、异鲁米诺、芳烃吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯)、和生物发光化合物(包括荧光素、荧光素酶和水母素。放射性核素也能被用作治疗和/诊断剂，包括如90Y、111In、131I、99mTc、186Re、188Re、177Lu、67Cu、212Bi、213Bi、211At。治疗剂还包括，如化学治疗药物如长春花生物碱、蒽环类药、epidophyllotoxinw、紫杉烷、抗代谢药、烷基化试剂、抗体、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂试剂、抗心绞痛试剂和凋亡试剂，尤其是多索鲁比辛、甲氨蝶呤、泰素、CPT-11、喜树碱、及它们的衍生物和其它种类的抗癌试剂。其它可用于制备免疫缀合物和抗体融合蛋白的治疗剂包括氮芥、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCINENCES，19thEd.(MackPublishingCo.1995)和GOODMANANDGILMAN′STHEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS，7thEd.(MacMillanPublishingCo.1985)，还有所述出版物的修订版记载了可用的治疗剂。其它可用的治疗剂，如试验药物，是本领域技术人员公知的。治疗剂还可以包括，但不限于，其它药物、药物前体和/或毒素。术语“药物”、“药物前体”和“毒素”在说明书详述部分加以区分。术语“诊断剂”或“诊断”包括但不限于检测试剂、检测、或定位。当靶向构建体包括诊断剂时，优选在施用带有诊断剂的靶向构建体之前施用bsAb。在施用诊断剂之前，要为bsAb留出足够的时间，使之靶向定位于病灶组织，诊断剂是以靶向构建体的方式施用，最后进行成像。体腔中肿瘤检测可以通过如下方式进行，对不同的身体结构发射适当波长的光并随后接收，然后直接或间接进行观察，或者通过特殊的检测器，如放射性探测器或荧光检测器等。身体任何部位的伤病都可以观测到，只要非离子射线能够递送，并能够重新捕获从身体结构反射回来的射线。例如，PET，一种高分辨率、非侵入性的成像技术，与本发明抗体和靶向构建体一起用于人病灶的造影。在PET过程中，检测到由正电子衰变产生的511keV的γ-光子。与诊断剂可以一起使用的还有X-射线、计算机化体层摄影(CT)、MRI和γ-成像(如单光子发射计算机化体层摄影(SPECT))。正如前面所描述的，靶向构建体可以包括放射性诊断剂，其放射出25-10,000keV的γ-、β-、α-和俄歇-粒子和/或正电子。这样的试剂的例子包括但不限于，18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、111In、123I、125I、124I、131I、154-158Gd、和175Lu。本发明的bsAbs或bsFabs能够被用于光动力学治疗(PDT)，这在美国专利6096289、4331647、4818709、4348376、4361544、4444744、5851527中有所记载。在PDT过程中，给受试者施用一种感光物，如血卟啉衍生物如二血卟啉醚。使用光，如630nm，来激活抗肿瘤活性。可用作替代感光物的包括那些可以在较长波长下使用的感光物，这样皮肤可以接受较少的光。感光物的例子包括但不限于，苯卟啉一元酸环A(BPD-MA)、本红紫素锡(SnET2)、磺化酞菁铝(AlSPc)和德卟啉镥(Lutex)。另外，在进行PDT过程中，诊断剂可以注射，例如，系统地，内窥镜采用激光诱导荧光来检测已与光激活试剂连接的癌症的位点，其中内窥镜包括无线的胶囊大小的内窥镜或摄像头。例如，该项技术已经被用于早期肺部肿瘤的荧光支气管镜检。Doiron等Chest7632(1979)。在另外一个实例中，抗体和抗体片段用于单光子发射。例如，在施用本发明抗体或抗体片段之后，给受试者施用一种Tc-99m-标记的诊断剂。然后用一种能够产生单光子射线的γ-摄像头扫描受试者，进行计算机化体层摄影，分辨病灶或肿瘤位点。可以将光活化试剂或染料缀合到抗体复合物，获得治疗用免疫缀合物。已经将荧光素和其它发色基团或染料，如对可见光敏感的卟啉，用于检测和治疗病灶，其中给病灶照射合适波长的光。在治疗方面，这被称作光照射、光治疗、或光动力学治疗(Jori等(eds.)，PhotodynamictherapyofTumorsandOtherDiseases(LibreriaProgetto1985)；vandenBergh，Chem.Britain22430(1986))。另外，将单克隆抗体偶联到光活化染料用于进行光治疗。Mew等，J.Immunol.1301473(1983)；idem.，CancerRes.454380(1985)；Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA838744(1986)；idem.，Photochem.Photobiol.4683(1987)；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.288471(1989)；Tatsuta等，LasersSurg.Med.9422(1989)；Pelegrin等，Cancer672529(1991)。然而，这些早期的研究没有包括用于内窥镜治疗的用途，尤其是使用抗体片段或亚片段。因此本发明完善了包含光活性试剂或染料的免疫缀合物在治疗上的应用。可以使用不透射线的和作为对照的材料来加强X-射线检测和计算机化体层摄影的效果，这样的材料包括碘化合物、钡化合物、镓化合物、铊化合物等。特定的化合物包括钡、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘西他酸、碘达胺、胆影酸、碘氧胺酸、iogulamide、碘海醇、碘异酞醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、iosemeticacid、碘肽硫、碘替酸、碘酞酸、碘曲西酸、碘克酸、羟泛影酸、胺碘苯丙酸、葡甲胺、甲泛葡胺、甲泛影酸钠、丙碘酮或氯化亚铊。可以使用的超声对照材料包括葡聚糖和脂质体，尤其是气体填充的脂质体。在一个实施方式中，一种免疫调节剂，如细胞因子，也可以通过接头或其它本领域已知的方法缀合到靶向构建体上。在此所使用的术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素，如肿瘤坏死因子(TNF)、和造血因子，如白介素(如白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、和IL-18)，集落刺激因子(如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))，干扰素(如干扰素-α、-β、-γ)，干细胞生长因子命名为“S1因子”、红细胞生成素和血小板生成素。合适的免疫调节剂的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、干扰素-γ、TNF-α等。靶向构建体也可以与酶缀合，其中的酶能够在靶位点活化药物/药物前体或能够通过控制身体的解毒途径来提高治疗效果。在施用bsAb之后，施用缀合了酶的含有低分子量半抗原的靶向构建体。通过bsAb与靶向构建体的结合，使酶前靶向定位于靶位点，之后注射一种已知能够在靶位点起作用的细胞毒性药物。药物可以是一种能够在体内被哺乳动物一般的解毒过程解毒的，并形成低毒性中间体的药物。例如，能够被肝脏转化为低毒性葡糖苷酸化合物的药物。解毒中间体能够随后在靶位点被前靶向定位的酶重新转换为原来的具有较高毒性的形式，从而提高药物在靶位点的细胞毒性。可选择的，可以施用一种能够被前靶向定位的酶转化为活性药物的药物前体。前靶向定位的酶通过回收再利用解毒的药物，提高了治疗效果。该过程需要使用酶-药物组合。可选择的，将含有酶的靶向构建体与靶bsAb混合，之后给患者施用。在施用药物前体之前，需要等待足够长的时间，以使bsAb靶向构建体-缀合物定位于靶位点，并使未结合的靶向构建体从循环中清除出去。正如前面所讨论的，药物前体在施用后被前靶向定位的酶转化为药物。用于抗癌治疗的某些细胞毒性药物在血清中的溶解性相对较低。另外，一些药物在未缀合时具有相当的毒性，将它们转化为药物前体能够显著降低其毒性。将溶解性很低的药物转化为具有较高溶解性的复合物，如葡糖苷酸、亲水酸的酯或亲水胺的酰胺，都能提高它们在血浆水相中的溶解度，并能提高它们通过静脉、动脉或毛细血管细胞壁，到达肿瘤周围组织液的能力。药物前体分解后在靶位点沉积了低溶解性的药物。在美国专利号5851527中，Hansen描述了多个这样的药物前体-到-药物转化的例子。身体对某些毒性物质的解毒方法是，在肝脏中将某些毒性物质如芳香族或脂环族醇、硫醇、酚和胺转化为葡糖苷酸，从而使它们的毒性降低并使它们更容易排泄到尿中。能够转化为所述底物的一个典型的抗肿瘤药物是表阿霉素，它是多索鲁比辛(阿霉素)的4-差向异构体，它是一种蒽环类糖苷，已经证明它是人β-D-葡糖苷酸酶的一个底物，参见ArcamoneCancerRes.455995(1985)。其它类似物具有较少的极性基团，预期它们更具有亲脂性，并更能够进行所述过程。其它具有芳香族或脂环族醇、硫醇、酚和胺基团的药物或毒素也可以形成所述复合物形式。这些药物、或其药物前体均适用于本发明的提高位点特异性的方法。药物前体CPT-11(伊立替康)在体内被羧酸酯酶转化为活性代谢物SN-38。因此本发明的一个用途是，施用一种靶向肿瘤的bsAb和一种半抗原(如di-DTPA)，然后注射di-DTPA-羧酸酯酶复合物。在获得合适的肿瘤/背景定位比率后，给予CPT-11，定位于肿瘤的羧酸酯酶在肿瘤处将CPT-11转化为SN-38。活性SN-38的溶解度很低，因此它会沉积在肿瘤附近，并随后对邻近的表现为靶向抗原阴性的肿瘤细胞发挥作用。这是本发明方法的一个优点。本发明公开了一种修饰形式的羧酸酯酶，其包含在本发明范围内。参见如Potter等，CancerRes.582646-2651(1998)和Potter等，CancerRes.583627-3632(1998)。依托泊苷是一种被广泛应用的抗癌药物，通过形成葡糖苷酸而使它的毒性大大降低，这包括在本发明范围内。参见如Hande等，CancerRes.481829-1834(1988)。可以由细胞毒性药物制备葡糖苷酸复合物，并作为肿瘤治疗剂注射到已被mAb-葡糖苷酸酶复合物前靶向定位的肿瘤。参见如Wang等，CancerRes.524484-4491(1992)。当然，该复合物还可以用于在此描述的前靶向定位方法。类似的，现有技术中已经描述了来自于柔红霉素和多索鲁比辛衍生物的药物前体与羧酸酯酶和葡糖苷酸酶一起使用的实例。参见如Bakina等，J.MedChem.404013-4018(1997)。本发明可以使用的其它药物前体/酶组合的实例包括，但不限于，酚芥的羟基衍生物的葡糖苷酸药物前体和β-葡糖苷酸酶；酚芥或CPT-11和羧肽酶；氨甲喋呤取代的α-氨基酸和羧肽酶A；药物(如6-巯嘌呤、多索鲁比辛)的青霉素或头孢菌素复合物和β-内酰胺酶；依托泊苷磷酸盐和碱性磷酸酶。可选择的，在半抗原上可以缀合能够在靶位点活化药物前体或能够通过控制身体的解毒途径而提高治疗效果的酶。在施用前靶向定位的bsAb之后，给受试者施用所述酶-半抗原缀合物，使之直达靶位点。在酶定位于靶位点以后，注射一种已知能够在靶位点起作用的细胞毒性药物，或其药物前体，其中药物前体在原位被已靶向定位的酶转化为所述药物。正如上面所述的，药物是一种能够被哺乳动物正常解毒进程解毒的并形成低毒性中间体的药物，低毒性中间体通常是葡糖苷酸。解毒的中间体，如葡糖苷酸，在靶位点被前靶向定位的酶重新转化为毒性更强的形式，并由此增强了药物在靶位点的细胞毒性。这可以使药物再利用。同样的，所施用的药物前体也能够通过正常的生物过程转化为活性药物。前靶向定位的酶通过使解毒药物再利用，而提高了药物的治疗效果。该方法适用于所有的酶-药物组合。在另外的实施方案中，酶-半抗原缀合物可以在施用前与bsAb混合。在经过足够的时间以使酶-半抗原-bsAb缀合物定位到靶位点并使未结合的缀合物从循环中清除后，再施用药物前体。如上所述，药物前体在原位被前靶向酶转化为药物。本发明进一步计划应用本发明的bsAb和诊断剂进行硼中子捕获治疗(BNCT)方案。BNCT是一种二元系统，其中定位于肿瘤的10B原子通过中子照射使肿瘤细胞接受离子照射。BNCT基于核反应理论，当一种稳定的同位素，同位素富集10B(有19.8％的天然丰度)在热中子的辐照下，发生了核反应，产生出α-粒子和7Li原子。这些粒子的路径约为一个细胞的直径，因此具有很高的线性能量传递。核反应产生的粒子中，仅有几个短范围的1.7MeVα-粒子能够靶向细胞核并摧毁它。如用BNCT成功治疗癌症，需要一种能够将高浓度的10B定位于肿瘤位点，同时使非靶向组织基本上没有硼的方法。美国专利6228362描述了使用前靶向定位bsAb进行BNCT治疗受试者肿瘤的组合物和方法，并且在实施本发明时可以将所述组合物和方法很容易地进行修改。在本发明的另外一个实施方式中，靶向构建体的肽骨架上缀合了一种药物前体。给患者施用前靶向定位的bsAb，并使之定位于靶并使之基本上不存在于循环中。一段时间以后，施用包含药物前体(如聚-谷氨酸(SN-38-酯)10)的靶向构建体，由此将药物前体定位于特定的靶肿瘤。已知，因为肿瘤内或肿瘤周围细胞的高裂解率，从细胞内释放了大量的酶，因此肿瘤中酶的含量很高。技术人员可以选择合适的能够被这些酶活化的药物前体，来充分利用所述条件。例如，羧酸酯酶能够活化聚-谷氨酸(SN-38-酯)10药物前体，它切割聚-谷氨酸(SN-38-酯)10的酯键，在肿瘤部位释放出高浓度的游离SN-38。可选择地，也可选择其它合适的酶定位于肿瘤位点。药物从靶向构建体上切割下来后，被肿瘤细胞内在化。可选择的，通过在靶部位的交联作用，使药物作为完整复合物的一部分被内在化。靶向构建体能够诱导肿瘤结合bsAb的内在化，并由此因为提高了内在化的药物水平，而提高药物治疗效果。有多种肽载体适合缀合药物前体，包括聚氨基酸，如聚赖氨酸、聚谷氨酸(E)、聚天冬氨酸(D)，包括其D-氨基酸类似物共聚物，如聚(Lys-Glu)即poly[KE]，两种氨基酸的比例从1∶10-10∶1。也可以使用含有多种氨基酸的共聚物，如聚(Lys-Ala-Glu-Tyr(SEQIDNO8)(KAEY；5∶6∶2∶1)。较少的多聚载体可以通过固相肽合成技术来合成，固相肽合成技术可以很容易合成链长为2-50个氨基酸残基的多肽。除了能得到具有准确结构的多肽外，此项技术的第二个优点是可以在链上特定的位点连接上一个或任意数目的化学接头。这些接头在后面可以用于连接预定数目的识别和治疗半抗原。聚乙二醇[PEG]在体内具有合适的特性，能够用于双特异性抗体药物前体方法。在SN-38和PEG羟基之间插入二价酸如琥珀酸，从而在SN-38的羟基和标准的双羟基PEG的两个末端之间导入酯接头，从而生成了SN-38-O-CO(CH2)2CO-O-PEG-O-CO(CH2)2CO-OSN-38。所产生的二-SN-38-PEG是SN-38-聚合物类药物前体中聚合数目最少的一个。PEG衍生物具有理想的体内特性，但由于其二聚性能而具有有限的负载能力，所以制备了具有更大的携带半抗原能力的PEG共聚物，如Poiani等所描述的。参见如Poiani等，BioconjugateChem.，5621-630，1994。当PEG发生双(琥珀酰亚胺)碳酸盐衍生和与多功能二元胺如赖氨酸共聚合时，PEG衍生物的两端均被活化。所述共聚合的产物中，包含(-Lys(COOH)-PEG-Lys(COOH)-PEG-)n重复单元，其中赖氨酰羧基不参与共聚过程，所述共聚物可用于连接SN-38残基。SN-38残基与游离的羧基反应，生成具有(-Lys-(COOH)-PEG-Lys(COOH)-PEG-)n链的SN-38酯。其它的合成聚合物也可用于携带识别半抗原和药物前体，包括N-(2-羟丙基)甲丙烯酰胺(HMPA)共聚物、聚(苯乙烯-共顺丁烯二酸)酐(SMA)、聚(丁二烯醚顺丁烯二酸酐)(DIVEMA)、聚乙烯亚胺、乙氧基化聚乙烯亚胺、starburstdendrimers、和聚(N-乙烯吡咯烷酮)(PVP)。例如，包含多个酐单元的DIVEMA聚合物与限量的SN-38反应，在聚合物骨架上生成具有预期取代比率的药物。剩余的酐基团在有水的条件下打开生成游离羧酸酯。使用标准的水溶性肽偶联试剂如1-乙基-3-(3-双甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)活化有限的游离羧酸酯，并使之偶联到具有游离氨基的识别部分。后者的一个例子是组胺，在过去已有其抗体。多种药物前体都能缀合到靶向构建体上。所述聚合物的实例涉及SN-38，其是药物前体CPT-11(伊里诺坎)的活性代谢产物。SN-38具有芳香族羟基，这在上面的描述中其用于生成芳香基酯，芳香酯对酯酶类的酶非常敏感。类似的，一种广泛用于化疗的，喜树碱类似物拓普替康，也具有可利用的芳香族羟基，能够以SN-38所描述的类似的方式来生产对酯酶敏感的聚合物药物前体。阿霉素也含有芳香族羟基，使用与所述喜树碱类相似的酸催化反应，能够使其偶联到含有羧酸酯的聚合载体上。类似的，阿霉素类似物如柔红霉素、表阿霉素、柔红霉素也能以类似的方式偶联。具有氨基“化学接头”活性、足以化学偶联到聚合载体上的阿霉素和其它药物能够通过其游离氨基通过多种途径有效偶联到载体分子上。提供游离羧酸酯基团的聚合物能够被活化(如被EDC活化)，活化的聚合物与阿霉素混合，通过酰胺键直接将药物连接到聚合物的侧链上。通过混合适合的能够被切割的交联试剂，如乙烯glycobis(琥珀酰亚胺基琥珀酸盐((EGS，PierceChemicalCo.，Rockford，IL)或双-[2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧)乙基]砜(BSOCOES，MolecularBioscineces，Huntsville，AL)，在与双琥珀酰亚胺酯基团反应后，使两个胺交联为两个酰胺，通过所述方式，含有氨基的药物也能够被偶联到带有氨基链的聚合物上。这是非常有利的，因为这些基团保持了对酶切割的敏感性。例如，(阿霉素-EGS)n-聚-赖氨酸在EGS交联链上保留了对酶切割敏感的二酯基团，可以通过酶如酯酶进行切割。使用已知的过程，还能将阿霉素缀合到多种肽上，例如，HyBnK(DTPA)YK(DTPA)-NH2，(HyBn＝p-H2NNHC6H4CO2H)。参见Kaneko等.，JBiocoyugateChem.，2133-141，1991.。在一个优选实例中，治疗复合物包含偶联到载体上的阿霉素，其中载体包含胺残基，和一种螯合试剂，如DTPA，形成了DTPA-肽-阿霉素复合物，其中DTPA形成前靶向定位bsAb的识别部分。