特异性识别重金属Cr的纳米抗体及其应用
【专利摘要】本发明涉及特异性识别重金属Cr的纳米抗体及其应用。揭示了针对重金属Cr的纳米抗体，所述的纳米抗体对于重金属Cr具有良好的特异性，与其它金属的交叉反应性很低。利用所述的纳米抗体，可制备方便、快速且准确地检测重金属Cr的试剂盒。
【专利说明】
特异性识别重金属Cr的纳米抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及单克隆抗体技术领域，更具体地，本发明涉及特异性识别重金属Cr的 纳米抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 重金属在大气、水体、土壤及生物体中广泛分布。铬（Cr)在自然界中普遍存在并 被广泛应用。食品中铬污染主要来源于农业土壤中的工业废水。食用含铬过高的食品会引 发口角糜、腹泻、消化紊乱等症状，甚至会导致癌症。铬及其化合物可通过消化道、呼吸道、 皮肤和粘膜进入人体，常以溶液、粉尘或蒸汽的形式污染环境，危害人体健康。因此检测环 境中或样品中的重金属铬的存在与否以及存在量是非常重要的。
[0003] 传统的重金属离子检测方法主要有原子吸收光谱法、紫外分光光度法、阳极溶出 伏安法、示波极谱法和各种仪器联用技术，如电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体 原子发射广谱分析等；这些分析方法虽然能够对环境中的镉离子进行有效分析，而且测量 精度较高，但它们大多需要大型仪器，成本高，样品要经过消解，检测步骤烦琐，不适合现 场、在线分析检测，难以适应现场抽查、大规模检测的需求。
[0004] 重金属免疫检测方法为重金属污染物检测提供了另一种方式，这种方法检测速度 快、费用低廉、易于现场使用。但是，重金属的免疫检测的关键在于重金属特异性抗体的制 备。由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆反应，导致动物中 毒，因此，常规的制备抗体的方法得不到理想的抗体。并且，重金属离子本身分子量很小不 具有免疫原性，且其本身带有电荷，会与分子发生强烈的不可逆反应，所以需选择合适的载 体蛋白以制成完全的免疫原。
[0005] 然而，即使获得了合适的携带重金属离子的免疫原，后续筛选抗体的过程仍然存 在较多的瓶颈，特别是在完全免疫原中金属离子很小，筛选过程中获得的特异性抗体很微 小，甚至难以鉴定到；而针对完全免疫原中金属离子以外的材料如螯合剂、载体蛋白的特异 性抗体将占很大比例；因此筛选难度远远高于常规的单抗筛选方法。
[0006] 综上，本领域需要开发用于检测重金属Cr的免疫检测抗体，以期应用于实时重金 属检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供特异性识别重金属Cr的纳米抗体及其应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种特异性识别重金属Cr的纳米抗体，所述的纳米抗 体的互补决定区具有下组的氨基酸序列：
[0009] SEQ ID N0:2 所示的 CDR1，
[0010] SEQ ID NO:3 所示的 CDR2,和
[0011] SEQ ID NO :4 所示的 CDR3。
[0012] 在一个优选例中，所述的纳米抗体的骨架区具有下组的氨基酸序列：
[0013] SEQ ID N0:5 所示的 FR1，
[0014] SEQ ID NO :6 所示的 FR2，
[0015] SEQ ID NO:7 所示的 FR3,和
[0016] SEQ ID NO :8 所示的 FR4。
[0017] 在另一优选例中，所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的纳米抗体。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种表达载体，该表达载体中含有所述的多核苷酸。
[0020] 在另一优选例中，所述的多核苷酸可以通过分子克隆技术克隆至表达载体pET28a 中，进行表达。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞（为非繁殖细胞），该宿主细胞中含有所 述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种产生纳米抗体的方法，包括：培养所述的宿主细 胞，使之表达所述的纳米抗体。
[0023] 在本发明的另一方面，提供一种纳米抗体菌体（菌粒），其包括：菌体（ 菌粒），以及展示于噬菌体表面的所述的纳米抗体。
[0024] 在另一优选例中，所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的 噬菌体。例如，所述的噬菌体是M13丝状噬菌体。
[0025] 在本发明的另一方面，提供所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体的用途，用 于检测重金属Cr ;或用于制备检测重金属Cr的试剂或试剂盒。