优选的，所述载体包含酪氨酰-赖氨酸二肽，如Tyr-Lys(DTPA)-NH2，更优选地，载体包含Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2。阿霉素苯基腙缀合到含双DPTA的肽上，这从治疗角度来说尤为理想。氨甲碟呤也有可利用的氨基，能够偶联到含有活化的羧酸酯的聚合物上，偶联方式与阿霉素类似。另外，它还有两个谷氨酰羧基(α和β)，其也能够被活化，并偶联到含氨基的聚合物上。氨甲碟呤的游离羧酸酯基团也能在原位(EDC)被活化，活化的药物与含氨基的聚合物混合时，能够通过酰胺键直接将药物连接到聚合物的侧链上。使用体积排阻层析或离子交换层析，可以很容易地将过量的未反应的或非交联反应的药物从聚合物-药物复合物中分离出去。Maytansinoids和calicheamicins(如esperamycin)含有双-和三硫醚键，能够被切割为具有单个硫醇基团的成分，以便能够用于下面的化学操作。Thiomaytensinoid或thioespera-mycin首先与交联试剂如顺丁烯二酰亚胺-肽反应，其中的肽对肽酶的切割敏感。随后肽的C-末端被活化，并偶联到含氨基的聚合物上，如聚赖氨酸。在另外的实施方式中，双特异性抗体将治疗或药物前体聚合物和放射性核素一起介导到体内的靶上，由此将化疗和放射性免疫治疗结合在一起。其中所述每种治疗剂可以缀合到同一靶向构建体上，同时施用，或者将核素缀合到第一靶向构建体上，药物缀合到第二靶向构建体上，分别施用。在其中一个简单的实例中，构建了包含一个药物前体和一个核素的肽。例如，三肽Ac-Glu-Gly-Lys-NH2可以用作靶向构建体的载体部分，SN-38连接到该部分的γ-谷氨酰羧基上形成芳基酯，螯合物DOTA连接到第五个氨基上形成酰胺，从而生成了复合物Ac-Glu(SN-38)-Gly-Lys(DOTA)-NH2。随后根据成像或治疗的需要，应用不同的金属对DOTA螯合物进行放射性标记，放射性金属包括In-111Y-90、Sm-153、Lu-177、和Zr-89。当金属-DOTA复合物在靶向构建体中作为可识别半抗原时，对于金属DOTA复合物来说，需要所使用的次级识别抗体对该金属DOTA复合物具有非常高的亲和力。一般来说，亲和力(logKa)应在6-11之间。聚合肽，如聚[Glu(SN-38)10-Lys(Y-90-DOTA)2]，与所述低分子量肽一样容易制备，本发明优选聚合肽。另外，可以使用三重取代的聚合物，如聚[Glu(Sn-38)10-Lys(Y-90-DOTA)n(组胺-琥珀酸酯)m，其中n和m是整数，从而使识别试剂独立于放射免疫治疗剂。存在于肿瘤位点的羧酸酯酶将药物前体活化，或通过第二靶向构建体而靶向定位于肿瘤位点的羧酸酯酶将药物前体活化。可选择的，在不同的步骤中，分别施用化疗和放射免疫治疗剂，进行联合治疗。例如，首先给表达CEA-肿瘤患者施用一种bsAb，其中的bsAb具有至少一个特异性结合CEA的臂和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，其中所述靶向构建体的半抗原是一种钆-DOTA缀合物。然后，使用包含钆-DOTA-β-葡糖苷酸酶缀合物的靶向构建体对患者进行治疗。在足够使bsAb和酶实现定位并从正常组织中清除的一段时间以后，给予患者第二靶向构建体，该第二靶向构建体包含Ac-Glu(SN-38)-Gly-Lys(Y-90-DOTA)-NH2。该第二靶向构建体依靠在肿瘤部位上还没有与第一靶向构建体结合的bsAb的介导，定位于肿瘤。定位于靶位点的第一靶向构建体作用于Ac-Glu(SN-38)-Gly-Lys(Y-90-DOTA)-NH2，释放出游离的SN-38药物。通过使用没有底物限制的酶，将药物前体和它们各自的酶一起定位于靶位点，大大提高了活性药物的产量。该实例与现有的药物前体方案相比，具有显著的进步。在随后的步骤中，也就是在施用了作为所给予的靶向构建体一部分的核素之后，再施用药物前体-聚合物的另外一个优点是，使放射治疗和药物治疗协同作用，从而使疗效最大化。猜测经过RAIT的放射性治疗后，由于照射损伤，肿瘤变得更加容易“渗漏”。这可使聚合物-药物前体更完全并更深入进入肿瘤。可选择的，RAIT治疗剂可以连接到bsAb上，而不是连接到靶向构建体上。例如，首先给CEA表达肿瘤患者施用一种抗-CEA×抗-DTPA的bsAb，其中bsAb上缀合了Y-90-DOTA。在该例子中，优点是可以选择特定的抗-螯合物mabs，其中的抗-铟-DTPA抗体不会结合到钇-DOTA螯合物上。在Y-90-DOTA-抗-CEA×抗-铟-DTPA在肿瘤中达到最大浓度，并充分地从非靶组织清除之后，注射铟-DTPA-葡糖苷酸酶缀合物，使之特异性定位于CEA肿瘤位点。然后给患者注射聚合物-药物前体，如聚(Glu)(SN-38)10。后者在肿瘤位点被选择性切割为活性单体SN-38，从而成功联合了化疗和先前施用的RAIT疗法。还应当注意到，在本发明方法中可以使用如下的双特异性抗体或抗体片段，其具有至少一个特异性结合靶位点抗原的结合位点，和至少另外一个特异性结合抗体-酶复合物中酶部分的结合位点。可以在注射前使所述抗体与酶结合，该过程不需要将酶共价缀合到抗体上，或者首先注射所述抗体，并使之定位于靶位点，并在没有靶向定位的抗体基本上从哺乳动物的循环系统中清除出去之后，再注射酶，注射量和注射途径应当能够使足够量的酶到达已定位的抗体或抗体片段，并在原位与之结合形成抗体-酶复合物。还应当注意到，本发明还成功使用了多价靶结合蛋白，其具有至少三个不同的靶结合位点，如同专利申请系列号60220782中描述的一样。通过化学接头将几个Fab样片段交联在一起，即可获得多价靶结合蛋白。参见美国专利号5262524、5091542和Landsdorp等，Euro.J.Immunol.16679-83(1986)。多价靶结合蛋白还可以通过如下方法制备，将几个单链Fv分子(scFv)共价连接，从而形成一条多肽。参见美国专利号5892021。美国专利号6025165和5837242中描述了一种由scFv分子聚合形成的多价靶结合蛋白。Krott等，ProteinEngineering.10(4)423-433(1997)描述了一种包含三个scFv分子的三价靶结合蛋白。在使用bsAb和靶向构建体之间，可以使用一种清除试剂。本发明发现，本发明可以使用一种具有独特作用机制的清除试剂，即糖基化的抗-独特型Fab’片段，其靶向抗bsAb的病灶靶向臂。给予抗-CEA(MN-14Ab)×抗-肽bsAb，使之最大程度地定位于病灶靶位。给予一种命名为WI2的MN-14的抗独特型Ab，来清除残留的bsAb，优选使用糖基化形式的Fab’片段。清除试剂以单价形式与bsAb结合，所附加的糖基将整个复合物介导到肝脏，在这里进行快速的新陈代谢。然后给受试者施用与靶向构建体连在一起的治疗或诊断剂。所述WI2Ab与bsAb的MN-14臂具有非常高的亲和力，并且清除机制与其它已经公开的机制不同(参见Goodwin等，ibid)，该机制不涉及交联，因为WI2-Fab’是单价的。根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种适用于治疗或鉴定患者病灶组织的试剂盒，其包含一种双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂，以及一种包含载体部分的第一靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少一个可被双特异性抗体或抗体片段的至少一个臂识别的表位、和一个或多个缀合的治疗或诊断剂、或酶，试剂盒还可选择地包含一种清除组合物，其用于清除没有定位的抗体和抗体片段。该试剂盒还可选择性地包含一种药物前体，当第一靶向构建体包含能够在靶位点将药物前体转化为药物的酶、或包含能够将解毒的药物中间体重新转化为毒性形式并因此提高药物在靶位点的毒性的酶、或包含能够将在患者体内由自然过程活化并通过转化为低毒性中间体而解毒的药物前体从解毒的中间体重新转化为毒性形式，并由此提高药物在靶位点的毒性的酶。还可使用一种包含载体部分的第二靶向构建体，其中载体部分包含或携带至少一个可被双特异性抗体或抗体片段的至少另外一个臂识别的表位，和一种药物前体，当酶能够在靶位点将药物前体转化为药物的情况下。试剂盒还可包括能够促进鉴定或治疗病灶组织的仪器。例如可包括，但不限于应用装置，如注射器。试剂盒还可包括使用本发明进行鉴定或治疗病灶组织时所需的溶液。靶向构建体可以静脉内、动脉内、手术过程中、内窥镜、腹膜内、肌肉、皮下、胸膜内、鞘内施用，经过导管灌注、或病灶内直接注射，可以连续灌输、或通过单或多造影剂团施用，或经过其它本领域技术人员已知的用于诊断(检测)和治疗病灶组织的方法。此外，所述靶向构建体可以包括在其它检测和治疗病灶组织的方法中所使用的试剂，包括但不限于，将右旋糖苷或脂质体缀合到靶向构建体上用于超声，或将其它对照试剂缀合到靶向构建体上用于其它的成像形式，如上面已经描述过的X-射线、CT、PET、SPECT和超声。VI.生成抗体的方法可以使用公知的生产抗体的方法来生产肽骨架和/或半抗原的抗体(Abs)。例如，给免疫活性动物注射悬浮在弗氏完全佐剂中的免疫原，如(肽)n-KLH，其中KLH是匙孔血蓝蛋白，n＝1-30，随后再连续两次注射悬浮在不完全弗氏佐剂中的同样的免疫原静脉抗原加强后三天收集脾细胞。然后将收集的脾细胞与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合，培养所得克隆的上清液，其中克隆已经进行了直接-结合ELISA法抗-肽反应分析。使用最初的免疫原的肽片段分析所产生的Abs的特异性。这些肽片段可以使用肽自动合成仪来制备。对于制备Ab，分离酶-缺陷型杂交瘤，以便能够进行融合细胞系的选择。这项技术还可被用于制备抗一种或多种螯合物的抗体，如In(III)-DTPA螯合物。抗In(III)-di-DTPA的单克隆小鼠抗体是已知的(Barbet‘395supra)。本发明所使用的抗体对多种细胞表面或细胞内肿瘤相关抗原具有特异性，所述抗原可以用作标记物。这些标记可以是肿瘤产生的物质，或可以是在肿瘤位点富集的物质，其存在于肿瘤细胞的表面或存在于肿瘤细胞内，可能存在于细胞质内、细胞核内、或各种细胞器或亚细胞结构内。所述肿瘤相关标记公开在下列文献中，Herberman，“ImmunodiagnosisofCancer”，inFleishered.，“TheClinicalBiochemistryofCancer”347页(AmericanAssociationofClinicalChemists，1979)和美国专利号4150149、4,361,544、和4,444,744。还可参见如下的美国专利，Thorpe等的5,965,132、Thorpe等的6,004,554、Epstein等的6,071,491、Epstein等的6,017,514、Epstein等的5,882,626、Epstein等的5,019,368、和Thorpe等的6,342,221，所有所述文献在此引作参考。在以前的文献中，Herberman将肿瘤相关标记分成几类，包括癌胚抗原类、胎盘抗原类、致瘤或肿瘤病毒相关抗原、组织相关抗原、器官相关抗原、异常激素和正常抗原或其变种。偶尔情况下，使用肿瘤相关标记的亚基生产的抗体具有更高的肿瘤特异性，如绒毛膜促性腺激素(HCG)的β-亚基或癌胚抗原(CEA)的γ区，由其产生的抗体大大降低了与非肿瘤物质的交叉反应，参见美国专利号4361644和4444744。肿瘤脉管标记(如VEGF)、肿瘤坏死(Epstein的专利)标记、膜受体标记(如二氢叶酸受体，EGFR)、跨膜抗原标记(如PSMA)和致癌基因产物标记都可用作抗体或抗体片段的肿瘤相关的合适的靶位。正常细胞的标记，如果其在肿瘤细胞中表达很丰富，如B-细胞复合体抗原(如CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、和恶性B-细胞上的HLA-DR)、还有特定肿瘤细胞表达的细胞因子(如恶性T-细胞上的IL-2受体)，也适合作本发明抗体和抗体片段的靶位。其它公知的可用作本发明抗体和抗体片段靶位的肿瘤相关抗原包括，但不限于，CEA、CSAp、TAG-72、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-4、EGP-1、EGP-2、BrE3、PAM-4、KC-4、A3、KS-1、PSMA、PSA、韧粘素、T101、S100、MAGE、HLA-DR、CD19、CD20、CD22、CD30、和CD74。另外的令人感兴趣的标记是跨膜激活剂和CAML-相互作用剂(TACI)。参见Yu等，Nat.Immunol.1252-256(2000)。简单的说，TACI是一种恶性B-细胞的标记(如淋巴瘤)。此外，已知TACI和B-细胞成熟抗原(BCMA)通过类似于一种增殖-诱导配体(APRIL)。的肿瘤坏死因子而结合在一起。APRIL在体外能够刺激初级B细胞和T细胞的增殖，并能够在体内导致B-细胞的积累，从而使脾的重量增加。APRIL还与TALL-I(还称作BlyS或BAFF)竞争受体结合位点。尤其是可溶的BCMA和TACI特异防止APRIL的结合，并能够阻断初级B-细胞的APRIL-刺激的增殖。在小鼠中，BCMA-Fc也能够抑制抗匙孔血蓝蛋白和抗肺炎泛克的抗体的产生，这表明APRIL和/或TALL-I由经BCMA和/或TACI发出信号对于产生体液免疫是必须的。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI共同形成了一种两配体-两受体、涉及激发B、T细胞功能的途径。在生成对免疫原的初级抗体后，可以对抗体进行测序，并随后应用重组技术来制备。小鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合化，对本领域技术人员来说是公知的。例如，人源化单克隆抗体可以由如下过程来制备，将小鼠免疫球蛋白的轻链和重链可变区的互补决定区转导到人的可变区域，然后，用人的残基替换小鼠对应物的框架区。使用来自人源化单克隆抗体的抗体可以避免潜在的问题，该问题涉及鼠恒定区的免疫原性。现有技术已经记载了克隆小鼠免疫球蛋白可变区的常用技术，例如Orlandi等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA863833(1989)，在此全文引作参考。现有技术中也记载了生产人源化Mabs的技术，例如，Jones等Nature321522(1986)，Riechmann等，Nature332321(1988)，Verhoeyen等，Science2391534(1988)，Verhoeyen等Science2391534(1988)，Carter等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA894285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12437(1992)，和Singer等，J.Immun.1502844(1993)，所述所有文献在此引作参考。可选择地，可从转基因非人动物中获得完整的人抗体。参见如Mendez等，NatureGenetics，15146-156(1997)、美国专利号5633425。例如，从含有人免疫球蛋白转座子的转基因小鼠中回收人抗体。通过抑制小鼠内源免疫球蛋白基因，并将人免疫球蛋白转座子转导到小鼠，从而使小鼠的体液免疫系统人源化。人免疫球蛋白转座子非常复杂，含有大量的离散片段，其总量几乎占到人类基因组总量的0.2％。为了确保转基因小鼠能够生产出完整功能的抗体，必须将人类重链和轻链转座子的绝大部分区域转导到小鼠基因组中。所述目的是通过如下的方法逐步完成的，首先形成酵母人工染色体(YACs)，其在种系构造中既包含人类重链免疫球蛋白转座子，还包含人类轻链免疫球蛋白转座子。因为每个插入片段大小都在1Mb左右，因此构建YAC时需要免疫球蛋白转座子的重叠片段进行同源重组。获得两个YACs，其中一个包含重链转座子，另一个包含轻链转座子，通过将包含酵母球芽的YAC与小鼠胚胎干细胞融合的方法，将两个YACs分别转导到小鼠。然后将胚胎干细胞克隆显微注射到小鼠的胚泡。根据胚系传递YAC的能力，筛选得到嵌合雄性鼠，然后将嵌合雄性小鼠与小鼠抗体缺陷型的鼠进行杂交。将两个转基因胚系进行杂交，其中之一包含人类重链转座子，另一个包含人类轻链转座子，经过杂交产生了能够在免疫诱导下产生人类抗体的后代。通过微细胞介导染色体传递(MMCT)的方法，也能将未重排的人类免疫球蛋白基因转导到小鼠胚胎干细胞。参见如Tomizuka等，NatureGenetics，16133(1997)。在该方法中，将包含人类染色体的微型细胞与小鼠胚胎干细胞融合。在后代中稳定保留了所传递的染色体，并且成年嵌合体表现出了适当的组织特异性表达。可选择的，本发明的抗体或抗体片段可以衍生自从免疫球蛋白组合文库中分离的人类抗体片段。参见如Barbas等，METHODSACompaniontoMethodsinEnzymology2119(1991)，和Winter等，Rev.Immunol.12433(1994)，所述文献在此引作参考。在通过B-细胞永生化生产单克隆抗体方面，所存在的一些难题可以通过使用噬菌体展示在E.coli中构建和表达抗体片段的方法来加以克服。为了确保能够回收到亲和力高的单克隆抗体，所使用的组合免疫球蛋白文库必须有较大的库容量。所使用的一个典型的策略是，从免疫小鼠的淋巴细胞或脾细胞获得mRNA，然后使用反转录酶合成cDNA。通过PCR分别扩增重链基因和轻链基因，并连接到噬菌体克隆载体。从而构建了两个不同的基因文库，其中之一包含重链基因，另一个包含轻链基因。从每个文库中分离噬菌体DNA，将重链基因和轻链基因连接在一起，并经包装形成一个组合基因文库。其中的每个噬菌体均包含重链和轻链cDNAs的随机组合对，并在转染E.coli后，使转染细胞表达抗体链。为了鉴定识别预定抗原的抗体，将噬菌体文库进行涂板处理，从而将空斑中的抗体分子转移到滤膜。将滤膜与放射性标记的抗原一起温育，然后洗去过量的未结合的配体。经放射自显影，出现放射斑点的空斑即包含了与抗原结合的抗体。可以获得用于生产人类免疫球蛋白质粒文库的克隆和表达载体，例如，可从STRATAGENE克隆系统中获得所述克隆和表达载体(LaJolla，CA)。还有一个方法也可以用于获得高亲和力的scFv。参见如Vaughn等，Nat.Biotechnol.，14309-314(1996)。使用对应于所有已知VH、VK和Vλ基因家族的PCR引物，从非免疫的人类供体中分离V-基因，从而构建具有较大容量的scFv基因文库。在扩增后，将VK和Vλ库合并在一起组成一个库。将这些片段连接到噬菌粒载体上。然后将scFv接头连接到噬菌粒VL片段的上游。将VH和接头-VL片段扩增，并装配到JH区域。将得到的VH-接头-VL片段连接到噬菌粒载体。如同上面所描述的，可以使用滤膜、或免疫管(Nunc；Maxisorp)对噬菌粒文库进行淘选。从而得到类似于上面的结果，即从免疫兔的淋巴细胞或脾细胞构建组合免疫球蛋白文库，并在毕赤酵母中表达。参见如Ridder等，Biotechnology，13155-260(1995)。另外，在分离得到合适的scFv以后，可以通过亲和力成熟过程，如CDR3变异，和链改组过程使抗体片段具有更高的结合亲和力和更低的解离速度。参见如Jackson等，Br.J.Cancer，78181-188(1998)；Osboum等，Immunotechnology，2181-196(1996)。另外一种形式的抗体片段是编码单个CDR的肽。通过构建编码预期抗体的CDR的基因来获得CDR肽(“最小识别单元”)。例如，该基因可以通过如下方法制备，即使用聚合酶链式反应从抗体-生产细胞的RNA合成可变区。参见如Larrick等，MethodsACompaniontoMethodsinEnzymology2106(1991)；Courtenay-Luck，″GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies，″inMONOCLONALANTIBODIESPRODUCTION，ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION，Ritter等(eds.)，166-179页(CambridgeUniversityPress1995)；和Ward等，″GeneticManipulationandExpressionofAntibodies，″inMONOCLONALANTIBODIESPRINCIPLESANDAPPLICATIONS，Birch等，(eds.)，137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)。可以通过已知的技术制备bsAbs，例如，分别用胃蛋白酶消化抗-CEA肿瘤Ab和抗-肽Ab，形成它们各自的F(ab’)2。用半胱氨酸还原抗-CEA-Ab-F(ab’)2，生成Fab’单体单元，进一步将其与交联剂双(顺丁烯二酰亚胺基)正丁烷反应，生成Fab’-顺丁烯二酰亚胺部分。用半胱氨酸还原抗肽Ab-F(ab’)2，经纯化回收的抗肽-Fab’-SH与抗-CEA-Fab’-顺丁烯二酰亚胺反应，生成Fab’×Fab’双特异性的Ab。可选择的，抗肽Fab’-SH片段可以与抗-CEAF(ab’)2偶联，生成一种F(ab’)2×Fab’构建体、或与抗-CEAIgG偶联生成一种IgG×Fab’双特异性构建体。在其中一个实例中，所述IgG×Fab’构建体通过如下的位点-特异性方法来制备，即将抗肽Fab’的硫醇基团与抗-CEAIgG重链上的碳水化合物相连接，其中的碳水化合物已经用高碘酸盐氧化，之后通过与商业可获得的胼-顺丁烯二酰亚胺交联剂反应而使之活化。其中所使用的Ab可以通过公知的技术进行嵌合化或人源化。嵌合抗体是这样一种重组蛋白，其包含来自啮齿类动物抗体的可变区和互补决定区，同时抗体分子的其它部分来自人类抗体。人源化抗体是这样一种重组蛋白，其中鼠单克隆抗体的互补决定区已经进行了从鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区到人类可变区的转变。生产双特异性抗体和抗体片段可以使用多种重组方法。例如，可以转基因家畜的奶中生产双特异性抗体和抗体片段。参见如Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63141-147，1998；和美国专利5827690。构建两种DNA，其中分别含有编码免疫球蛋白重链和轻链对的DNA片段。将片段克隆到表达载体，其中表达载体包含一种优选在乳房上皮细胞中表达的启动子序列。这样的例子包括，但不限于，兔、牛、和绵羊酪蛋白基因的启动子，牛α-乳球蛋白基因的启动子，绵羊β-乳球蛋白基因的启动子，和鼠乳酸蛋白基因的启动子。优选的，插入片段的3’端连接有乳房特异性基因同源基因组序列。从而提供了聚腺苷酸化位点和转录稳定序列。将所述表达组件共同注射到受精原核，即哺乳动物的受精卵，然后将其植入雌性受体的子宫，使之发育。出生之后，用Southern分析方法筛选含有两种转基因的后代。为了形成本发明的抗体，在同一细胞中必须同时表达重链和轻链两种基因。使用本领域公知的标准免疫分析方法分析雌性转基因动物的奶，鉴定其是否含有预期的功能性抗体和抗体片段。可以使用本领域已知的标准方法纯化奶中的抗体。将编码小鼠轻链和重链可变区的cDNA片段与编码人类抗体C区的片段相连接，从而构建了一种嵌合的Ab。因为C区不能结合抗原，所以所述嵌合抗体不仅保留了与原来的小鼠Ab相同的抗原特异性，而且在序列上更加接近人类抗体。嵌合Ab仍然含有一部分小鼠的序列，它仍然具有免疫原性。人源化的Ab包含那些抗原识别必需的小鼠氨基酸。通过将来自鼠互补决定区的氨基酸构建到人类抗体框架中，来构建所述产物。其它的生产bsAbs的方法中包括工程化重组Abs，其含有附加的半胱氨酸残基，从而比一般的免疫球蛋白型交联得更加牢固。参见如FitzGerald等，ProteinEng.10(10)1221-1225，1997。另外一个进展是将两个或多个不同的具有所需双特异性的单链抗体或抗体片段连在一起形成工程化重组融合蛋白。参见如Coloma等，NatureBiotech.15159-163，1997。使用分子工程技术可以得到多种双特异性融合蛋白。其中的一种形式，双特异性融合蛋白是单价体，其组成例如，由scFv和Fab组成，其中scFv有第一抗原结合位点，Fab片段有第二抗原结合位点。双特异性融合蛋白的另外一种形式是二价体，其组成如，带有两个第一抗原结合位点的IgG，和带有两个第二抗原结合位点的两个scFv。应用重组技术也能在哺乳动物细胞中生产功能性双特异性单链抗体(bscAb)，也被称作双抗体(diabodies)。参见如Mack等，Proc.Acad.Sci.，927021-7025，1995。例如，应用重组方法将两条单链Fv片段通过甘氨酸-丝氨酸接头连接到一起。应用标准PCR方法分离所需的两个抗体的V轻链(VL)和V重链(VH)区。分别从VL、VH各自的杂交瘤中获取VL和VH的cDNA，然后将其结合在一起形成单链片段，该过程使用了两步法融合PCR技术。第一步的PCR是导入(Gly4-Ser1)3接头(SEQIDNO9)，第二步PCR是连接VL和VH扩增子。然后，将每个单链分子克隆到细菌表达载体。在扩增之后，切除其中一条单链分子，将其亚克隆到另外一个载体，该载体包含第二条单链分子。所得到的bscAb片段亚克隆到真核表达载体。将该载体转导到中国仓鼠卵巢细胞，使其表达所述功能性蛋白。双特异性融合蛋白也可以以类似的方法进行制备。双特异性单链抗体和双特异性融合蛋白均包括在本发明范围内。连接了两个或多个不同单链抗体或抗体片段的双特异性融合蛋白也可以类似的方法来生产。可以应用重组技术来生产多种融合蛋白。例如，利用重组技术能够生产包含来自人源化单克隆抗-CEA抗体的Fab片段和来自鼠抗-diDTPA的scFv片段的融合蛋白。一种可变接头，如GGGS(SEQIDNO10)，将scFv连接到抗-CEA抗体的重链恒定区。可选择的，scFv也可以连接到hMN-14的轻链恒定区。通过PCR反应将适合连接Fd重链和scFv的接头序列导入VL和VH区。然后，将编码scFv的DNA片段连接到包含编码CH1区DNA序列的阶段性(Staging)载体上。切除scFv-CH1构建体，并将其连接到包含编码抗-CEA抗体VH区DNA序列的载体上。使用所得到的载体转染哺乳动物细胞，使其表达双特异性融合蛋白。使用埃希氏大肠杆菌表达系统能够大量生产bscAb和融合蛋白。参见如Zhenping等，Biotechnology，14192-196，1996。两个“交叉-重叠”scFv片段在E.coli中共表达，可以生成功能性bscAb，所谓交叉重叠是指，两个片段的VL和VH区分别位于不同的多肽链上。应用标准PCR技术可以分离两个抗体的V轻链(VL)区和V重链(VH)区。然后将其cDNA连接到细菌表达载体上，其中第一抗体VL区的C-末端通过接头连接到第二抗体VH区的N-末端。相对应的，第二抗体VL区的C-末端通过接头连接到第一抗体VH区的N-末端。使用一种强启动子对所得到的双顺反子操纵子进行转录调控，可以使用的强启动子如埃希氏大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子，该启动子可以使用磷酸盐饥饿法进行诱导。可选择的，使用lac启动子和一种由2％甘氨酸和1％TritonX-100组成的培养基，也能在E.coli中有效表达单链融合构建体。参见如Yang等，Appl.Environ.Microbiol.，642869-2874，1998。使用一种大肠杆菌热稳定性肠毒素II信号序列将所述肽介导到周质腔。在完成分泌后，将两种肽连接形成非共价异源二聚体，其具有两种抗原结合特异性。应用本领域已知的标准方法对bscAb进行纯化，如葡萄球菌蛋白A层析。还可以在转基因家畜的奶中生产功能性bscAb和融合蛋白。参见如Colman，A.，Biochem.Soc.Symp.，63141-147，1998；美国专利号5827690。使用所述方法获得bscAb片段，将其克隆到表达载体，该表达载体含有优选在乳房上皮细胞中表达的启动子序列。这样的例子包括，但不限于，兔、牛、和绵羊酪蛋白基因的启动子，牛α-乳球蛋白基因的启动子，绵羊β-乳球蛋白基因的启动子，和鼠乳酸蛋白基因的启动子。优选的，所插入的bscAb的3’端侧接有乳房特异性基因同源基因组序列。从而提供了聚腺苷酸化位点和转录稳定序列。将所述表达组件共同注射到受精原核，即哺乳动物的受精卵，然后将其植入雌性受体的子宫，使之发育。出生之后，用Southern分析方法筛选含有转导DNA的后代。使用本领域公知的标准免疫分析方法分析雌性转基因动物的奶，鉴定其是否含有预期的功能性bscAb。可以使用本领域已知的标准方法纯化奶中的bscAb。在奶中生产转基因产品bscAb是一种有效的方法，能够获得大量的bscAb。还可以在转基因植物中生产本发明功能性的bscAb和融合蛋白。参见如Fiedler等，Biotech.，131090-1093，1995；Fiedler等，Immunotechnology，3205-216，1997。所述形式的产品有几个优点，包括低成本、大规模生产和能够稳定、长期的储存。使用所述方法获得bscAb片段，将其克隆到表达载体，该载体包含启动子序列和编码能够将蛋白介导到内质网的信号肽的序列。有多种启动子可供使用，只要它能使信号肽将表达产物介导到植物的特定部位。例如，使用花椰菜花叶病毒强启动子35S，可以使蛋白在烟草植株的各个部位表达，使用种子特异性豆球蛋白B4启动子可以使蛋白在特定的组织中表达。根据本领域已知的标准方法转化表达组件。使用Southern分析方法鉴定转化子。使用本领域已知的标准免疫分析方法分析转基因植株中是否含有具有功能的bscAb。可以使用本领域已知的标准方法从植物组织中纯化bscAb。另外，转基因植物能够长期储存bscAb和融合蛋白。已经从室温条件下储存一周的烟草叶子中，提取出了功能活性的scFv蛋白。类似的，室温储存一年的转基因烟草种子同样没有丧失scFv蛋白或其抗原结合活性。还可以在昆虫细胞中生产本发明功能性bscAb和融合蛋白。参见如Mahiouz等。J.Jmmunol.Methods，212；149-160(1998)。基于昆虫的表达系统能够大量生产均质和折叠正确的bscAb。杆状病毒广泛用作昆虫细胞的表达载体，并且已经成功用其重组了抗体分子。参见如Miller，L.K，Ann.Rev.Microbiol.，42177(1998)；Bei等，J.Immunol.Methods，186245(1995)。可选择的，可以使用一种诱导表达体系，其中所生成的稳定昆虫细胞系中包含bscAb构建体，该构建体受诱导启动子的转录调控。参见如Mahiouz等，J.Immunol.Methods，212；149-160(1998)。根据所述方法获得bscAb片段，将其克隆到含有果蝇金属硫蛋白启动子和人类HLA-A2前导序列的表达载体中。然后将构建体转染到D.melanogasterSC-2细胞。通过提高细胞周围的铜、锌或镉的含量来诱导表达。使用本领域已知的标准免疫方法来检测是否含有具有功能的bscAb。同样使用本领域已知的标准技术纯化bscAb。本发明所优选的双特异性抗体是整合了MabMu-9的Fv与Mab679的Fv的抗体、和整合了MABMN-14的Fv与Mab679的Fv的抗体、以及它们的人类的、嵌合的或人源化的对应物。美国专利5874540公开了所述MN-14以及它的嵌合的和人源化的对应物。还优选整合一个或多个Mu-9或679的CDRs的抗体。抗体可以是一种整合了III-类抗-CEA抗体和679的Fv的融合蛋白或双特异性抗体。美国专利4818709详细记载了包括III-类抗-CEA抗体在内的III-类抗体。VII.其它用途本发明囊括了bsAb和与所述靶向构建体连接在一起的治疗或诊断剂在手术中、血管内和内窥镜肿瘤和损伤检测、活检和治疗方面的用途，所述内容在美国专利6096289中也有所记载。本发明的抗体和抗体片段不仅能够用于治疗或成像目的，而且能够在体外进行辅助研究。例如，可以在体外使用本发明的bsAbs来探知一种靶向构建体是否能够与一种或多种bsAbs形成稳定的复合物。这样的分析能够帮助本领域技术人员确定能够与bsAbs形成稳定复合物的靶向构建体。反过来讲，这也有助于本领域技术人员确定有可能用作治疗和/或成像剂的靶向构建体。所述分析通过如下方法进行，将未确知的靶向构建体与至少两摩尔当量的bsAb混合。温育后，使用体积排阻HPLC分析混合物，来检测靶向构建体是否与bsAb发生了结合。可选择的，也可以使用标准组合方法进行分析，其中将含有多种bsAbs的溶液点在标准96孔板上。在每个孔中加入靶向构建体溶液。温育后进行分析，可以很容易地确定那个构建体与所述bsAb(s)结合得最好。应当理解在所述分析中，bsAb和靶向构建体的加入顺序不是至关紧要的；即，可以将bsAb加入构建体中，反之亦然。同样的，bsAb和靶向构建体也不用必须是溶液形式；即，它们在加入时可以是溶液形式，也可以不是溶液形式，无论那种形式只要是最方便的形式即可。最后，用于分析是否结合的方法也是无关紧要的，只要该方法能够确定是否发生了结合。因此，人们可以使用如下的标准分析方法，包括但不限于FABMS、高-区域NMR或其它合适的方法，对是否结合进行分析，所述方法可以与排阻HPLC联合使用，也可以替代排阻HPLC方法使用。下面通过如下的实施例对本发明进行详细说明，本发明不受如下实施例任何形式的限制。实施例实施例1)合成Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys-)-NH2(IMP243)使用Karacay等BioconjugateChem.11842-854(2000)所描述的方法合成所述肽，与文献不同之处在于用D-酪氨酸代替了L-酪氨酸，用N-三苯甲基-HSG-OH代替了DTPA。在进行N-三苯甲基-HSG-OH的最终偶联时，所使用的N-三苯甲基-HSG-OH的量十倍于树脂上肽的量。使用一个当量的(相对于HSG)N-羟基苯并三唑、一个当量的苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲氨基)膦六氟磷酸盐(BOP)和两个当量的二异丙基乙胺对N-三苯甲基-HSG-OH(NMP中为0.28M)进行活化。将活化底物与树脂混合，室温下持续15小时。实施例2)包含IMP243的Tc-99m试剂盒制备一种配方缓冲液，其含有22.093g的羟基丙基-β-环糊精、0.45g的2，4-二羟基苯甲酸、0.257g的醋酸钠盐、和10.889g的α-D-葡庚糖酸钠盐，所述成分溶解在170mL脱氮水中。用几滴1M的氢氧化钠将溶液的pH值调到5.3，然后稀释到总量220mL。0.2mLSnCl2(200mg/mL)用3.8mL配方缓冲液进行稀释，制得含二价锡的缓冲溶液。将肽Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO4)(0.0026g)溶解于78mL的缓冲溶液中，并与0.52mL二价锡缓冲液混合。然后将肽溶液过滤，使用的是0.22μm的MillexGV滤器，取1.5mL等分滤液倒入3mL冻干瓶。然后立即将冻干瓶冷冻、冻干并在真空下卷曲密封。在试剂盒中加入1.5mL盐水中的高锝酸盐溶液(27mCi)。在室温下温育该试剂盒10分钟，并在沸水浴中加热25分钟。在使用前将试剂盒冷却到室温。实施例3)通过双特异性抗体肿瘤前靶向定位，将治疗/成像放射性同位素携带到肿瘤的肽合成了DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)(IMP237)，其通过双特异性抗体肿瘤前靶向定位，将治疗放射性同位素如90Y或177Lu递送到肿瘤。双特异性抗体由两部分组成，其中一部分与肿瘤上的抗原相结合，另一部分与HSG肽相结合。与HSG肽相结合的抗体是679。该系统也可用于递送成像同位素，如111In-111。IMP237的合成在Sieber酰胺树脂上(Nova-Biochem)，使用标准Fmoc固相肽合成技术将如下受保护的氨基酸装配成肽骨架，依次是Fmoc-Lys(Aloc)-OH，Fmoc-Tyr(But)-OH，Fmoc-Lys(Aloc)-OH，，Fmoc-Phe-OH(试剂购自AdvancedChemtech)，三-t-丁基DOTA(大环的)。然后使用Dangles等J.Org.Chem.524984-4993(1987)的方法，用Pd[P(ph)3]4将侧赖氨酸侧链进行去保护。然后加入三苯甲基HSG(其合成将在下面加以描述)形式的HSG配体，使用BOP/HBTU双偶联过程使之连接到氨基酸上。用TFA进行处理，从而从树脂上将肽切割下来，并脱去肽上的保护性基团。利用HPLC纯化肽，从1.823gFmoc-Lys(Aloc)-Tyr(But)-Lys(Aloc)-NH-Sieber酰胺树脂中纯化了0.6079g的肽。N-三苯甲基-HSG-OH的合成将甘氨酸-t-丁基盐酸酯(15.263g，9.1×10-2mol)和19.760gNa2CO3混合，然后悬浮在50mLH2O中，并冰浴冷却。然后在反应溶液中加入琥珀酸酐(9.142g，9.14×10-2mol)，并使其温度慢慢升至室温，并搅拌18小时。将柠檬酸(39.911g)溶解在50mLH2O中，将其缓缓加入到反应溶液中，然后用2×150mLEtOAc进行萃取。将有机萃取物用Na2SO4干燥、过滤并浓缩，得到25.709g白色固体。将粗产物(25.709g)溶解在125mL二氧杂环乙烷中，在室温水浴中冷却，然后与11.244gN-羟基琥珀酰亚胺混合。向反应溶液中加入15.0mL二异丙基碳二亚胺，并搅拌一个小时。将二盐酸组胺(18.402g，1.00×10-1mol)溶解在100mLDMF和35mL二异丙基乙胺中。将组胺混合物加入反应溶液中，在室温下搅拌21小时。用100mL水使反应淬灭，然后过滤除去沉淀。在高真空的旋转蒸发器中除去溶剂。