[0026] 在另一优选例中，所述的用途为非诊断性的用途。较佳地，用于检测来自人体或动 物体以外的样品（如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等）中的重金属Cr。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种用于检测重金属Cr的试剂盒，所述的试剂盒中包 括所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体。
[0028] 在一个优选例中，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体或纳米抗体· 菌体被固定于固相载体（如多孔板、盖玻片、微珠）或游离存在。
[0029] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：
[0030] 能与所述的纳米抗体连接的可检测标记物（如HRP)，所述的可检测标记物被连接 于所述的纳米抗体或分离地存在于试剂盒；和/或
[0031] Cr标准品或Cr偶联物（为Cr与载体蛋白的偶联物，如Cr-DTPA-BSA、 Cr-DTPA-〇VA)标准品；和/或
[0032] 与可检测标记物相对应的底物；和/或
[0033] 酶联免疫反应试剂（包括但不限于：包被（缓冲）液，洗涤（缓冲）液，封闭液，固 定液，终止液，显色液）；和/或
[0034] 说明检测重金属Cr的方法的使用说明书。
[0035] 在本发明的另一方面，提供一种检测待测样品中重金属Cr存在情况的方法，所述 方法包括：
[0036] 以所述的纳米抗体或所述的纳米抗体菌体作为重金属Cr的检测抗体，通过酶 联免疫反应法来检测待测样品中重金属Cr的存在情况。
[0037] 在另一优选例中，将待测样品包被于固相载体上，以携带或不携带可检测标记物 (以携带可检测标记物的抗抗体进一步结合）的所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体 作为检测抗体，检测重金属Cr的存在情况。
[0038] 在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。所述的待测样品是来自人体或 动物体以外的样品（如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等）。
[0039] 在本发明的另一方面，提供一种筛选特异性识别重金属Cr的纳米抗体的方法，所 述方法包括：
[0040] (1)将Cr分别与载体蛋白BSA、0VA偶联，分别获得Cr与BSA偶联物和Cr与0VA 偶联物；
[0041 ] (2)分别以（1)获得的Cr与BSA偶联物和Cr与0VA偶联物作为抗原，筛选纳米抗 体库，富集与之特异性结合的纳米抗体；筛选方案为以Cr与BSA偶联物和Cr与0VA偶联物 交替进行筛选，筛选3-8轮；
[0042] (3)应用酶联免疫反应法来鉴定特异性识别重金属Cr的纳米抗体，获得特异性良 好的纳米抗体。
[0043] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0044] 图1、本发明的实施例中进行的研究工作的整体流程步骤示意图。
[0045] 图 2、SDS-PAGE 分子量检测的结果。其中，1、Cr-DTPA-BSA ;2、DTPA-BSA ;3、BSA ; 4、Marker ;5、0VA ;6、DTPA-0VA ;7、Cr-DTPA-0VA〇
[0046] 图3、Cr-DTPA抗体库富集度及特异性检测。
[0047] 图4-8、第四、五轮单克隆ELISA验证。纵坐标为0D450值；图4-6的横坐标为三 个批次第四轮挑选出的抗体克隆编号。图7横坐标为第五轮挑选出的抗体克隆编号。图8 的横坐标为从第四轮挑选出的抗体克隆号。
[0048] 图9、阳性单克隆特异性初检测。纵坐标为0D450值，横坐标为抗体克隆号。
[0049] 图10、Cr-VHH-螯合物竞争性ELISA结果。纵坐标为0D450值，横坐标为2nmol/ L-6. 25mmol/L浓度梯度的螯合物半抗原PBS溶液。
[0050] 图11、Cr-DTPA-VHH 4-63亲和常数Kaffl定。纵坐标为0D450值，横坐标为纳米 抗体噬菌体浓度（pfu/孔）。
[0051] 图12、Cr-DTPA-VHH 4-63与DTPA浓度关系摸索结果。横坐标为DTPA浓度。
[0052] 图13、测定Cr-单克隆抗体（Cr-DTPA-VHH 4-63)与其他重金属的交叉反应的间接 竞争性ELISA标准抑制曲线。
【具体实施方式】
[0053] 本发明人经过深入的研究，揭示了一种针对重金属Cr的纳米抗体，所述的纳米抗 体对于重金属Cr具有良好的特异性，与其它金属的交叉反应性很低。本发明的纳米抗体可 灵敏检测重金属Cr，重复性好，结果稳定；利用所述的纳米抗体，可制备方便、快速且准确 地检测重金属Cr的试剂盒。
[0054] 术语
[0055] 如本文所用，所述的"纳米抗体"是指缺失轻链的重链抗体（如：来源于骆驼体 内），克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量（Mr)仅 约为15000。纳米抗体具有分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。