粗提产物溶解在300mL二氯甲烷中，并用100mL饱和NaHCO3萃取。有机层用Na2SO4干燥、并浓缩，得到34.19g的黄色油状粗提产物。将粗提产物(34.19g)溶解在50mL氯仿中，并与31mL二异丙基乙胺混合。将氯化三苯甲基(25.415g)溶解在50mL氯仿中，并遂滴加入搅拌着的并在冰浴中冷却着的反应溶液中。搅拌反应45分钟，然后用100mL水使反应淬灭。分离有机溶液层，并经过Na2SO4干燥、和浓缩，得到绿色的胶状物。用100mLEt2O捣碎胶状物，形成黄色的沉淀，用3×50mL的Et2O洗涤沉淀物。将固相进行真空干燥，得到30.641g(总产量的59.5％)的N-三苯甲基-HSG-t-丁基酯。将N-三苯甲基-HSG-t-丁基酯(20.620g，3.64×10-2mol)溶解在由30mL氯仿和35mL冰醋酸组成的溶液中。在冰浴下进行反应，并将15mLBF3-Et2O缓缓加入反应溶液中。使反应液缓慢升至室温，并混合5小时。用200mL1M的NaOH灭反应，并用200mL氯仿萃取所得产物。经过Na2SO4使有机层干燥，并浓缩，得到粗提胶状物，其中该胶状物用100mLEt2O研制，形成沉淀。将粗提沉淀倒入400mL0.5MpH7.5的磷酸盐缓冲液中，并用2×200mLEtOAc进行萃取。用1MHCl将水层酸化至pH3.5，并用2×200mL氯仿萃取。形成沉淀，并经过过滤收集沉淀(8.58g)。通过与先前样品HPLC对照显示，所述沉淀即为所预期的产品(ESMSMH+511)。放射标记制备90Y试剂盒将DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)溶解在0.25MNH4OAc/10％HPCD缓冲液中，浓度分别为9、18、35、70和140μg/mL。将溶液在0.22μmMillexGV过滤器上进行无菌过滤，取1mL加到酸冲洗过的冻干瓶中。将冻干瓶迅速冷冻干燥。冻干后将瓶在真空下密封，并从冻干器拿出时要卷曲密闭。将90Y(～400μCi/试剂盒)稀释到1mL去离子水中，然后加入到冻干试剂盒中。将试剂盒在沸水浴中加热15分钟，然后将瓶冷却到室温，并使用反相HPLC评价被标记的肽(HPLC条件WatersNoca-PakC-18，8×100mmRCM柱，洗脱液流速为3mL/min，洗脱液的线性梯度为从100％(0.1％TFA水溶液)到100％(90％CH3CN，0.1％TFA，10％H2O))。HPLC分析结果显示在本试剂盒中，完全标记所需要的肽的最小浓度是35μg/mL。反相HPLC示踪结果显示出了明显的90Y标记肽的峰。排阻HPLC结果显示，当将所述被标记的肽与过量679IgG混合时，所述标记肽完全结合到了679IgG上。用111In标记将111In(～300μCi/试剂盒)稀释到0.5mL去离子水中，然后加入到冻干试剂盒中。将试剂盒在沸水浴中加热15分钟，然后将瓶冷却，然后加入0.5mL2.56×10-5M的溶解在0.5M醋酸盐缓冲液中的In，然后将试剂盒再次在沸水浴中加热15分钟。将进行肽标记的瓶冷却到室温，并使用反相HPLC进行评价(HPLC条件WatersNoca-PakC-18，8×100mmRCM柱，洗脱液流速为3mL/min，洗脱液的线性梯度为从100％(0.1％TFA水溶液)到100％(90％CH3CN，0.1％TFA，10％H2O))。HPLC分析结果显示在进行标记时需要的肽的最小浓度(4.7％的游离111In)，在本试剂盒中，是35μg/mL。反相HPLC示踪结果显示出了明显的111In标记肽的峰。排阻HPLC结果显示，当将所述被标记的肽与过量679IgG混合时，所述标记肽完全结合到了679IgG上。体内研究给带有GW-39人类结肠异种移植肿瘤的裸鼠注射双特异性抗体hMN-14×m679(1.5×10-10mol)。在注射111In标记的肽(8.8μCi，1.5×10-11mol)之前，使抗体在体内经过24小时的清除。在分别注射3、24、48小时后，杀死动物。用hMN-14×m679进行了前靶向定位后，肽在小鼠体内的生理分布结果显示在表1中。表2显示了在前靶向定位研究中，肽在肿瘤中与非肿瘤中的比率。表1在注射hMN-14×m679后24小时，使用111In标记的肽进行的前靶向定位结果％注射量/g组织表2在注射hMN-14×m679后24小时，使用111In标记的肽进行前靶向定位肿瘤/非肿瘤组织的比率DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO2)(IMP237)和DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2(SEQIDNO3)(IMP241)的血清稳定性肽标记和HPLC分析根据Karacay等，BioconjugateChem.11842-854(2000)记载的方法标记肽IMP237和IMP241。将IMP241肽(0.0019g)溶解在587μl0.5MpH5.5的NH4Cl溶液中。取1.7μl肽溶液稀释到165μl0.5MpH5.5的NH4Cl溶液中。将10μl的111In(1.8mCi)加入到肽溶液中，并将混合液在沸水浴中加热30分钟。用HPLC法分析标记的肽，所使用的柱子是Waters8×100mmradial-pak，nova-pakC-18RCM筒状柱。柱子的洗脱条件如下，流速3mL/min，线性梯度从100％的0.1％TFA水溶液到100％的0.1％TFA溶解在90％乙氰和10％水中形成的溶液，洗脱时间为10分钟。在柱子的无效空间中大约有6％的游离111In(1.6分钟)。在5分钟和6.6-8分钟之间还有一些111In标记的峰。111In标记的肽洗脱时间为8.8分钟，是一个独立的峰。111InIMP237的HPLC轮廓与111InIMP241的轮廓非常接近。血清稳定性将30μl的111InImp241置于300μl新鲜的小鼠血清中，并置于37℃温育箱中。通过所述HPLC法对肽进行监测。将24μl的111InImp237置于230μl新鲜的小鼠血清中，并置于37℃温育箱中。通过所述HPLC法对肽进行监测。分析结果显示，与小鼠血清37℃温育22小时后，检测到111InIMP241已经发生了缓慢的分解，分解率大约为5％。在37℃温育22小时后，检测到大约有70％的111InIMP237转化为保留时间较短的成分。结论在与IMP237对比之下，IMP241肽中的D型酪氨酸使IMP241肽在小鼠血清中的分解速度变缓。IMP237和IMP241在体内的稳定性比较通过检测(HPLC法)30分钟和60分钟时小鼠的尿样品，来进行111InIMP237和111InIMP241体内稳定性比较。其中的IMP237肽和IMP241肽使用所述方法进行111In-111标记。将标记的肽注射到Balb/c小鼠中，分别在注射肽30分钟和60分钟后杀死动物，每一个时间点使用一只小鼠。随后的HPLC示踪结果表明，在排泄物中存在完整的111InImp241，而111InImp237几乎全部代谢为一种新的111In标记的肽。结论用D-Tyr取代肽骨架中的Tyr能使肽在体内的代谢速率降至最低。其它的体内研究给带有GW-39人类结肠异种移植肿瘤的裸鼠注射双特异性抗体mMU-9×m679(1.5×10-10mol)。在注射111In标记的肽(8.8μCi，1.5×10-11mol)之前，使抗体在体内经过24小时的清除。在分别注射3、24、48小时后，杀死动物。用mMU-14×m679进行了前靶向定位后，肽在小鼠体内的生理分布结果显示在表3中。表4显示了在前靶向定位研究中，肽在肿瘤中与非肿瘤中的比率。表5显示在没有使用双特异性抗体前靶向定位的情况下，肽在小鼠中的生理分布。表3在注射mMU-9×m679后48小时，使用111In标记的肽进行的前靶向定位结果％注射量/g组织表4在注射mMU-9×m679后48小时，使用111In标记的肽进行前靶向定位肿瘤/非肿瘤组织的比率表5单独的111In标记肽在体内的生理分布实施例4)合成肽抗原应用树脂固相合成技术装配肽Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)，将第一位的残基(赖氨酸)以受保护的衍生物α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH的形式连接到树脂上。选择性去掉α-Fmoc保护基团，然后在后面的循环中依次偶联上Fmoc-Tyr(OBut)、α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH、和Fmoc-Phe-OH，并进行α-氨基脱保护。与TFA反应可以去掉Aloc-和OBut-侧链保护基团，与乙酸酐反应可以为游离α-和ε-氨基基团带上Ac，从而形成Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)。实施例5)将Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)偶联到KLH将Ac-Phe-Lys(Ac)-Tyr-Lys(Ac)-OH(SEQIDNO2)肽溶解在水中，用1N的HCl将pH值调至4.0，然后用1摩尔当量的1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺进行处理，在4℃反应1小时。PH为8.5的匙孔血蓝蛋白(KLH)与过量的100倍摩尔浓度的活化肽进行缀合反应，在4℃反应1小时。使用排阻层析从未反应肽中纯化肽-KLH缀合物，用于生产抗体。实施例6)生成抗-肽Ab将肽抗原和完全弗氏佐剂混合物注射到免疫活性小鼠中。在随后的几周中，给小鼠施用两次与不完全弗氏佐剂混合的肽进行加强。从免疫动物中收集脾细胞，并使之与Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞融合。所得克隆的培养物上清液用于ELISA法进行抗-肽反应分析，反应板预先涂布肽免疫原。分离酶缺陷型杂交瘤，用于选择融合细胞系，选择在培养基上生长的克隆，使之产生抗肽Ab。实施例7)抗肽Ab的纯化使用层析技术纯化抗-肽Ab，首先使用蛋白A柱分离IgG组分，然后使用离子交换柱去掉产物中的杂质。最后使用亲和柱纯化所需的Ab，其中亲和柱的固相载体上结合了抗原肽，它是通过将所述肽化学偶联到活性珠或活性树脂上形成的。实施例8)将抗-肽Ab消化为F(ab’)2将抗-肽Ab与200μg/μlpH为4的的胃蛋白酶一起温育1小时，然后使用串联的蛋白A柱进行纯化，以去除未被消化的IgG，然后使用G-50-Sephadex柱进行纯化，以去除低分子量杂质。实施例9)将抗肽Ab还原为Fab’-SH将抗肽F(ab’)2与新制备的半胱氨酸溶液一起反应，使之还原为Fab’片段，其中半胱氨酸溶解在包含10mMEDTA的0.1MPBS缓冲液中。使用HPLC监控反应过程，在反应完成后(大约1小时的时间)，使用旋转-柱层析纯化Fab’-SH，并贮存在pH小于5的含有10mMEDTA的脱氧缓冲液中。实施例10)将抗-CEA-IgG氧化偶联到顺丁烯二酰亚胺将抗-CEAAbIgG与10mM过氧化钠在4℃黑暗中反应90分钟，使之氧化。使用旋转柱层析纯化氧化的Ab，并将其与过量的交联接头4-(4-顺丁烯二酰亚胺苯基)丁酸肼(MPBH)混合。使反应进行2小时，然后使用旋转柱层析纯化IgG-腙-顺丁烯二酰亚胺。与10mM氰氢硼化钠进行反应，还原腙键，然后再次进行纯化。实施例11)制备抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’双特异性Ab用等摩尔当量实施例6中制备的抗-肽Fab’-SH处理实施例10中制备的IgG-肼-顺丁烯二酰亚胺，pH值为6.0，室温下反应30分钟。与碘乙酰胺反应30分钟，来阻遏剩余的游离的硫醇基团。使用排阻层析纯化双特异性Ab抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’，去除未反应的Fab’，然后进行亲和层析用固相结合肽从未反应的IgG中分离IgG×Fab’。实施例12)Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2(SEQIDNO2)的合成应用树脂固相合成技术装配肽Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2(SEQIDNO2)，将第一位的残基(赖氨酸)以受保护的衍生物α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH的形式连接到树脂上。选择性去掉α-Fmoc保护基团，然后在后面的循环中依次偶联上Fmoc-Tyr(OBut)、α-Fmoc-Lys(Aloc)-OH、和Fmoc-Phe-OH，并进行α-氨基脱保护。与钯(O)催化剂反应除去Aloc侧链。可选择地，也可以使用Boc-基团作为保护基团，与TFA反应可以去掉Boc-保护基团，并使游离氨基与过量的ITC-Bz-DTPA反应。在去除过量Bz-DTPA后，与乙酸酐反应可以为游离α-氨基基团带上Ac，用TFA将完整的肽从树脂上切割下来(期间伴随着酪氨酰残基的脱保护)，从而形成Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2。实施例13)用Y-90放射性标记Ac-Phe-Lys(Bz-DTPA)-Tyr-Lys(Bz-DTPA)-NH2(SEQIDNO2)将标题肽以100倍摩尔过量与钇-90放射性核素混合在pH5.5的醋酸盐缓冲液中。在30分钟后定量放射性标记。实施例14)羧酸酯酶与di-DTPA-肽的连接将羧酸酯酶(5mg)溶解在pH8.0的0.2M的磷酸盐缓冲液中，然后用5倍摩尔过量的交联试剂硫代-琥珀酰亚胺基-[4-顺丁烯二酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)进行处理。室温搅拌两个小时后，使用G-25Sephadex旋转柱从低分子量成分中分离活化的酶，并在含有1mMEDTApH为7的0.1M磷酸盐缓冲液中平衡。将四肽N-乙酰基-Cys-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO11)(10倍摩尔过量)加入到活化的酶中，并溶解在与所述旋转柱所使用的相同的缓冲液中。室温搅拌1小时后，使用G-25Sephadex离心柱层析从未反应的肽中纯化Cys-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO11)肽羧酸酯酶缀合物，其中使用了pH6.0的0.25M醋酸盐缓冲液。用铟-111对缀合物进行标记，结果证明所述过程成功地实现了缀合，然后使用排阻HPLC对缀合物进行分析。实施例15)抗-CEA-IgG×抗肽-Fab’双特异性抗体用于RAIT给予CEA表达肿瘤患者抗-CEA-IgG×抗肽-Fab’双特异性Ab。7天后，给予患者Y-90-di-Bz-DTPA-肽(来自实施例13)。Y-90标记的肽快速从非靶组织清除，而定位于用抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’双特异性Ab前靶向的位点，导致肿瘤的破坏。实施例16)制备半乳糖-WI2-Fab’清除试剂使用实施例8中的方法，用胃蛋白酶将抗MN-14独特型Ab消化为F(ab’)2片段，其中抗MN-14独特型Ab又被称作WI2。使用实施例9中的方法，用低分子量硫醇基团将F(ab’)2还原为Fab’片段。在还原完成以后，用离心柱层析纯化Fab’-SH，并使之与过量碘乙酰胺反应来阻遏铰链区硫醇，避免其再次连接。从过量碘乙酰胺再次纯化Fab’，并使之与400倍摩尔过量的半乳糖苷化试剂，即氰甲基-2，3，4，6-四-O-乙酰基-1-巯基-β-D-吡喃半乳糖苷的巯基-imidate，进行反应(参见Karacay等)。使用两个旋转柱纯化半乳糖苷化蛋白，并使用MALDI-MS检测半乳糖和Fab’的比率。实施例17)使用抗-CEA-IgG×抗-肽Fab’双特异性Ab进行RAIT，其中进行了bsAb清除步骤。给CEA表达肿瘤患者施用抗-CEA-IgG(MN-14)×抗-肽Fab’双特异性Ab。三天以后，给患者施用清除剂量的半乳糖-WI2-Fab’。在施用清除剂量的半乳糖-WI2-Fab’24小时后，给患者施用Y-90-di-Bz-DTPA-肽。Y-90标记的肽在非靶组织中快速地被清除，但却很好地定位于使用了抗-CEA-IgG×抗-肽-Fab’双特异性Ab前靶向定位的位点上，从而有效地消灭肿瘤。实施例18)Ac-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO7)(IMP192)的合成将第一个氨基酸Aloc-Lys(Fmoc)-OH连接到肽合成器上的0.21mmol的Rink酰胺树脂上，然后使用标准的Fmoc自动合成方案，将与残基Fmoc-Cys(Trt)-OH和TscG结合的Tc-99m配体加入到赖氨酸侧链上，从而形成如下的肽Aloc-Lys(TscG-Cys(Trt)-rink树脂。然后使用8mLPd[P(Ph)3]4溶液进行处理，去除Aloc基团，其中所述Pd[P(Ph)3]4溶液的配比如下，将100mgPd[P(Ph)3]4溶解在由10mLCH2Cl2、0.75mL冰醋酸和2.5mL二异丙基乙胺组成的混合溶剂中。然后用0.8ml三丁基氢化物处理树脂混合物，旋转混合60分钟。然后继续在合成仪上进行肽合成，形成如下的肽Lys(Aloc)-Tyr-Lys(Aloc)-Lys(Tscg-Cys)-rink树脂(SEQIDNO7)。将8mL含有10mLDMF、3mL乙酸酐和6mL二异丙基乙胺的溶液加入到树脂中，并旋转混合，使N-末端进行乙酰化。使用前面所述的方法去除侧链Aloc保护基团，然后使用哌啶处理树脂，使用标准的Fmoc去保护方案去除所有的可能存在于树脂上的醋酸。活化DTPA和DTPA的添加将5gDTPA溶解在40mL1.0M的四丁基铵氢氧化物甲醇溶液中。在高真空下去除甲醇，得到一种粘性油。将油溶解在50mLDMF中，并在旋转蒸发器高真空下去除挥发性溶剂。用DMF处理两次以上。然后将粘性油溶解在50mLDMF中，并与5gHBTU混合。然后将8mL活化的DTPA溶液加入树脂中，旋转混合14小时。用DTPA重复处理，直至用Kaiser检测法检测时，树脂呈现胺检测阳性。可选择的，可以联合使用DTPA四-t-丁基酯和常用的偶联试剂，如DIC和HBTU。(参见AranoY，UezonoT，AkizawaH，OnoM，WakisakaK，NakayamM，SakaharaH，KonishiJ，YokoyamaA.，“Reassessmentofdiethylenetreaminepentaaceticacid(DTPA)asachelatingagentforindium-111labelingofpolypeptidesusinganewlysynthesizedmonoreactiveDTPAderivative.”，JMedChem.1996Aug30；39(18)3451-60)。切割和纯化然后使用8mL由30mLTFA、1mL三异丙基硅烷、和1mL乙二硫酚组成的溶液处理树脂60秒，从而将肽从树脂上切割下来。将粗切割产物倾倒到30mL醚中，并通过离心收集沉淀。然后使用反相HPLC用4×30cmWaterspreparativeC-18Delta-Pak柱子(15μm，100埃)纯化肽。收集HPLC组分，将其冻干获得包含所需产物的组分，其中产物鉴定使用ESMS(MH±1590)法。试剂盒配制将肽装配到冻干试剂盒中，该试剂盒包含78μg肽、0.92mg非放射性InCl3、100μg二价氯化锡、3mg龙胆酸和HPCD(再生10％)。实施例19)Tc-99m标记及其稳定性将1.5mL含有25mCiNa99mTcO4的盐水加入到IMP192试剂盒中，来标记IMP192。将试剂盒室温温育10mm，然后在沸水浴中加热15mm。然后将标记肽溶液冷却到室温。取其中一部分用于稳定性研究。取其中一部分以1∶10的比例稀释到盐水、1mM半胱氨酸0.05MpH7.5的磷酸盐溶液、和新鲜的人血清中。将最初的试剂盒溶液、盐水稀释液和半胱氨酸对比溶液在室温下温育，将血浆样品在37℃下温育。使用HPLC和ITLC对样品进行监测。结果表明标记肽在体外试验中是稳定的。在血浆样品中的标记肽保留时间从6.3mm变为7.3min。保留时间的变化可能是因为血浆中的一些成分与肽发生了离子成对现象。表6实施例20)制备hMN-14×734(Fab×Fab)使hMN-14Fab’SH(一种人源化的单克隆抗-CEA抗体)和734Fab’mal(一种鼠抗-diDTPA)片段进行交联，从而制备所述bsAb，所使用的方法类似于实施例8的方法。使用10mM2-巯基乙胺在存在10mMpH7.3EDTA的条件下还原F(ab’)2片段，从而形成hMN-14和734的Fab’SH片段，反应时间为60分钟，反应温度为37℃。经过旋转柱(Penefsky)纯化(SephadexG-50-80，50mMNaOAc，0.5mMEDTA，pH5.3)收集Fab’SH片段。使用4mMN，N’-o-亚苯基双马来酰亚胺将734Fab’SH片段导入顺丁烯二酰亚胺，其中在RT下反应60分钟。使用旋转柱纯化技术分离Fab’mal。734Fab’mal和hMN-14Fab’SH的交联反应在4℃进行16小时，两者的摩尔比例是1∶1。为了打开在所述过程中可能形成的二硫键，将所述反应混合物用10mM2-巯基乙胺处理1小时，pH为5.3，温度为23℃。使用pH6.4的乙基顺丁烯二酰亚胺将SH基团阻遏。使用旋转柱去除反应混合物中的过量小分子量化合物。然后使用分析排阻HPLC柱Bio-SilSEC-250分离纯化bsAb。纯化的bsAb的HPLC保留时间为10.23分钟。实施例21)HPLC结合研究使用氯胺T(Greenwood和Hunter)进行bsAb的放射碘标记。将标记了放射碘的bsAbs结合到CEA、WI2(大鼠抗-MN-14独特型抗体)和放射性标记的肽基DTPA螯合物上，然后用分析排阻HPLC对所述结合物进行检测。结果表明，在用10-20倍摩尔过量的CEA处理时，有大约90％的放射碘标记的bsAb结合到了CEA上。bsAb与放射性铟标记的DTPA螯合物(IMP-156或IMP-192)形成了复合物。IMP156Ac-Phe-Lys(DTPA)-TYR-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO2)实施例22)血清稳定性在温度为37℃，潮湿、并含有5％二氧化碳的条件下，对放射性碘标记的bsAb在新鲜人血清中的稳定性进行检测。取一部分在SE-HPLC上检测。为了检测与血清蛋白结合的放射性碘，取一部分与WI2混合，结果使bsAb峰的保留时间减少。在血清中温育48小时后，bsAbs对WI2的结合能力损失了3-5％。在血清中温育72小时后，bsAbs在血清中形成了少量的聚合物(4-7％)。实施例23)99m-Tc-IMP-192肽基螯合物Tc-99m复合物在体外的稳定性试验通过如下方法进行，将Tc-99m复合物分别在盐水、新鲜人血清和10mM半胱氨酸溶液中温育达20小时。从在前靶向定位研究中注射了99m-Tc-IMP-192的小鼠中，收集尿液，用于分析所述复合物在体内的稳定性。在尿液中检测到放射活性表明尿液中存在完整的肽，因为SE-HPLC结果显示放射活性是与抗体结合的。99m-Tc-IMP-192在正常BALB/c小鼠中的生理分布研究表明其在血液中被快速清除，记载在表7中。体内和体外研究结果均表明99mTTc-IMP-192具有稳定性。表799m-Tc-IMP-192在BALB/c小鼠中的清除组织％ID/g1小时2小时4小时24小时肝脏0.27±0.180.22±0.160.09±0.020.04±0.0脾0.08±0.010.09±0.30.05±0.020.03±0.01肾4.16±0.754.05±0.603.21±0.991.21±0.08肺0.50±0.230.29±0.080.19±0.040.05±0.00血液0.30±0.090.21±0.030.14±0.040.05±0.01胃0.39±0.180.42±0.180.27±0.330.02±0.01小肠1.37±0.750.60±0.060.21±0.090.03±0.01大肠0.41±0.541.53±0.451.58±0.700.15±0.14肌肉0.10±0.060.05±0.000.03±0.010.00±0.0尿169±9557±156.30±4.530.20±0.02实施例24)构建和表达hMN-14Fab-734scFv使用重组的方法来生产单价双特异性融合蛋白，其中融合蛋白包含来自人源化单克隆抗-CEA抗体的Fab片段和来自小鼠抗-diDTPA的scFv片段。参见附图3。单链734(734scFv)的结构设计为GGGS(SEQIDNO10)-VL-(GGGGS)3(SEQIDNO9)-VH，其中近端的GGGS(SEQIDNO10)提供了一个弹性键，可以将scFv连接到hMn-14重链的恒定区上(附图1)。可选择的，scFv也可以连接到hMN-14轻链的恒定区上。使用特异性引物组通过PCR反应，将适合框架内连接hMN-14重链Fd和734scFv的接头序列导入734的VL和VH区。PCR扩增734VL所使用的引物组是734VLscFv5′(Cys)和734VLscFv3′(所述引物的多肽和多核苷酸序列记载在美国专利申请系列号09337756中，申请日为1999年6月22日，所述专利全文引入本申请)。引物734VLscFv5′(Cys)是编码人类IgG1铰链区前四个残基(PKSC)(SEQIDNO12)的有义链序列，其中所述四个氨基酸残基通过一个短的弹性接头GGGS(SEQIDNO10)，与734VL的前六个氨基酸残基(QLVVTQ)(SEQIDNO13)框架内连接。人类铰链区必须包括一个半胱氨酸，因为半胱氨酸对于hMN-14重链Fd-734scFv融合和hMN-14轻链之间形成链间二硫键是必需的。在CH1区和铰链区结合处的内含子序列中插入Pst1位点，以便于后续过程中的连接。引物734VLscFv3′是编码734VL区末端六个氨基酸残基(TKLKIL)(SEQIDNO14)和部分弹性接头序列(GGGGSGGGG)(SEQIDNO15)的反义序列，其框架内融合在VL区的下游。PCR扩增后，首先用T4DNA聚合酶处理扩增产物(～400bp)，除去末端额外“A”残基，“A”残基是在PCR扩增中添加到末端的，然后使用Pst1进行消化。所得到的产物是一种双链DNA片段，其具有Pst1突出端和钝端。734VHPCR扩增所使用的引物组是734VHscFv5′和734VHcFv3′(Sac1)。引物734VHscFv5′(参见专利系列号09337756)是编码连接VL和VH序列的弹性接头(SGGGGS)(SEQIDNO16)的剩余部分和734VH区的前六个氨基酸残基(EVKLQE)(SEQIDNO17)的正义链序列。引物734VHscFv3′(Sac1)(参见专利系列号09337756)是编码734VH区末端六个氨基酸残基(TVTVSS)(SEQIDNO18)的反义序列。另外还包括一个翻译终止密码子。在终止密码子的下游插入限制性内切酶位点Eag1和Sac1，以便于进行亚克隆。类似的，首先用T4DNA聚合酶处理PCR扩增VH产物(～400bp)，以除去PCR产物末端额外的“A”残基，然后用Sac1进行消化，得到具有钝端一粘性末端的VHDNA片段。构建含有人类IgG1基因组序列SacII酶切片段的pBlueScript(Stratagene，LaJolla)阶段性载体(HClkbpSK)。该基因组SacII酶切片段包含一部分5’内含子、人类IgG1CH1区、将CH1区与铰链区连接的内含子序列、铰链序列、将铰链区连接到CH2区的内含子序列、和部分CH2区。通过Pst1/Sac1消化，去掉HClkbpSK中包含铰链区和部分CH2区的片段，然后将所产生的克隆位点用于与所述过程中所制备的VL(Pst1/钝端)和VH(钝端/Sac1)PCR扩增产物的共连接。通过内含子将所得构建体(CH1-734pSK)中的CH1区与734scFv基因序列相连接(附图4)。因为IgG1的基因组SacII片段仅包括位于CH1区旁侧的5’内含子序列的一部分，因此需要将剩余的内含子序列(其作为BamH1/SacII酶切片段)插入到CH1-734pSK的相应部位，从而重建完整的内含子序列。然后分离BamH1/Eag1酶切片段，其包含完整5’内含子、CH1区、用于连接的内含子、5个铰链残基、短的GGGS接头(SEQIDNO10)、和734scFv序列，并将其用于取代hMN-14pdHL2载体内的包含人类基因组IgG1恒定序列的HindIII/Eag1酶切片段。使用一端带有BamH1突出端，另一端带有HindIII突出端的HNB接头，来将BamH1/Eag1酶切片段更容易的连接到hMN-14pdHL2载体的HindIII/Eag1位点。所得到的载体命名为hMN-14-734pdHL2，可用其转染哺乳动物细胞，来表达双特异性蛋白。所使用的hMN-14pdHL2载体来自载体pdHL2，该载体在以前的文献中有所记载。参见Losman等，CancerSupplement，802660，1997。hMN-14pdHL2载体是使用如下方法构建的，使用标准分子生物技术用hMN-14的VH和Vκ区取代hLL2pdHL2的VH和Vκ区(附图5)。通过电穿孔技术将hMN-14-734pdHL2载体转染到SP2/0细胞，经过鉴定，所述细胞克隆分泌了bsAb。利用蛋白L柱(Pierce，Rockford，IL)从细胞培养上清液中纯化得到的bsAb是75kD的蛋白(根据氨基酸序列进行估计)，在非还原SDS-PAGE电泳中，它与66kD的标记物迁移率相同，这可能是由于它的二级结构导致的(附图2，泳道2)。在还原条件下，观察到对应于重链(50kD)和轻链(25kD)的条带(附图2，泳道4)。转染瘤分泌的κ链单体(25kD)和二聚体(50kD)也得到了共纯化(附图2，泳道2)，因为蛋白L与人、小鼠和大鼠的κ轻链相结合。使用离子交换层析进一步从κ单体和二聚体中分离bsAb。纯化的hMN-14Fab-734scFv表现出了剂量依赖方式特异性结合CEA和In-DTPA-BSA的特性。实施例25)在奶中转基因生产bscAb将bscAb片段克隆到表达载体，该载体包含5’酪蛋白启动组序列和位于插入位点旁侧面3’不翻译基因组序列。然后使用现有技术中的标准过程，将表达组件注射到小鼠受精卵细胞原核中。然后将卵细胞植入雌性受体的子宫中，使之孕育。在出生后，通过Southern分析筛选存在转导DNA的后代。然后使用现有技术中已知的标准免疫方法，来分析转基因雌性鼠的奶中是否存在bscAb，并分析所存在的bscAb是否具有功能。可以利用抗体对免疫抗原的互补结合特性，或利用柱层析、或其它的现有技术中已知的方法，从奶中纯化bscAb。实施例26)在植物中转基因生产bscAb将bscAb片段克隆到表达载体，该载体包含截短的豆球蛋白B4启动子，加上Vicisfaba的LeB4不翻译RNA前导序列的54个碱基对和编码LeB4信号肽、将蛋白介导到内质网上的序列。根据Zambryski等描述的方法，使用农杆菌介导的基因转染技术将表达组件转化到烟草叶片中。通过Southern分析鉴定转化子。使用现有技术中已知的标准免疫方法分析转基因植物中是否存在bscAb，并分析所存在的bscAb是否具有功能。可以使用现有技术中已知的标准方法从植物组织中纯化bscAb。实施例27)前靶向定位试验使用带有GW39异种移植肿瘤的雌性裸鼠(TaconicNCRNU，3-4周龄)用于前靶向定位试验。肿瘤重量为0.3-0.8g。表8125-I-hMN-14×734bsAb和111-In-铟-IMP-156肽在GW-39异种移植肿瘤裸鼠中的生理分布在注射111-In-铟-IMP-156前，给hMN-14×734留出48小时进行定位的时间。在注射111-In-铟-IMP-1563小时后进行生理分布检测。bsAb与肽的施用比例为1∶0.03。对于每个时间点取5只动物进行检测。125-I-hMN-14×734111-In-铟-IMP-156组织％ID/gT/NT％ID/gT/NT肿瘤2.9±1.115.2±1.91肝脏0.1±0.0619±60.5±0.0910.6±3.5脾0.5±0.036.3±1.20.5±0.112±6肾0.3±0.089.3±1.81.9±0.52.6±0.5肺0.3±0.112±30.4±0.112±2血液0.3±0.111±20.7±0.27.6±1.5表9在注射后3个小时，对照组对111-In-铟-IMP-156的清除。％ID/gT/NT肿瘤0.14±0.021肝脏0.42±0.10.3±0.1脾0.28±0.090.5±0.1肾0.93±0.130.2±0.03肺0.04±0.013.5±0.7血液0.05±0.013.1±0.7表10给GW39异种移植肿瘤裸鼠施用125-I-标记的bsAb(5μCi，15μg，1.5×10-10mol)。在注射99m-Tc-IMP-192(10μCi，1.6×10-11mol的肽)之前，为hMN-14×734留出24小时的定位和清除时间。分别在注射99m-Tc-IMP-192后30分钟、1小时、3小时、和24小时进行生理分布研究，每个时间点取5只动物。BsAb与肽的比例是1∶0.1。125-I-hMN-14×734％ID/g组织30分钟1小时3小时24小时肿瘤4.9±1.16.0±2.35.5±1.13.3±0.7肝脏0.6±0.10.5±0.20.5±0.10.1±0.02脾0.8±0.30.7±0.30.7±0.20.2±0.03肾0.5±0.10.5±0.10.5±0.10.1±0.02肺0.9±0.30.8±0.20.8±0.30.3±0.1血液0.9±0.31.2±0.41.1±0.30.2±0.0799m-Tc-IMP-192％ID/g组织30分钟1小时3小时24小时肿瘤11.4±4.814.3±3.612.6±5.28.7±3.3肝脏1.4±0.30.9±0.20.6±0.10.4±0.08脾1.2±0.40.8±0.20.5±0.10.4±0.2肾9.9±6.14.6±0.72.4±0.51.2±0.3肺4.2±3.43.6±1.91.0±0.30.3±0.1血液4.3±1.23.5±0.91.7±0.40.6±0.2表11给GW39异种移植肿瘤裸鼠施用125-I-标记的bsAb(5μCi，15μg，1.5×10-10mol)。在注射99m-Tc-IMP-192(10μCi，1.6×10-11mol的肽)之前，为hMN-14×734留出24小时的定位和清除时间。分别在注射99m-Tc-IMP-192后30分钟、1小时、3小时、和24小时时进行生理分布研究，每个时间点取5只动物。BsAb与肽的比例是1∶0.1。125-I-hMN-14×肿瘤/非肿瘤的比率组织30分钟1小时3小时24小时肝脏8.8±1.512.1±5.510.3±2.523.8±3.5脾6.4±1.69.3±4.07.9±1.718.2±4.0肾10.0±2.612.5±4.511.1±3.027.3±4.6肺6.2±2.38.4±4.67.2±2.312.4±6.6血液5.7±2.14.9±1.25.1±1.314.5±3.699m-Tc-IMP-192肿瘤/非肿瘤的比率组织30分钟1小时3小时24小时肝脏7.9±1.715.7±5.420.7±7.622.3±7.4脾9.4±1.019.5±8.622.9±7.523.8±3.5肾1.2±0.23.1±0.65.2±1.57.3±1.9肺3.7±1.75.5±3.613.3±7.130.8±14.4血液2.7±0.74.2±1.37.3±2.316.1±6.4表12GW-39肿瘤裸鼠的对照组施用99m-Tc-IMP-192(10μCi，1.6×10-11mol的肽)，3小时后处死99m-Tc-IMP-192组织％ID/g肿瘤0.2±0.05肝脏0.3±0.07脾0.1±0.05肾2.6±0.9肺0.2±0.07血液0.2±0.09在假定一分子肽与一分子bsAb结合的情况下，从所述数据中计算出了99m-Tc-IMP-192占据肿瘤上的DTPA结合位点的百分率，其中的肿瘤已经结合了bsAb。然而，一分子的肽也有可能与两分子的bsAb交联。表1399m-Tc-IMP-192占据肿瘤上的DTPA结合位点的百分率，其中肿瘤已经结合了bsAb。时间hMN-14×73430分钟25.41小时25.83小时2524小时28所述试验结果表明人源化×鼠bsAb保留了与CEA和铟-DTPA结合的能力；hMN-14×734(Fab×Fab)能够有效靶向肿瘤组织；双重功能的肽基Tc-99m螯合剂是稳定的；99m-Tc-IMP-192复合到肿瘤定位的hMN-14×734上，并至少维持24小时；在注射99m-Tc-IMP-192后的较早时间点(在注射后1-3小时)可以进行肿瘤成像。实施例28)使用抗-CEAFab×抗-肽scFv融合蛋白进行RAIT，其中加入了bsAb清除步骤一位69岁的患有结肠癌的男性患者，在进行完切除手术后一年，发现CEA在血浆中的浓度为50ng/mL。给患者进行了CT扫描，发现在其肝脏的左半部有5个肿瘤，大小在1cm-3cm之间。给患者施用100mg的hMN-14-Fab/734-scFv融合蛋白。三天后，给患者施用清除剂量的半乳糖-WI2-Fab′。在施用清除剂量的半乳糖-WI2-Fab′24小时后，血液中融合蛋白的浓度比注射清除试剂前降低了20倍。然后给患者注射IMP245Y-90-di-Bz-DTPA-肽，其中包含50mCi的Y-90。三个月后进行CT扫描，结果表明5个肿瘤中消失了3个，剩余的两个肿瘤体积没有增大。同时，CEA在血浆中的浓度降低为10ng/mL。在随后的6个月中，CEA在血浆中的水平没有增加，并且CT扫描结果表明所剩下的两个肿瘤没有增长。在第一次治疗后1年，在观测到患者CEA水平有所增高时，再次对患者进行了所述过程的治疗，在第二次治疗后3个月和6个月时，观测到两个肿瘤的体积发生了缩小。