[0056] 如本文所用，所述的"检测抗体"是指特异性地抗重金属Cr的抗体。
[0057] 如本文所用，所述的"可检测标记物"是指位于检测抗体上的，用于确定待检测样 品中重金属Cr的存在与否以及存在的量的标志物。如：酶、焚光标记、核素、量子点、胶体金 等。优选的，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酯酶（AP)、葡萄糖氧化 酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0058] 如本文所用，所述的"与可检测标记物相对应的底物"是指可被检测抗体的标记物 所催化显色，用于显示检测抗体与重金属Cr发生结合的识别信号。所述的底物比如：用于 辣根过氧化物酶的邻苯二胺（0PD)、四甲基联苯胺（TMB)、ABTS ;用于碱性磷酸酯酶的对硝 基苯磷酸酯（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP);等等。
[0059] 抗重金属Cr蛋白的纳米抗体
[0060] 本发明提供了一种纳米抗体，所述的纳米抗体筛选自驼源性天然单域重链抗体 库。
[0061] 本发明所述的纳米抗体，能高亲和力特异性与重金属Cr结合。
[0062] 本发明也包括所述的纳米抗体的变异体、衍生物和类似物。如本文所用，术语"变 异体"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的纳米抗体相同的生物学功能或活性 的多肽。本发明的多肽变异体、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是 也可以不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用 来纯化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽）。根据本文的定义这些变异体、衍生物和 类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0063] 此外，在所述的纳米抗体的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所 述的纳米抗体的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利 于表达（如信号肽），有利于纯化（如6 XHis序列），或其它可促进所述的纳米抗体的活性、 表达量或稳定性的序列。
[0064] 本发明还包括编码本发明的纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA分子。所述的DNA 分子可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。
[0065] 为了进一步提尚宿主细胞的表达量，可以对本发明的纳米抗体的编码序列进彳丁改 造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。
[0066] 在获得了编码本发明新纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA序列之后，将其克隆 入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化 得到本发明的新的纳米抗体。
[0067] 如本文所用，术语"载体"包括质粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。可选用本 领域已知的各种载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新纳米抗体的核苷酸序列 可操作地连于表达调控序列，可以形成表达载体。
[0068] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达纳米抗体的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、 昆虫细胞、COS细胞、CHO细胞等。较佳地，该宿主细胞是原核细胞，更佳地是大肠杆菌细胞。
[0069] 在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明纳米抗体的条件下培养该细胞， 从而表达出纳米抗体；然后再分离出表达的纳米抗体。
[0070] 试剂盒
[0071] 基于本发明获得的新的纳米抗体，本发明提供一种检测重金属Cr的试剂盒，所述 的试剂盒可用于重金属Cr的检测。所述的试剂盒含有：本发明所述的纳米抗体或纳米抗体 噬菌体（噬菌粒）。
[0072] 作为一种实施方式，可以将待测样品包被于固相载体上，以本发明的纳米抗体作 为检测抗体进行检测，所述的纳米抗体可连接一可检测标记物，或可以与连接可检测标记 物的另一抗体（抗抗体）结合，从而获知待测样品中重金属Cr的存在情况。应理解，在获 得了本发明的纳米抗体后，可以采取多种本领域已知的方式来实施重金属Cr的检测，这些 方式均包含在本发明中。