在6个月后，CEA在血浆中的水平不超过5ng/mL。实施例29)羧酸酯酶-DTPA缀合物的制备将两瓶兔肝脏羧酸酯酶(SIGMA；蛋白含量～17mg)溶解在2.2mL的0.1MpH7.7的磷酸钠缓冲液中，并与25倍摩尔过量的CA-DTPA混合，其中CA-DTPA是新制备的DMSO中的储存溶液(～25mg/mL)。在缀合反应混合物中，DMSO的最终浓度为3％(v/v)。温育1小时后，使用两个5mL的旋转柱(SephadexG50/80，流动相为pH7.30.1M的磷酸钠缓冲液)对混合物进行预纯化，除去过量的试剂和DMSO。使用TSK3000GSupelco柱对所述洗脱液进行进一步的纯化，流动相为0.2MpH6.8的磷酸钠缓冲液，流速为4ml/分钟。使用Centricon-10TM浓缩器将包含缀合物的组分浓缩，期间将缓冲液变为0.1MpH6.5的醋酸钠缓冲液。回收率0.9ml，4.11mg/ml(3.7mg)。联合使用分析型HPLC和线内UV检测对所述产物进行分析，结果表明有一个保留时间为9.3分钟的主峰和一个保留时间为10.8分钟的小峰，两者的比率为95∶5。酶分析结果表明115酶单位/mg蛋白，相当于没有经过修饰的羧酸酯酶。对没有经过修饰的羧酸酯酶和DTPA-修饰的羧酸酯酶进行质谱分析(MALDI模式)，结果表明DTPA的平均取代率接近1.5。使用已知的过量放射性铟示踪进行金属结合分析，在两次完全相同的试验中，得到的结果分别为DTPA酶为1.24和DTPA酶为1.41。使用活性为12.0mCi/mg的In-111醋酸盐标记羧酸酯酶-DTPA，然后使用过量的非放射性铟醋酸盐进行处理，最后使用10mMEDTA进行处理，清除其中过量的非放射性铟。HPLC和ITLC分析结果显示放射性铟的掺入率为97.7％。用20倍摩尔量的过量双特异性抗体hMN-14Fab′×734Fab′与经过HPLC分析的样品反应，使样品与抗体完全络合，然后将所得到的产物进一步与WI2(hMN-14的抗-ID)进行络合反应，其中WI2是双特异性抗体的80倍。实施例30)IMP224的合成将0.0596g包含肽IMP221(H2N-NH-C6H4-CO-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2MH+1322，通过FmocSPPS制备的)的苯肼与0.0245g溶解在3mLDMF中的盐酸多索鲁比辛混合。将反应溶液在室温下黑暗条件下进行反应。反应4个小时后，加入0.0263g的IMP221，然后继续反应过夜。然后使用HPLC纯化所有的反应混合物，HPLC条件为WatersNova-Pak(3-40×100mmsegment，6μm，60埃)制备柱，进行梯度洗脱，洗脱液的梯度为缓冲液A∶B＝80∶20到A∶B＝60∶40，洗脱40分钟(缓冲液A＝0.3％NH4OAc，B＝0.3％NH4Oac在90％CH3CN中)。合并包含产物的组分，并使之冻干，得到0.0453g的预定产物，然后使用ESMAMH+1847进行进一步的确定。实施例1)IMP224试剂盒的配制将实施例31的肽装入到试剂盒中，在后续过程中用In-111对其进行标记。制备85mL包含5.014g2-羟丙基-β-环糊精、和0.598g柠檬酸的溶液。用1M的NaOH将溶液的pH调至4.20，并用水稀释到100mL。将0.0010g的IMP224肽溶解在100mL缓冲液中，取其中1mL经过0.22μmMillexGV滤膜进行无菌过滤，过滤到2mL的冻干瓶中，然后将其立即冷冻干燥。实施例32)In-111对IMP224试剂盒进行标记将In-111溶解在0.5mL水中，并注射到冻干试剂盒中。将试剂盒溶液室温下温育10分钟，然后加入0.5mLpH7.2的缓冲液，其中所用的缓冲液包含0.5M的NaOAc和2.56×1-5M的非放射性的铟。实施例33)IMP224试剂盒的体外稳定性用2.52mCi的In-111使用所述方法对其中一个IMP224试剂盒进行标记。取其中一部分体积(0.15mL，370μCi)与0.9mL0.5MpH4.0的柠檬酸盐缓冲液、0.9mL0.5MpH5.0的柠檬酸盐缓冲液和0.9mL0.5MpH7.5的磷酸盐缓冲液混合。然后使用反相HPLC对标记的肽进行稳定性研究。HPLC的条件是WatersRadial-PakC-18Nova-Pak8×100mm，流速为3mL/分钟，梯度为100％A到100％B，其中A为0.3％NH4Oac，B为90％CH3CN、0.3％NH4Oac，洗脱时间为10分钟。表14In/In-111IMP224的体外稳定性结果*表示已经分解没有计算在峰面积中的肽实施例34)IMP221在BALB/c小鼠中的体内生理分布将0.5mL含400μCiIn-111的水加入到试剂盒中。将该In-111试剂盒溶液室温下温育10分钟，然后用含1.5mL非放射性的铟的pH7.20.5M的醋酸盐缓冲液将其稀释。然后使用ITLC在饱和NaCl条件下分析标记的肽。游离In-111位于ITLC长条上部20％。给每只小鼠注射100μL(20μCi)的In-111标记肽。分别在注射后30分钟、1小时、2小时、4小时和24小时时将动物麻痹并杀死，每个时间点取三只小鼠。分别取鼠的血液、肌肉、肝脏、肺、肾、脾、大肠、小肠、胃、尿和尾巴，计算其分布量。所述生理分布研究结果列于下表中。表15IMP224(Dox＝N-NH-C6H4-CO-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2MH+1847，已经用In-111进行了标记，并用非放射性的In进行了饱和)在BALB/c小鼠中的生理分布结果，％ID/g。实施例35)IMP224的体内稳定性和清除将0.5mL含400mCiIn-111的水加入到试剂盒中。将该In-111试剂盒室温下温育10分钟，然后用含0.5mL非放射性的铟的pH7.20.5M的醋酸盐缓冲液将其稀释。然后使用ITLC在饱和NaCl条件下分析标记的肽。游离In-111位于ITLC长条上部20％。给每只小鼠注射100μL(400μCi)的In-111标记肽。分别在注射后30分钟和1小时时将动物麻痹并杀死，每个时间点取两只动物。收集血清和尿样品，并将其储存在冰上，并尽量快速地将其在冰上运送到HPLC处，进行HPLC分析。尿样品的HPLC(排阻层析)分析结果显示，In-111标记的肽仍能与抗体结合。反相HPLC分析结果显示，在尿中的放射性标记肽是完整的。在血清中残留的活性量太低，不能使用灵敏度较低的反相HPLC进行分析。多索鲁比辛在肝胆管中的清除率～95％。因此，通过将可水解形式的双DTPA肽连接到药物上，从而使药物在体内的生理分布转变为100％从肾中排泄。这可以使药物在体内的毒性大大降低，因为所有的未靶向定位的药物都可以以完整形式被快速排泄。表16在尿和血清中回收到的活性实施例36)用IMP224和IMP225进行前靶向定位试验使用一种包含10μg肽的IMP224冻干试剂盒。向2ml的冻干试剂瓶中加入1mL无菌水。取其中0.5mL与1.0mCiIn-111混合。将所述In-111试剂盒溶液在室温下温育10分钟，然后取其中0.1mL用1.9mL非放射性的铟醋酸盐缓冲液BM8-12稀释在无菌瓶中。然后使用ITLC在饱和NaCl条件下分析标记的肽。游离In-111位于ITLC长条上部20％。使用带有GW-39异种移植肿瘤的雌性裸小鼠(TaconicNCRNU，3-4周龄)进行前靶向定位试验。肿瘤在0.3-0.8g之间。给每只动物注射100微升(5μCi，15μg，1.5×10-10mol)的I-125标记的抗体F6×734-(Fab′)2。72小时后，给每只小鼠注射100微升(10μCi)In-111标记的肽。然后分别在注射后1小时、4小时和24小时时将动物麻醉并杀死，每个时间点取5只鼠。然后取小鼠的肿瘤、血液、肌肉、肝脏、肺、肾、脾、大肠、小肠、胃、尿和尾巴，并进行计算。用包含11μg肽的IMP225(Ac-Cys(Dox-COCH2)-Lys(DTPA)-Tyr-Lys(DTPA)-NH2(SEQIDNO11)MNa+1938)冻干试剂盒重复所述的试验。表17In-111-IMP-224在GW-39肿瘤异种移植裸鼠中的生理分布，在72小时前曾施用了F6×734-F(ab′)2。单位为％ID/g组织。n＝5。表18In-111-IMP-224在GW-39肿瘤异种移植裸鼠中的生理分布，在72小时前曾施用了F6×734-F(ab′)2。数据是肿瘤与正常器官的比率。n＝5。表19In-111-IMP-225在GW-39肿瘤异种移植裸鼠中的生理分布，在72小时前曾施用了F6×734-F(ab′)2。单位为％ID/g组织。n＝5本发明所述的双特异性构建体或其它具有类似特性的物质均适合用于前靶向定位RAIT，其中IMP-192和它的类似物用治疗放射性同位素如188-Re、213-Bi、67-Cu等进行了标记。应当认为治疗螯合物能够缀合到肽上，其中肽除了具有螯合物表位外，还有可被bsAbs识别的表位，这正如前面所描述的。还应当意识到，可以使用本发明的前靶向定位方法，将可检测的放射性标记连接上不同的接头，直接被介导到预定位点，如肿瘤，其中所述预定位点是将要在手术中、内窥镜、血管内或其它类似过程中被切除的或是被检测的和/或是被治疗的。使用非放射性的bsAbs也可以实现前靶向定位，而且在所述过程中，最后所施用的低分子量放射性标记接头，在体内定位的速度和未结合接头在体内的清除速度都比较快，这与手术过程中应当避免不必要的拖延相一致，并且所述过程中还可以使用半衰期较短的放射性同位素。另外，所公开的治疗剂也可以用于手术后的放射性免疫治疗方案，以确保彻底根除残余的肿瘤细胞。实施例37)DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2(SEQIDNO1)(IMP245)的合成使用在合成IMP192时所描述的双偶联过程来合成所述肽。使用5eq受保护的DOTA将三-t-丁基DOTA加到带有单个苯并三唑-1-基-氧代-三-(二甲氨基)-磷鎓六氟磷酸盐(BOP)的肽的C-末端，偶联时间为16小时。然后用醋酸酐处理树脂。然后使用钯催化剂去掉侧链上的Aloc基团，并根据合成IMP243时所描述的方法，加上N-三苯甲基-HSG基团。将产物从树脂上切割下来，并用HPLC纯化，收集其中的四种组分，冻干后，得到0.2385g的产物。ESMSMH+1832实施例38)Tc-99m试剂盒组成制备一种配方缓冲液，其包含22.093g的羟丙基-β-环糊精、0.45g的2，4-二羟苯甲酸、0.257g的醋酸钠、和10.889g的α-D-葡庚糖酸钠，将所述成分溶解在170mL的脱氮水中。用几滴1M的NaOH将所述溶液的pH调至5.3，然后稀释到总量220mL。取0.2mLSnCl2(200mg/mL)溶液，用3.8mL的配方缓冲液将其稀释，制得二价锡缓冲液。将肽IMP245(0.0029g)溶解在1mL浓度为1.6×10-3M的InCl3盐酸溶液中，其中盐酸的浓度为0.1M。将肽溶液与2mL0.5M的NH4OAc溶液混合，并室温下温育15分钟。然后将75mL的配方缓冲液和0.52mL的二价锡缓冲液加入到肽溶液中。然后将1.5mL的肽溶液通过0.22μmMillexGV过滤器过滤到3mL的冻干瓶中。然后将瓶立即冷冻、并冻干，并在真空下密封。实施例39)用Tc-99m对IMP245进行标记高温(沸水浴)将溶解在1.5mL盐水中的高锝酸盐溶液(29mCi)加入到试剂盒中。然后将试剂盒在室温下温育10分钟，并在沸水浴中加热15分钟。在使用前将试剂盒冷却到室温。低温(37℃)将溶解在1.5mL盐水中的高锝酸盐溶液(25mCi)加入到试剂盒中。然后将试剂盒在室温孵育14分钟，然后在37℃水浴中加热18分钟，试剂盒在使用前冷却至室温。因为使用了不同的注射器，此次标记的HPLC保留时间略有不同。实施例40)IMP245的肽分析(HPLC)使用反相HPLC和排阻HPLC分析所述肽(结果在下面列出)。排阻HPLC示踪结果表明肽结合了两个mMU-9×m679和两个hMN-14×m679双特异性抗体(参见“AUniversalPre-TargetingSystemforCancerDetectionandTherapyUsingBi-specificAntibody”，Sharkey，R.M.，McBride，W.J.，Karacay，H.，Chang，K.，Griffiths，G.L.，Hansen，H.J.，和Goldenberg，D.M.，在此将该文献全文引入本发明)。反相HPLC结果表明在主峰之前有几个小峰出现，而且加热好像不能显著改变小峰与大峰的比率。SEC回收率单独的Tc-99mImp245为54％，Tc-99mIMP245+hMN-14×m679为66％，Tc-99mIMP245+mMU-9×m679为66％。实施例41)IMP245在血清中的稳定性取50μL的Tc-99mIMP245，用470μL新鲜小鼠血清稀释，并在37℃下温育。分别在温育2.5小时和19小时时，取其中一部分体积使用反相HPLC进行分析。结果表明所述肽表现的相当稳定。实施例42)非放射性的铼IMP245酮基复合物的合成将0.0504g的IMP245与0.0045g的ReOBr4N(bu)4(根据Cotton等的方法合成)和50μL溶在1mLDMF中的DIEA混合，室温下混合5天，来制备铼酮基复合物。使用HPLC来纯化所有的反应混合物，最终得到0.0118g的预期产物。ESMSMH+2031实施例43)Tc-99m试剂盒的组成(龙胆酸配方)将(0.0029g，1.58×10-6mol)IMP245肽溶解于2.0mL0.5MpH5.5的NH4OAc缓冲液中，其中缓冲液中包含0.0020g的InCl3。将肽溶液在50℃下加热17分钟。将22.093g的羟丙基-β-环糊精(HPCD)、0.450g的2，4-二羟苯甲酸(龙胆酸)、0.257g的醋酸钠、10.889g的α-D-葡庚糖酸溶解在170mL的脱氮DI水中。用几滴1M的NaOH将所述溶液的pH调至5.30，然后用DI水稀释到总量220mL。然后将配方缓冲液经过0.22μm的过滤器进行无菌过滤。取0.2mL(200mg/mLSnCl2溶解在6M的HCl中)溶液，用3.8mL的配方缓冲液将其稀释到无氩的无菌瓶中，制得二价锡缓冲液。然后将肽溶液与76mL的配方缓冲液和0.56mL的二价锡缓冲液混合。然后将1.5mL的所述溶液通过MillexGV0.22mm过滤器过滤到3mL的冻干瓶中。然后将冻干瓶立即在干冰中冷冻直至冻干。在冻干完成后，将试剂盒在真空下密封。每个试剂盒包含55μg的肽和1.5mL的99mTcO4-盐水溶液。实施例44)Tc-99m试剂盒组成(抗坏血酸配方)用抗坏血酸配制的Tc-99m试剂盒的制备方法与龙胆酸试剂盒的制备方法相同，只是用0.222g的L-抗坏血酸取代龙胆酸。实施例45)对Tc-99m试剂盒进行标记用1.5mL的99mTcO4-盐水溶液(0.5-70mCi)溶解试剂盒中的肽，然后在室温下温育10分钟。然后将试剂盒在沸水浴中加热15分钟，并在使用前将其冷却到室温。实施例46)Tc-99m/InIMP245的标记和稳定性前面的标记表明用非放射性的铟对DOTA进行饱和能够使Tc-99m/InIMP245的产量提高。龙胆酸配方的试剂盒在用1.5mL30mCiTc-99mIn对肽进行标记时，表现出更加清晰的初始标记，而抗坏血酸配方的试剂盒在标记后，标记肽在室温储存过夜时表现得更加稳定。前面所进行的Tc-99m标记的肽在37℃新鲜血清中的稳定性研究表明，Tc-99m标记的肽在血清中与在试剂盒中一样稳定。对所述标记肽进行扩展梯度HPLC分析，结果显示标记肽有两个峰。导致两个峰的原因可能是由于顺反Tc氧代物的形成。两个峰的比率随肽的序列、组成和标记条件的变化而变化。实施例47)Y-90和In-111对IMP245进行标记将肽溶解在0.5MpH3.08的NH4OAc溶液中，肽的浓度为2.2×10-3M。取其中3.5μL的肽溶液，将其与165μL0.5MpH3.93的NH4OAc溶液和6μL的Y-90溶液混合。然后将混合物加热到85-95℃，持续20分钟。对所述混合物所进行的反相HPLC分析结果显示肽被很好地标记了。在几个不同的条件下使用In-111进行了与所述过程类似的标记过程，但都没有得到清晰标记的产物。随后对没有标记的肽进行HPLC分析，结果显示生成了几个新的峰。该肽在贮存过程中可能生成了二硫化物。在随后的过程中加入了Tc/Re配体，与非放射性的铼一起进行预饱和，以使肽更加稳定，更加有利于进行Y-90、Lu-177和In-111标记。实施例48)用In-111对ReOIMP245进行标记将0.0025g的ReOIMP245肽(MH+2031)溶解在560μL0.5MpH3.98的NH4OAc缓冲液中(肽的浓度为2.2×10-3M)。取2.7μL的ReOIMP245溶液，使之与2μL的In-111(573μCi)和150μL的0.5MpH3.98的NH4OAc缓冲液混合。然后将溶液在沸水浴中加热20分钟。HPLC分析结果显示出现了一个清晰的标记肽的峰，其保留时间类似于Tc-99m/InIMP245。实施例49)生成适于用90Y、111In、和177Lu进行标记的肽bsMAbs的制备双特异性抗体F(ab′)2是由人源化MN-14抗-CEA或鼠Mu-9抗-CSAp的Fab′片段和鼠679组成的，在制备所述双特异性抗体时使用了PDM作为交联接头。首先制备亲代抗体的F(ab′)2。对于hMN-14或Mu-9来说，用1mM的DTT将F(ab′)2还原为Fab′-SH，并使之渗滤到含有0.5mMEDTA的pH5.3的醋酸盐缓冲液中(醋酸盐/EDTA缓冲液)，以除去DTT，并浓缩至5-10mg/mL，在使用前一直将其储存在2-8℃条件下。对于679，使用1mM的DTT将F(ab′)2还原为Fab′-SH，然后用5倍体积的醋酸盐/EDTA缓冲液将其稀释，然后快速加入20mM的PDM(用90％DMF来制备)，使之最终浓度为4mM。室温搅拌30分钟，之后将所得到的溶液(包含679Fab′-PDM)渗滤到醋酸盐/EDTA缓冲液中直至使游离PDM的量到达最低限度，并使所述溶液的浓度浓缩至5-10mg/mL。然后将hMN-14Fab′-SH或Mu-9Fab′-SH与679Fab′-PDM以1∶1的比例混合，所述比例是根据Fab′的量来计算的。加入半胱氨酸至终浓度2mM，来淬灭缀合反应，然后在Superdex200-填充柱(Amersham，PharmaciaBio，Piscataway，NJ)上进行纯化，得到预期的双特异性缀合物(～100kDa)。然后使用SE-HPLC，SDS-PAGE和IEF对所述双特异性缀合物进行分析。对于hMN-14×m679F(ab′)2，其双特异性通过BIAcore和SE-HPLC来加以证明。另外，使用CM-5芯片按照制造商(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ08854)推荐的方法进行BIAcore分析来检测hMN-14×679对HSG的亲和性，其中CM-5芯片来自一种包含单个HSG取代分子和硫醇的肽。为了进行生理分布研究，首先用125INa(PerkinElmerLifeScience，Inc.Boston，MA)使用氯胺-T方法(20)对hMN-14×m679F(ab′)2进行放射性碘标记，然后使用离心排阻柱进行纯化。在质量检测试验中，使用ITLC分析发现未结合的放射性碘小于5％，SE-HPLC(Bio-SilSE250，BioRad，Hercules，CA)分析显示有大于90％的产物以相同的速率进行迁移，形成了一个单峰，在加入过量CEA(ScrippsLaboratories，SanDiego，CA)的情况下，有大于90％的放射性标记产物转变为具有更高分子量的另一种成分。以类似的方法对125I-mMu-9×m679bsMAb进行测试，使用GW-39人类结肠异种移植肿瘤的部分纯化提取物作为CSAp的来源，它能使mMu-9×679bsMAb的洗脱部分变为SE-HPLC柱的无效组分。以所述类似的方法制备人源化MN-14(hMN-14)Fab′-SH。将99mTc-高锝酸盐(30mCi)直接加入到冻干的hMN-14-Fab′-SH(1.0mg)中，并在30分钟内注射到动物体内。通过ITLC分析显示，所述产品有3.0％未结合的99mTc，并有92％的免疫反应组分。肽的放射性标记用于进行90Y、111In、和177Lu标记的二价HSG-肽，即IMP241，其包含DOTA配体，以使所述放射性金属更容易进行结合。将IMP241溶解在0.5M醋酸铵(pH4.0)中，浓度为2.2×10-3M。90YCl3来自于PerkinElmerLifeSciences，Inc.(Boston，MA)，111InCl3来自于IsoTexDiagnostics(Friendswood，TX)，177Lu来自于ResearchReactorFacillity，UniversityofMissouri-Columbia，(Columbia，MO)。在塑料锥形瓶中将3mCi的111InCl3与0.5MpH4.0的醋酸铵(3倍于111InCl3的体积)和2.3μLIMP241(溶解在0.5MpH4.0的醋酸铵溶液中，浓度为2.2×10-3M)混合，来制备111In-IMP241。在离心之后，将混合物在沸水浴中加热30分钟，并随后冷却。将混合物离心，并加入DTPA，使之最终浓度为3mM。在室温下15分钟后，用0.1MpH6.5的醋酸钠将其最终体积升至1.0mL。使用在饱和氯化钠溶液中平衡的反相HPLC和ITLC来检测未结合的同位素的量。反相HPLC分析所使用的柱子是Waters8×100mmradialPakcartridge，填充物是C-18N-va-Pak4μm(固相)。柱子的洗脱速度为1.5mL/分钟，线性梯度为100％A到55％A和45％B，其中A为0.075％的TFA水溶液，B为0.075％TFA溶解在75％乙氰和25％的水组成的溶液中，洗脱时间为15分钟。在洗脱到15分钟时，溶剂已经转换为100％B，在再平衡到起始条件之前，使柱子在该溶剂条件下保持5分钟。反相HPLC结果显示有一个保留时间为11.8分钟的单峰。将111In-IMP241与过量m679IgG混合，并在Bio-SilSE250HPLC凝胶过滤柱上进行分析，结果显示出现了一个与抗体保留时间相同的峰，这表明两者已经发生了结合。用90Y放射性标记IMP-241时，将15mCi的90YCl3、3倍体积的0.5MpH4.0的醋酸铵、和83.2μL的IMP-241(溶解在0.5MpH4.0的醋酸铵中，浓度为1.1×10-4M)混合，并加入抗坏血酸，使抗坏血酸的最终浓度为6.75mg/mL。然后将混合物在沸水浴中加热30分钟，并冷却至室温，之后加入DTPA，使之最终浓度为5mM。15分钟之后，用0.1MpH6.5的醋酸钠将最终体积升至1.0mL。用已经在饱和氯化钠溶液中平衡的ITLC条进行分析，结果显示有小于0.2％的未结合的同位素。将90Y-IMP241与过量m679IgG混合，然后进行SE-HPLC分析，结果显示出现了一个与抗体保留时间相同的峰，这表明两者已经发生了结合。用小鼠血清来测试放射性标记肽的稳定性，将放射性标记肽稀释在10倍体积的小鼠血清中，并在37℃下温育混合溶液。分别在1小时、3小时、和24小时时抽取样品，并用反相HPLC进行分析。在体内的前靶向定位研究GW-39，一种产自人类结肠肿瘤的CEA细胞系(参见Goldenberg，D.M和Hansen，H.J，Carcinoembryonicantigenpresentinhumancolonicneoplasmsseriallypropagatedinhamsters，Science，1751117-18(1972))在裸鼠中进行连续的传代繁殖，方法是在无菌盐水中将1-2克的肿瘤切碎，将切碎的混合物通过金属丝网筛，并将盐水体积调至每10mL盐水中含有1克的肿瘤。给6周龄左右的雌性NCr裸鼠(CharlesRiverLaboratories，Inc.，FredrickMD或Taconic，Germantown，NY)连续灌输0.2ml的所述悬浮液。在肿瘤移植两到三周后，给动物注射单独的放射性标记肽，或为了进行前靶向定位，在注射放射性标记肽之前1到2天给动物施用bsMAb。在前靶向定位过程中，首先给动物静脉注射1.5×10-10摩尔(15μg；6μCi125I)的bsMAb(0.1到0.2mL)，然后给动物静脉注射(0.1-0.2mL)111In-IMP-241(1.5×10-11摩尔，8-10μCi)、177Lu-IMP-241(1.5×10-11摩尔，5μCi)、或99mTc-IMP-243(1.5×10-11摩尔，25-30μCi)。在注射肽指定时间之后，将动物麻醉，心脏穿刺放血，在尸体解剖之前将动物无痛致死。取动物组织、称重并使用合适的窗口通过γ-闪烁计算每种组织的放射性核素的量和注射材料的标准放射量。GI组织(胃、小肠和大肠带着内容物一起称重和计算)。每克组织的注射剂量(％ID/g)和肽在肿瘤组织与正常组织中的百分比率(T/NT)列于下表中。表中和附图中所有的数值均是每次研究中所使用的动物的平均值和标准偏差。结果表20a表示放射性浓度在检测限以下。表21a表示放射性浓度在检测限以下。表22表23表24表25在注射后3小时，在GW-39肿瘤裸鼠中99mTc-hMN-14Fab′的肿瘤/非肿瘤的比率。(n＝5)组织99mTc-hMN-14Fab’肝脏0.2±0.02脾0.9±0.4肾0.02±0.001肺0.7±0.1血液1.0±0.01表26表27表28表29a表示射线吸收剂量以肾的1500cGy剂量进行标准化肽的放射性标记和BsMabs的检测IMP-241DOTA的螯合基团可以使用111In、90Y和其它放射性金属，如177Lu。用所述放射性核素所标记的肽的特异活性分别为600、1650、和300Ci/mmol。用177Lu标记的肽特异活性较低一方面是因为放射金属放置的时间比较长，另一方面是同位素产品发生了融化，不能使177Lu的活性得到最大值。99mTc-肽的特异活性在1500与1600Ci/mmol之间。在每一次标记过程中，调整标记的条件保证肽的放射活性掺入率大于98％，这样就不需要进行纯化了。反相HPLC表明所述标记的肽与新鲜小鼠血清在37℃混合时，所有的肽在24小时内是稳定的，其洗脱峰的形状与刚开始制备出来时相同，没有发生变化。扩展梯度HPLC对IMP-243和245的分析结果表明所述标记肽有两个峰，这可能是因为syn的形成和抗锝酮基种类不同。附图6显示的是hMN-14×m679bsMAb与111In-IMP-241结合的SE-HPLC结果。基本上所述的放射性标记的肽的洗脱时间都转变为bsMAb的洗脱时间，并且当在加入放射性标记肽之前先将CEA加入到bsMAb时，所有的放射性活性均出现在无效组分中。当用CSAp制备mMu-9×m679bsMAb也出现类似的结果(未示出)。利用BIAcore计算mMu-9×m679F(ab′)2bsMAb和所述有一个HSG的肽在芯片上的结合动力学参数，结果表明动力学参数为KD＝1.5×10-9M。肽的生理分布为了进行生理分布研究，IMP-241用发射γ射线的放射性核素111In或177Lu对IMP-241进行了放射性标记，以便于在组织中进行肽的检测，另外IMP-243和IMP-245用99mTc进行了标记。在带有肿瘤的裸鼠中，177Lu-和111In-IMP-241在裸鼠中具有相似的分布状况和清除特性(表20和21)。在所述两种情况下，肽在注射3小时后就被快速地从血液中清除出去，其在血液中的放射活性非常低，不能进行精确的定量测定，但所述肽在主要器官中具有足够的放射活性，能够进行定量测定。放射活性经过肾脏的排泄作用而消除，在监测期间只有少量的放射活性停留在肾脏中。在平均重量为0.15g的肾脏中，在注射后0.5-1.0小时后，肾脏中检测到的放射活性只占到总注射活性的大约0.6％。给另外一组动物施用177Lu-IMP-241，在48小时时进行解剖，但因为在肾脏中的放射活性刚刚能够进行精确测定，因此在表中没有列出所述数据。但是在注射后48小时时，177Lu-IMP-241在肾脏中的量降到0.94±0.2％ID/g，与在注射后24小时时所观测到的数值相比，大约降低了45％。放射活性物质绝大部分排泄到尿中，但也有一小部分通过GI管进行清除。在注射后1.0-3.0小时之内，在所有GI组织(即胃、小肠和大肠)中的放射活性占到注射活性总量的大约0.6-0.7％。到24小时时，在所有GI组织中的放射活性仅占总量的0.07％。99mTc-IMP-243与IMP-241在组织中的分布情况显著不同(表22)。99mTc-IMP-243在血液中的清除速度较慢，在肝脏中的摄取量较大，并且相当多的部分在GI管道。例如，在注射后1小时，小肠包含24.3±4.75％ID/g量的99mTc-IMP-243，到3小时时，放射活性物质转移到大肠中。在注射24小时后，放射活性物质完全从身体中清除。因此，放射活性物质不与GI组织发生实质上的结合，其仅存在于GI内容物中，这与放射活性在小肠和大肠中前进的观测结果相一致。另一个肽IMP-245，在GI组织中放射活性的比例要小得多。在肝脏和肾脏中潴留的量也比99mTc-IMP-243要低。前靶向定位研究使用hMN-14×m679F(ab′)2bsMAb进行前靶向定位99mTc-IMP-243和99mTc-IMP-245能力的试验。其中的bsMAb使用125I进行了放射性标记，这样能够与99mTc-IMP-243或IMP-245同时进行记录。给动物静脉施用bsMAb，在24小时后，给动物施用放射性标记肽，并在施用后3小时和24小时时解剖动物。在前靶向定位过程中，在注射后3小时和24小时时，肿瘤吸收99mTc-IMP-243的量比单独注射肽分别高出将近28和70倍(表23)。在3小时时肿瘤摄取量为12.25±3.32％ID/g，经过24小时降为7.36±3.19。99mTc-IMP-243的量在肿瘤中下降的速度没有bsMAb在肿瘤中下降的快，在相同时间内，bsMAb在肿瘤中的量由4.78±1.11％ID/g下降到2.24±0.53％ID/g。在施用3小时内，99mTc-IMP-243在肿瘤与非肿瘤中的量的比例除了大肠外在其它组织中均高于2.0∶1，这是因为在施用3小时时肽在大肠中还没有被清除，在施用24小时后，肿瘤/大肠的比例增加了近20倍。在肽注射后3小时时，肿瘤/血液比例为2.4±0.6。肿瘤对99mTc-IMP-245的摄取情况与99mTc-IMP-243类似(表6)，只是99mTc-IMP-245肿瘤/非肿瘤的比例要高于99mTc-IMP-243，这主要是因为在施用99mTc-IMP-245的动物中，bsMAb经过清除后，其含量要低于施用99mTc-IMP-243的动物。不过，99mTc-IMP-245前靶向定位系统也具有较低的GI吸收率，甚至是在施用后1小时时，因此该肽比起99mTc-IMP-243来有明显的优点。99mTc-IMP-245肿瘤/肾的比例比99mTc-IMP-243要高。所述生理分布状况数据表明，在施用早期时，比起使用直接进行放射性标记的Fab′片段，99mTc-IMP-245前靶向定位系统应当能够提供更好的成像对比度。还应当强调的是，在注射3小时后，使用99mTc-标记肽的肿瘤/肾比例要明显高于直接被99mTc-hMN-14Fab′放射性标记的抗体片段(表25)。在评价IMP-241肽前靶向定位时使用了两种不同的靶向系统，一个系统使用了人源化抗-CEA抗体(hMN-14)，另一个系统使用了鼠抗-CSAp的抗体(mMu-9)。其中所使用的bsMAb均是将它们的Fab′与鼠679MAb的Fab′进行化学偶联来制备。在生理分布研究中，bsMAb均使用125I进行了放射性标记，这样bsMAb的分布可以同IMP-241一起进行评估，IMP-241使用了111In进行了放射性标记。在所述两种前靶向定位系统中，给带有肿瘤的裸鼠注射的bsMAb和肽的量均是相同的，但因为Mu-9bsMAb在血液中清除的时间要比hMN-14bsMAb长，因此在施用Mu-9bsMAb48小时后，施用放射性标记肽，而施用hMN-14bsMAb时只需经过24小时就可施用放射性标记的肽。hMN-14×679构建体在施用后24小时，在血液中的含量与mMu-9×m679构建体施用48小时后的含量很接近，分别为0.79±0.24％ID/g和0.55±0.10％ID/g。发现Mu-9bsMAb在肿瘤中的含量(13.1±4.36％ID/g)高于MN-14bsMAb(2.92±0.41)，因为在以前对包含Mu-9和抗-CEA抗体的靶向研究中，已经发现Mu-9在GW-39异种移植肿瘤模型中比抗-CEA抗体具有更高的吸收率和更长的潴留时间。因为Mu-9bsMAb在肿瘤中的含量较高，因此肽的浓度相应也较高，在注射肽仅3小时后，浓度即达到17.8±1.4％ID/g，而在使用hMN-14bsMAb进行前靶向定位的动物中，肽的浓度仅为11.3±2.2％ID/g。有趣的是，hMN-14bsMAb与肽结合的效率要高，因为在肿瘤中，在使用hMN-14bsMAb时，施用肽3小时后，肽％ID/g与bsMAb的比例是3.9，而在使用Mu-9bsMAb时，在相同时间后，肽％ID/g与bsMAb的比例是1.4。然而，在Mu-9前靶向定位系统中，肿瘤潴留111In-IMP-241的时间较长，这与bsMAb结合到肿瘤上所需的时间较长相对应。在每一系统中，在3小时时肽bsMAb的比例能够持续到48小时时，这表明肽与bsMAb发生了特异性结合。使用111In-IMP-241前靶向定位系统比起单独使用肽，能够使肿瘤愈合的速度提供100倍(参考表20)。在使用111In-IMP-241进行前靶向定位时，不管是使用那种bsMab前靶向定位系统，其在所有组织的肿瘤/非肿瘤比例也显著高于单独使用111In241肽。总之，在Mu-9bsMAb系统中，111In-IMP-241具有显著较高的肿瘤/非肿瘤比例，尤其是在经过一段时间以后。不管IMP-241是用177Lu放射性标记还是用111In进行放射性标记，所得到的前靶向定位结果是相同的。正如表27所列出的，使用hMn-14bsMAb前靶向定位系统时，177Lu-IMP-241的％ID/g与111In-IMP-241的基本相同。因为111In-IMP-241的生理分布与177Lu-IMP-241的相似，还因为现有技术中已经将111In作为代用物用于预测90Y-的生理分布，因此使用111In-IMP-241和mMu-9×m679F(ab′)2bsMAb能够进行扩展了的生理分布研究。正如附图7中所显示的，因为Mu-9抗体在肿瘤中潴留的时间较长，因此放射性标记肽在肿瘤中潴留的时间也较长。使用这些数据，建立了90Y、和177Lu的放射剂量模型。90Y，因为它的β-射线的能量较高(2.27MeVmax)，因此每mCi对肿瘤所释放的射线剂量比177Lu(495keVmax)要高。但是，为了更好地进行比较，将射线剂量用同种射线对同种剂量限制性组织进行了标准化。在该情况下，选择了对肾1500cGy作为标准剂量，在该剂量下组织是可以耐受的，而且产生的毒性也是相近的。在组织吸收剂量被标准化的情况下，数据显示177Lu-IMP-241与90Y-IMP-241对肿瘤释放的射线剂量是相同的。在肾耐受1500cGy剂量的情况下，肿瘤接受了将近12,000cGy的剂量，该射线剂量对大部分的实体肿瘤来说都是致命的。对本领域技术人员来说，对本发明所公开的组合物和过程作出任何修饰和改变都是显而易见的。因此所述任何修饰和改变均包括在本发明的权利要求书之内。在本发明说明书中所记载的所有出版物全文或部分引入本发明。另外的参考文献如下AranoY，UezonoT，AkizawaH，OnoM，WakisakaK，NakayamaM，SakaharaH，KonishiJ，YokoyamaA.，“Reassessmentofdiethylenetriaminepentaaceticacid(DTPA)asachelatingagentforindium-111labelingofpolypeptidesusinganewlysynthesizedmonoreactiveDTPAderivative，”JMedChem.1996Aug30；39(18)3451-60.Bamias，A.，andEpenetos，A.A.Two-stepstrategiesforthediagnosisandtreatmentofcancerwithbioconjugates.Antibody，Immunoconjugates，Radiopharm.1992；5385-395.Darbet，J.，Peltier，P.，Bardet，S.，Vuillez，JP.，Bachelot，I.，Denet，S.，Olivier，P.，Lecia，F.，Corcuff，B.，Huglo，D.，Proye，C.，Rouvier，E.，Meyer，P.，Chatal，J.F.Radioimmunodetectionofmedullarythyroidcarcinomausingindium-111bivalenthaptenandanti-CEAxanti-DTPA-indiumbispecifcantibody.J.Nucl.Med.1998；391172-1178.Bos，ES.，Kuijpcrs，WHA.，Meeslers-Winters，M.，Pham，DT.，deHaan，AS.，vanDoormalen，Am.，Kasperson，F.M.，vanBoeckcl，CAAandGouegeon-Bertrand，F.InvitroevaluationofDNA-DNAhybridizationasatwo-stepapproachinradioimmunotherapyofcancer.CancerRes.1994；543479-3486.Carretal.，WO00/34317.Gautherot，E.，Bouhou，J.，LeDoussal，J-M.，Manetti，C.，Martin，M.，Rouvier，E.