[0073] 在确定了本发明的试剂盒所采用的检测抗体后，可以采用本领域常规可用于与检 测抗体结合来进行检测的各种标记物作为可检测标记物。本发明对所采用的标记物没有特 别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样 品中重金属Cr的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自 (但不限于）：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过 氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。例如，所述的检测抗体采用辣根过氧化物酶（HRP)标记。抗体 标记的方法在本领域是公知的，例如用简易过碘酸钠法或者戊二醛二步法进行HRP标记抗 体。
[0074] 当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从 而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如（但不限于）： 用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺（0PD)、四甲基联苯胺（TMB)、ABTS;用于碱性磷酸酯酶的 对硝基苯磷酸酯（p _nitrophenyl phosphate，p-NPP) 〇
[0075] 为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置质控（对照）。所述的质控品例如 采用重金属Cr标准品。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多 个重金属Cr的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。利用所述的标准品，标 准曲线如下设置：用标准品的0D值检测结果为纵坐标（Y轴），标准品浓度为横坐标（X轴） 绘制成重金属Cr试剂盒的定量标准曲线。从而，根据待测样品检测获得的0D值，利用标准 曲线可计算出待测样品中重金属Cr的浓度。
[0076] 此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其 它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是酶联免疫试验中常规使用的一些试剂，这些试剂的特 性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如（但不限于）：显 色剂、洗涤液、终止液，增敏稀释液。
[0077] 所述的包被抗体被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限 制，只要其能够与包被抗体相偶联（连接）即可。例如，所述的固相载体选自：微量滴定板 (又称为多孔板，如96孔板）或微球。
[0078] 在本发明的一个实例中，采用的固相载体是微量滴定板（酶标板），所述的微量滴 定板是一种聚苯乙稀板，规格是12X8可拆卸条板。
[0079] 由于本发明的试剂盒采用的纳米抗体配合单克隆抗体对于重金属Cr具有极其优 异的结合特性（高特异性）。按照上述方法，只要设置已知浓度的抗原对照，制作浓度标准 曲线，通过比照浓度标准曲线就可以得出待测样品中的重金属Cr含量。
[0080] 由于金属的分子量比较小，很难通过直接免疫等方法来获得抗体，因此本领域中 目前获得特异性抗重金属的纳米抗体较为困难。而本发明首次获得一种对于重金属Cr特 异性良好的纳米抗体，能够快速检验重金属Cr，检测过程方便快捷成本低，且抗体扩增稳定 性强。本发明为有效检测重金属Cr提供了一种优异的试剂。
[0081] 本发明的能够与重金属特异性结合的纳米抗体具有体积小、易于进行基因操作和 热稳定性高等优势，相对于已经存在的传统抗体具有更好的技术效果。
[0082] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0083] 以下实施例的纳米抗体筛选方法以及纳米抗体鉴定方法如图1所示。
[0084] 实施例1、重金属完全抗原的制备及鉴定
[0085] 1、完全抗原的制备
[0086] 本发明人所用的噬菌体抗体库展示技术是固相纯化抗原筛选的一种筛选方法， 重金属离子本身分子量很小不具有免疫原性无法对其进行固相化，且其本身带有电荷，会 与分子发生强烈的不可逆反应，所以与载体蛋白（BSA、0VA)偶联形成完全抗原再进行筛 选。这里本发明人利用一种双功能螯合剂P-SCN-Bn-DTPA(简称DTPA)--既能与金属离 子螯合又能与载体蛋白偶联，从而得到完全抗原Cr-DTPA-BSA、Cr-DTPA-〇VA及无金属抗原 DTPA-BSA、DTPA-0VA。
[0087] 重金属离子与螯合剂的螯合：
[0088] 取一定量的DTPA溶液（10mg/ml)于无菌的1. 5ml EP管中，用0. 1M PH7. 4的HEPES 缓冲液稀释，然后以Cr3+与DTPA摩尔比为4:1的比例逐滴缓慢地加入Cr 3+溶液，边加边缓 慢振荡，调PH 7. 0后用封口膜将管口封好，然后将上混合液转移至旋转培养器上，25°C下 螯合反应16h。
[0089] 螯合物Cr-DTPA与载体蛋白的偶联：
[0090] 取一定量的载体蛋白溶液BSA和0VA，使得蛋白与螯合剂的摩尔比为30:1，于一新 的1. 5ml EP管中（0. 1M PH9. 0HEPES缓冲液稀释），然后将螯合好的螯合物取出，缓慢的加 入到蛋白稀释液中，边加边缓慢混匀，调PH至PH 9. 0后用封口膜将管口封好，然后于旋转 培养器上，25°C下偶联反应24h。同时，制备一批无金属抗原，即DTPA-BSA/0VA (步骤同螯合 物与载体蛋白的偶联）。
[0091] 超滤：
[0092] 偶联结束后，将混合物转移至预先处理好的Millipore超滤管（先用去离子水冰 浴0. 5h，再用预冷的HBS缓冲液冰浴0. 5h)中，BSA抗原用30KD的超滤管，0VA抗原用10KD 超滤管。先用〇. 01M PH 9. 0的HEPES缓冲液稀释（终体积为3ml)超滤1次，然后再用0. 1M PH 7. 4的HEPES缓冲液稀释超滤3次，分别于3500rpm，4°C离心10min，最后两次均用移液 枪小心吹洗滤膜，以免膜上有蛋白残留，超滤结束后小心将内管底部的液体吸出，即为完全 抗原Cr-DTPA-BSA/OVA，及无金属抗原DTPA-BSA/OVA ;收集超滤液进行检测以观察是否有 蛋白损失。
[0093] 2、完全抗原的鉴定
[0094] 对于制备的抗原，包括完全抗原（Cr-DTPA-BSA、Cr-DTPA-〇VA)及无金属抗原 (DTPA-BSA、DTPA-0VA)进行鉴定，其中最直观也是最主要的是SDS-PAGE分子量检测，另外 同时进行紫外及质谱鉴定。
[0095] SDS-PAGE分子量检测的结果如图2。
[0096] 通过SDS-PAGE检测结果：与载体蛋白组对比，DTPA-载体蛋白、重金属-DTPA-载 体蛋白的分子量逐渐变大，蛋白胶中迀移速率逐渐变慢，三者形成明显的梯度，可以初步证 明完全抗原制备是成功的。
[0097] 通过SDS-PAGE，可以证明本发明人成功制备了完全抗原Cr-DTPA-BSA和 Cr-DTPA-OVA。由于完全抗原的成功制备是获得重金属抗体的首要条件，为之后的抗体筛选 奠定基础，可以用于之后的抗体筛选工作。
[0098] 实施例2、Cr-纳米抗体库的筛选、富集
[0099] 1、筛选
[0100] 在驼类、鲨鱼等动物体内存在特殊的单链抗体，这种抗体天然缺少轻链，故称为重 链抗体（Heavy-chain Antibodies，HCAbs)，重链可变区上可以结合的抗原最小单位称之为 VHH 抗体（Variable domain of Heavy chain of Heavy chain antibody, VHH)，分子量约 13kDa，又称为Nanobody。因其分子量小、易穿透组织，而使其很容易接近靶目标表面的沟、 裂缝以及被隐藏的抗原表位，能够识别许多传统抗体无法识别的抗原结合位点；另外，VHH 还具有稳定性高，水溶性高，易表达，成本低且可以无限量扩增，以及与特定抗原决定表位 结合的空间位阻小等优势，这使得其在疾病的诊断等相关的试剂盒研制等方面有很大的优 势。
[0101] 将未经免疫的骆驼体内的免疫B细胞中的VHH mRNA反转录为cDNA，然后将可变 区克隆到噬菌粒（Phagemid)内，将重组的噬菌粒转化入E. coli TG1中，最后在辅助噬菌体 M13K07 (购自美国Stratagene公司）的辅助下包装、扩增，利用噬菌体展示技术将VHH蛋白 片段展示在M13K07的表面，形成驼源性的天然单域重链抗体（VHH)库。
[0102] 因为重金属Cr (或重金属螯合物Cr-DTPA)分子很小，抗体库中特异性针对Cr (或 Cr-DTPA)的抗体很少，有很多针对载体蛋白或是螯合剂等的抗体。所以，为了降低非特异 性，本发明人采用两种抗原即Cr-DTPA-BSA和Cr-DTPA-〇VA交替进行抗体库的筛选，即第二 轮筛选时包被的是抗原Cr-DTPA-〇VA，后面的几轮依次交替筛选，筛选进行五轮。由于抗原 的交替，所以加抗体库的时候也要同时加入相对应的载体蛋白共同孵育，以吸附一些非特 异性抗体降低非特异性。
[0103] 纳米抗体第一轮库的富集步骤如下：
[0104] 先准备宿主菌：取冻存的TG1甘油菌，在无菌操作台将TG1菌液以划线法划于LB 平板上，以便于次日挑单菌落。
[0105] ⑴抗原包被
[0106] 取一定量的抗原Cr-DTPA-BSA加入到一定碳酸盐包被缓冲液（pH = 9. 6)，使其终 浓度为30 μ g/ml，加入Nunc孔中，250 μ 1/孔，共3孔，37°C包被2h ;
[0107] (2)准备宿主菌：
[0108] 前日过夜培养的TG1平板，挑取一个单菌落于新鲜的2XTY培养基（10ml)中， 37°C摇床扩增培养，保证在第7步侵染时其0D600达到0. 4~0. 6 ;
[0109] (3)乙醇胺封闭
[0110] 10mM的乙醇胺溶液封闭活性位点：包被结束，将孔内液体扣干，用无菌的1XPBS 加满孔洗涤10次，然后加入10mM的乙醇胺溶液，300 μ 1/孔，37°C封闭lh ;
[0111] (4)BSA 封闭