，Barbet，J.Therapyforcoloncarcinomaxenograftswithbi-specificantibody-targeted，iodine-131-labeledbivalenthapten.Cancersuppl.1997；802618-2623.Gautherot，E.，Bouhou，J.，Loucif，E.，Manetti，C.，Martin，M.，LeDoussal，J.M.，Rouvier，E.，Barbet，J.RadioimmunotherapyofLS174Tcoloncarcinomainnudemiceusinganiodine-131-labeledbivalenthaptencombinedwithananti-CEAxanti-indium-DTPAbi-specificantibody.J.Nucl，Med.Suppl，1997；387p.Goodwin，D.A.，Meares，CF.，McCall，MJ.，McTigue，M.，Chaovapong，W.Pre-targetedimmunoscintigraphyofmurinetumorswithindium-111-labeledbifunctionalhaptens.J.Nucl.Med.1988；29226-234.Greenwood，F.C.andHunter，W.M.ThepreparationofI-131labeledhumangrowthhormoneofhighspecificradioactivity.Biochem.1963；89114-123.Hawkins，G.A.，McCabe，R.P.，Kim，C.-H.，Subramaniai，R.，Bredehorst，R.，McCullers，G.A.，Vogel，C.-W.，Hanna，M.G.Jr.，andPomata，N.Deliveryofradionuclidestopretargetedmonoclonalantibodiesusingdihydrofolatereductaseandmethotrexateinanaffinitysystem.CancerRes.1993；532368-2373.Kranenborg，M.h.，Boerman，O.C.，Oosterwijk-Wakka，J.，weijert，M.，Corstens，F.，Oosterwijk，E.Developmentandcharacterizationofanti-renalcellcarcinomaxantichelatebi-specificmonoclonalantibodiesfortwo-phasetargetingofrenalcellcarcinoma.CancerRes.(suppl)1995；555864s-5867sLosmanM.J.，QuZ.，KrishnanI.S.，WangJ.，HansenH.J.，GoldenbergD.M.，LeungS.O.Clin.CancerRes.1999；5(10Suppl.)3101s-3105s.Penefsky，H.S.Acentrifugedcolumnprocedureforthemeasurementofligandbindingbybeefhea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是肿瘤。54.权利要求53的方法，其中所述肿瘤产生或与选自以下的抗原相关结肠-特异性抗原-P(CSAp)、癌胚抗原(CEA)、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD30、CD74、CD80、HLA-DR、Ia、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、EGFR、HER2/neu、PAM-4、TAG-72、EGP-1、EGP-2、A3、KS-1、Le(y)、S100、PSMA、PSA、韧粘素、叶酸受体、VEGFR、坏死抗原、IL-2、T101、MAGE。55.权利要求34的方法，其中所述至少一个特异性结合靶组织的臂是单克隆抗体或单克隆抗体的片段。56.权利要求34的方法，其中所述至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂是单克隆抗体或单克隆抗体的片段。57.权利要求34的方法，其中所述至少一个特异性结合靶组织的臂是人的、嵌合的或人源化的抗体或人的、嵌合的或人源化抗体的片段。58.权利要求34的方法，其中所述至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂是人的、嵌合的或人源化的抗体或人的、嵌合的或人源化的抗体的片段。59.权利要求34的方法，其中所述双特异性抗体或抗体片段进一步包含治疗核素。60.权利要求59的方法，其中所述治疗核素选自111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。61.权利要求34的方法，其中双特异性抗体包含MAbMu-9的Fv和MAb679的Fv。62.权利要求61的方法，其中Mu-9和/或679是嵌合的或人源化的。63.权利要求61的方法，其中Mu-9和/或679是人Mu-9和679。64.权利要求61的方法，其中双特异性抗体包含Mu-9的一个或多个CDRs。65.权利要求61的方法，其中双特异性抗体包含679的一个或多个CDRs。66.权利要求61的方法，其中双特异性抗体是融合蛋白。67.权利要求34的方法，其中双特异性抗体包含MAbMN-14的Fv和MAb679的Fv。68.权利要求67的方法，其中MN-14和/或679是嵌合的或人源化的。69.权利要求67的方法，其中MN-14和/或679是人MN-14和679。70.权利要求67的方法，其中双特异性抗体包含MN-14的一个或多个CDRs。71.权利要求67的方法，其中双特异性抗体包含679的一个或多个CDRs。72.权利要求67的方法，其中双特异性抗体是融合蛋白。73.权利要求34的方法，其中融合蛋白是三价体，并且整合了能与CSAp反应的抗体的Fv。74.权利要求34的方法，其中双特异性抗体整合了III类抗-CEA抗体和679的Fv。75.权利要求34的方法，其中所述靶向构建体包含一种或多种用于消除病灶组织的放射性同位素。76.权利要求34的方法，其中所述靶向构建体包含10B原子，并且所述方法进一步包含照射定位于所述病灶组织的所述硼原子的步骤，从而影响所述病灶组织的BNCT。77.权利要求34的方法，当所述靶向构建体包含酶时，给所述受试者进一步施用药物，该药物能够被所述的酶转化为毒性形式，并由此提高所述药物在靶位点的毒性。78.检测或治疗哺乳动物靶细胞、组织或病原体的方法，其包括施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中所述抗体或抗体片段包含至少一个特异性结合靶的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；和施用包含权利要求1化合物的靶向构建体；其中所述靶包括靶细胞、组织、病原体或由其产生的或与其相关的分子，并且特异性结合所述靶的至少一个臂能够结合到靶的互补结合部分。79.权利要求78的方法，其中所述病原体是真菌、病毒、寄生虫、细菌、原生动物或支原体。80.权利要求79的方法，其中所述真菌选自小孢子菌属、发癣菌属、表皮癣菌属、Ssporothrixschenckii、新型隐球菌、粗球孢菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎牙生菌、白色假丝酵母。81.权利要求79的方法，其中所述病毒选自人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流行性感冒病毒、B型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、Reo病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T-细胞白血病病毒、EB病毒、鼠白血病病毒、流行性腮腺炎病毒、疱疹性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒和蓝舌病毒。82.权利要求79的方法，其中所述细菌选自炭疽杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、化脓链球菌、埃希氏大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌、嗜血B-型流感、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁菌、结核分枝杆菌、和破伤风毒素。83.权利要求79的方法，其中所述寄生虫是蠕虫或疟原虫。84.权利要求79的方法，其中所述原生动物选自镰状疟原虫、间日疟原虫、鼠弓形虫、让氏锥虫、克氏锥虫、罗德西亚锥虫、布氏锥虫、曼森血吸虫、日本血吸虫、牛巴贝虫、Elmeriatenella、旋盘尾丝虫、旋毛线虫、旋盘尾丝虫、小泰勒尔梨浆虫、水泡绦虫、羊绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球蚴、和科尔蒂中殖孔绦虫。85.权利要求79的方法，其中所述支原体选自关节炎支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、拉氏无胆甾原体、唾液支原体、和肺炎支原体。86.权利要求78的方法，其中所述靶向构建体进一步包含至少一种放射性核素、治疗剂、诊断剂或酶。87.权利要求86的方法，其中放射性核素选自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且当靶向构建体包含一种以上核素时，放射性核素可以是不同的放射性核素。88.权利要求86的方法，其中诊断剂包括成像剂。89.一种治疗或鉴定受试者病灶组织的方法，其包括给所述受试者施用双特异性抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；可选择地，给所述受试者施用清除组合物，并使所述组合物将没有定位的抗体或抗体片段从循环中清除出去；和给所述受试者施用包含权利要求1化合物的靶向构建体。90.权利要求89的方法，其中所述受试者是哺乳动物。91.权利要求90的方法，其中所述哺乳动物受试者选自人类、灵长目、马科动物、犬科动物和猫科动物。92.权利要求89的方法，其中所述靶向构建体进一步包含至少一种放射性核素、治疗剂、诊断剂或酶。93.权利要求92的方法，其中放射性核素选自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、197Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且当靶向构建体包含一种以上放射性核素时，放射性核素可以是不同的放射性核素。94.权利要求92的方法，其中诊断剂包括成像剂。95.权利要求92的方法，其中治疗剂包括药物、毒素、细胞因子、激素或生长因子。96.一种用于治疗或鉴定受试者病灶组织的试剂盒，其包括(A)包含权利要求1化合物的靶向构建体；(B)双特异性抗体或抗体片段，其中抗体或抗体片段具有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；其中靶向构建体包括载体部分和一种或多种缀合的治疗剂或诊断剂或酶，其中所述载体部分包含或携带至少一个可被所述双特异性抗体或抗体片段的所述至少另外一个臂识别的表位；和(C)可选择地，一种清除组合物，用于清除没有定位的抗体或抗体片段。97.权利要求96的试剂盒，其中所述诊断剂选自110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr。98.权利要求96的试剂盒，其中所述治疗剂选自111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、64Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、14Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。99.权利要求96的方法，当所述靶向构建体包含酶时，可选择地，该试剂盒进一步包含药物，其中所述药物能够被酶转化为毒性形式，以提高所述药物在靶位点的毒性。100.包含权利要求1化合物的靶向构建体。101.一种哺乳动物正常组织成像的方法，其包括施用有效量的双特异性抗体或抗体片段；和施用包含权利要求1化合物的靶向构建体；其中所述双特异性抗体或抗体片段包含至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；并且其中所述至少一个臂能够与正常组织或靶细胞上或由其产生或与之相关的互补结合部分结合。102.权利要求101的方法，其中所述正常组织是卵巢组织、胸腺组织、甲状旁腺组织、子宫内膜组织、骨髓组织或脾组织。103.权利要求101的方法，其中所述靶向构建体进一步包含至少一种放射性核素、治疗剂、诊断剂或酶。104.权利要求103的方法，其中放射性核素选自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且当靶向构建体包含一种以上放射性核素时，放射性核素可以是不同的放射性核素。105.权利要求103的方法，其中诊断剂包括对照试剂。106.权利要求103的方法，其中诊断剂包括成像剂。107.权利要求106的方法，其中所述成像剂是用于PET的试剂。108.权利要求106的方法，其中成像剂是用于SPECT的试剂。109.权利要求103的方法，其中治疗剂包括药物、毒素、细胞因子、激素或生长因子。110.一种手术中鉴定受试者病灶组织的方法，其包括施用有效量的双特异性抗体或抗体片段；和施用包含权利要求1化合物的靶向构建体；其中双特异性抗体或抗体片段包含至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；并且其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分。111.权利要求110的方法，其中所述靶向构建体进一步包含至少一种放射性核素、治疗剂、诊断剂或酶。112.权利要求111的方法，其中放射性核素选自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dv、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且，当靶向构建体包含一种以上放射性核素时，放射性核素可以是不同的放射性核素。113.权利要求111的方法，其中诊断剂包括对照试剂。114.权利要求111的方法，其中诊断剂包括成像剂。115.权利要求111的方法，其中治疗剂包括药物、毒素、细胞因子、激素或生长因子。116.一种内窥镜鉴定受试者病灶组织的方法，其包括施用有效量的双特异性抗体或抗体片段；和施用包含权利要求1化合物的靶向构建体；其中双特异性抗体或抗体片段包含至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；并且其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分。117.权利要求116的方法，其中所述靶向构建体进一步包含至少一种放射性核素、治疗剂、诊断剂或酶。118.权利要求117的方法，其中放射性核素选自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、196Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、73Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且，当靶向构建体包含一种以上放射性核素时，放射性核素可以是不同的放射性核素。119.权利要求117的方法，其中诊断剂包括对照试剂。120.权利要求117的方法，其中诊断剂包括成像剂。121.权利要求117的方法，其中治疗剂包括药物、毒素、细胞因子、激素或生长因子。122.一种血管内鉴定受试者病灶组织的方法，其包括施用有效量的双特异性抗体或抗体片段，其中双特异性抗体或抗体片段包含至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂；其中所述至少一个臂能够结合到靶细胞、组织或病原体或由其产生的或与其相关的分子上的互补结合部分；和施用包含权利要求1化合物的靶向构建体。123.权利要求122的方法，其中所述靶向构建体进一步包含至少一种放射性核素、治疗剂、诊断剂或酶。124.权利要求123的方法，其中放射性核素选自225Ac、111Ag、72As、77As、211At、198Au、199Au、212Bi、213Bi、75Br、76Br、11C、55Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、169Er、18F、52Fe、59Fe、67Ga、68Ga、154Gd、155Gd、156Gd、157Gd、158Gd、166Ho、120I、123I、124I、125I、131I、110In、111In、194Ir、177Lu、51Mn、52mMn、99Mo、13N、15O、32P、33P、211Pb、212Pb、109Pd、149Pm、142Pr、143Pr、223Ra、82mRb、186Re、188Re、189Re、105Rh、47Sc、153Sm、75Se、83Sr、89Sr、161Tb、94mTc、94Tc、99mTc、86Y、90Y和89Zr；并且，当靶向构建体包含一种以上放射性核素时，放射性核素可以是不同的放射性核素。125.权利要求123的方法，其中诊断剂包括对照试剂。126.权利要求123的方法，其中诊断剂包括成像剂。127.权利要求123的方法，其中治疗剂包括药物、毒素、细胞因子、激素或生长因子。全文摘要本发明涉及可以被双特异性抗体或抗体片段结合的靶向构建体，所述抗体或抗体片段有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂。靶向构建体含有载体部分，所述载体部分包含或携带至少一个可被所述双特异性抗体或抗体片段的至少一个臂识别的表位。该靶向构建体进一步包含一个或多个治疗或诊断剂或酶。本发明提供了构建体和制备靶向构建体、双特异性抗体或抗体片段的方法，以及使用它们的方法。文档编号C07K16/46GK1668335SQ03816898公开日2005年9月14日申请日期2003年5月16日优先权日2002年5月17日发明者D·M·戈登伯格,H·汉森,S·-O·梁,W·J·麦克布里德,Z·屈申请人:免疫医疗公司