[0112] 3%的BSA封闭潜在蛋白结合位点：将孔内液体扣干，用无菌的1XPBS加满孔洗涤 10次，然后加入3%的BSA，300 yl/孔，37°C封闭1.5h ;
[0113] (5)加原始VHH抗体库
[0114] 取原始噬菌体VHH库液300 μ 1 (共约1013个噬菌体）与300 μ 1 3 %的BSA混合 (降低非特异性），然后以200 μ 1/孔的体积加入Nunc孔中，于微量振荡器室温振荡40min， 然后室温静置lh ;
[0115] (6)噬菌体洗脱、中和
[0116] 无菌的1XPBST洗涤10次，后PBS洗涤10次，尽量甩干孔内的残留液体，然后加 入10mM的HC1洗脱液200 μ 1/孔，于微量振荡器室温振荡洗脱30min ;将洗脱液小心吸出 (吸出的时候可以用移液枪小心吹打，以增加洗脱量），加入到新的无菌的50ml离心管中， 然后加入200 μ 1的0. 1M Tris-HCl混匀中和；
[0117] (7)噬菌体抗体库侵染宿主菌
[0118] 将洗脱中和后的噬菌体加入到5ml 0D600 = 4. 0-6. 0的新鲜的TG1菌液中，37°C 静置40min ;
[0119] (8)洗脱计数
[0120] 取适量侵染液用2XTY培养基稀释，以10倍梯度稀释（10 ^10 12)，取10μ1的 各稀释度的细胞液于LB-氨苄平板上涂布，37°C孵箱内孵育过夜，寻找平板上菌落数量在 100~200之间的平板计算洗脱下来的噬菌体的数目；剩余的洗脱中和液加入5ml新鲜的 2 X TY培养基，37 °C再摇荡培养30min ;
[0121] (9)辅助噬菌体M13K07侵染
[0122] 加5μ1的M13K07噬菌体（约1012个）于上侵染液中，37°C静置侵染lh，然后 于4800rpm室温离心10min，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的2XTY培养基中，加 Amp至 100 μ g/ml，Kan 至 50 μ g/ml，葡萄糖加至 0· 1 %，然后于 30°C，200rpm 振荡培养 16_20h ;
[0123] (10)噬菌体的纯化
[0124] 过夜菌转移至50ml无菌离心管中，4800rpm，4°C离心20min，弃沉淀，上清液转移 到新的50ml离心管中，加入1/5体积比的40%PEG 4000&2. 5M NaCl溶液，强烈振荡后冰浴 20min ;然后再于4800rpm，4°C离心20min，弃上清，用无菌的1 XPBS缓冲液将沉淀重悬后用 0. 22 μ Μ滤膜过滤除菌，并测其滴度，即为筛选第一轮的抗体库。
[0125] 第二、三、四、五轮的富集步骤同第一轮。采用两种抗原即Cr-DTPA-BSA和 Cr-DTPA-OVA交替进行抗体库的筛选，即第二轮筛选时包被的是抗原Cr-DTPA-OVA，后面的 几轮依次交替。
[0126] 2、Cr-纳米抗体库富集度及其特异性检测
[0127] 对多克隆抗体库进行初步验证，以确定库中是否存在特异性针对重金属的抗体。 因为重金属离子本身的分子量太小，针对其的抗体也较少。因此先测定Cr-DTPA抗体库第 一至五轮抗体库富集度。并且，即使通过抗原交替的方式筛选得到的抗体库中也会存在有 很多非特异的抗体，如针对载体蛋白BSA/0VA的，针对无金属偶联物DTPA-BSA/DTPA-OVA或 是针对螯合剂DTPA的抗体，所以需对其先进行特异性检测。Cr-DTPA VHH库富集度及特异 性的ELISA检测步骤如下：
[0128] ⑴抗原包被：浓度均为2. 5 μ g/ml，抗原包括Cr-DTPA-BSA和Cr-DTPA-〇VA，阴性 对照组包括BSA和0VA包被组及单纯的包被液组，100 μ 1/孔，4°C包被12h ;
[0129] (2) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200 μ 1/孔， 37°C封闭 1. 5h ;
[0130] (3) 1 X PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，每孔中分别加入不同轮次的VHH噬菌体 5X 101°个，用5%的脱脂奶粉稀释，100 μ 1/孔，37°C静置lh ;
[0131] (4) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复一次上面的 洗涤过程，扣干孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释， 100以1/孔，37。(：，111 ;
[0132] (5) IX PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复一次上面的洗 涤过程，扣干孔内液体，加入显色底物液A+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时 间根据阴性对照组定；
[0133] (6)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0134] (7)酶标仪读取0D450值，并分析结果。
[0135] 通过对比完全抗原Cr-DTPA-BSA/OVA和载体蛋白BSA/0VA组（图3)。由图3可见， 每一轮筛选都能有效提高抗体富集程度。由图3可见，交替筛选抗体库后，不仅具有很好的 Cr-DTPA富集度而且也有很好的特异性，这为之后的单克隆抗体挑选打下很好的基础。
[0136] 实施例3、单克隆抗体阳性克隆筛选
[0137] 1、单克隆初步筛选一一阳性筛选
[0138] 通过间接性ELISA验证：酶标板分别包被Cr-DTPA-BSA和DTPA-BSA，挑选仅对 Cr-DTPA-BSA呈阳性而对DTPA-BSA呈阴性的克隆，视为阳性克隆，然后对它们进行下一步 的验证。
[0139] 同步进行两组实验，分别以Cr-DTPA-BSA和DTPA-BSA为抗原进行检测。具体过程 如下：
[0140] (1)抗原包被：完全抗原Cr-DTPA-BSA和无金属抗原DTPA-BSA包被，浓度均为 2. 5 μ g/ml，100 μ 1/ 孔，4°C包被 12h ;
[0141] (2) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200 μ 1/孔， 37°C封闭 1. 5h ;
[0142] (3) 1 X PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将每个单克隆上清分别加入对应的孔内， 100以1/孔，37°(：静置111;
[0143] (4) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣 干孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5 %的脱脂奶粉以1:3000稀释，100 μ 1/孔， 37〇C,lh ；
[0144] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入显色底物液A+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴性 对照组定；
[0145] (6)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0146] (7)酶标仪读取0D450值，并进行数据分析。
[0147] 第四轮单克隆ELISA验证结果如图4-7。
[0148] 经过阳性克隆初筛，挑选其中阳性较好的克隆，第四轮：4-29、4-31、4-54、4-63、 4-72及4-90号。第五轮：5-20号。对这些克隆进行进一步的验证其结果如图8所示，其中 第四轮：4-29、4-63和4-72号阳性显著。
[0149] 2、Cr-阳性克隆特异性初步检测
[0150] 经过初步筛选，对视为阳性的克隆进行初步特异性验证，初步确定其特异性：因为 通过完全抗原包被筛选得到的抗体对螯合剂会有很大的依赖性，也就是说螯合剂本身可能 对抗体就有一定的抑制作用（也可视为假阳性），抗体库中也存在很多的针对螯合剂的抗 体，所以为了排除螯合剂对抗体的影响及螯合剂抗体，首先要对阳性克隆进行初步特异性 排除。通过间接性ELISA验证：酶标板分别包被Cr-DTPA-BSA、DTPA-BSA和BSA，挑选仅对 Cr-DTPA-BSA呈阳性而对DTPA-BSA和BSA呈阴性的克隆，视为阳性克隆，然后对它们进行下 一步的验证。
[0151] 同步进行三组实验，分别以Cr-DTPA-BSA、DTPA-BSA和BSA为抗原进行检测。具体 过程如下：
[0152] (1)抗原包被：完全抗原Cr-DTPA-BSA、无金属抗原DTPA-BSA和载体蛋白BSA包 被，浓度均为2. 5 μ g/ml，100 μ 1/孔，4°C包被12h ;
[0153] (2) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200 μ 1/孔， 37°C封闭 1. 5h ;
[0154] (3) 1 X PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将每个单克隆上清分别加入对应的孔内， 100以1/孔，37°(：静置111;
[0155] (4) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣 干孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5 %的脱脂奶粉以1:3000稀释，100 μ 1/孔， 37〇C,lh ；
[0156] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入显色底物液A+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴性 对照组定；
[0157] (6)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0158] (7)酶标仪读取0D450值，并进行数据分析。
[0159] 阳性克隆特异性初步检测结果如图9所示。由结果可以看出之前挑选的7个阳性 克隆中只有两个是特异性针对Cr-DTPA-BSA的。且这两个克隆与之前验证结果一致。随着 挑选的进行，抗体库中针对螯合剂DTPA的抗体比例逐渐增多，而阳性克隆逐渐降低。因此， 并不是筛选的轮次越高越好，虽然在筛选过程中轮次越高抗体的亲和力可能越高，但却不 一定是适合所有实验的。正如本发明人针对小分子抗体的筛选实验，就必须要保证抗体库 一定的多样性，因为本身完全抗原和单独的金属离子或金属螯合物是由区别的。尽管如此， 本发明人可以看出，第四轮的63(VHH4-63)、72号（VHH4-72)克隆显示出了较为理想的特异 性，所以挑选这两个克隆重新扩增纯化再进行进一步的验证实验。
[0160] 3、Cr-单克隆抗体（VHH)-螯合物竞争ELISA
[0161] 通过对单克隆VHH 4-63和4-72的扩增、纯化，获得对应的噬菌体抗体即纳米抗 体，分别与螯合物进行竞争性ELISA (VHH孵育浓度均为5 X lO'fu/孔，100 μ 1/孔），观察 这几个抗体的特异性及亲和力。以上所得的阳性克隆4-63和4-72,取其所对应的原菌液以 1:100的比例重新接种扩增、纯化，后用于进一步的特异性验证。
[0162] (1)阳性克隆原菌液重新1:100接种于10ml新鲜的于2 ΧΤΥ培养基+Amp (100 μ g/ ml)，37°C摇至 0D600 = 0· 4-0. 6 ;
[0163] (2)辅助噬菌体M13K07侵染：菌液中加入5 μ 1的M13K07噬菌体（约1012个）， 37°C静置侵染lh ;
[0164] (3)侵染液于4800rpm，室温离心10min，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的 2 X TY+Amp (100 μ g/ml) +Kan (50 μ g/ml) +IPTG (ImM)，3(TC，200rpm 振荡培养 16-20h ;
[0165] (4)噬菌体抗体的纯化：将过夜菌转移到50ml无菌离心管中，4800rpm，4°C离心 20min，将上清转移到新的50ml离心管中，加入体积比为1/5的40% PEG 4000&2. 5M NaCl 溶液，强烈振荡后冰浴20min ;然后再于4800rpm，4°C离心20min，弃上清，沉淀重悬于适量 无菌的1XPBS缓冲液中，然后用0. 22 μΜ的滤膜过滤除菌，并进行滴度测定。
[0166] 对纯化后的抗体进行其与螯合物的竞争ELISA包括步骤：
[0167] ⑴抗原包被：抗原Cr-DTPA-BSA用包被液稀释至2. 5 μ g/ml，包被96孔板；阴性 对照组：BSA 2. 5 μ g/ml包被，100 μ 1/孔，4°C过夜；
[0168] (2)5%的脱脂奶粉，200 以1/孔，37°(：封闭1.511;
[0169] (3)在一排EP管中，建立从2nmol/L-6. 25mmol/L浓度梯度的螯合物半抗原PBS溶 液，分别加入单克隆VHH稀释液，5X 101(7孔（100 μ 1/孔），37°C孵育45min ;
[0170] (4) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将上混合液分别加入对应的孔内，100 μ 1/ 孔，37°C静置lh ;
[0171] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100 μ 1/孔，37°C 静置lh ;
[0172] (6) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入显色底物A液+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴性 对照组定；
[0173] (7)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0174] (8)酶标仪读取0D450,分析结果。
[0175] Cr-VHH-螯合物竞争性ELISA结果如图10。通过初步定性实验表明，两个单克隆 噬菌体抗体中，Cr-DTPA-VHH 4-63表现出较好的亲和力（在没有竞争剂的情况下，0D450值 高），而Cr-DTPA-VHH 4-72表现出非常弱的亲和力。
[0176] 就与竞争剂的相互作用：由曲线可以看出，在无竞争剂的情况下Cr-DTPA-VHH4-63 表现出较好的亲和力，随着Cr 3+离子浓度的增加，Cr-DTPA-VHH4-63与固定在板上的 抗原的结合能力呈现出显著的下降趋势，证明Cr3+离子对其有明显的竞争作用，即 Cr-DTPA-VHH4-63对重金属Cr具有很好的特异性。
[0177] 4、Cr-DTPA单克隆VHH氨基酸序列的测定
[0178] 通过对Cr-DTPA-VHH 4-63的测序，获得Cr-DTPA-VHH 4-63的可变区的氨基酸序 列如下（SEQ ID N0:1):
[0180] VHH氨基酸序列共分为7部分：4个骨架区分别为FR1(SEQ ID N0:5)、FR2(SEQ ID N0:6)、FR3(SEQ ID N0:7)及 FR4(SEQ ID N0:8)，3 个超变区分别为 CDR1(SEQ ID N0:2)、 CDR2(SEQ ID N0:3)及CDR3(SEQ ID N0:4);以上序列中标出的粗斜体部分为超变区，其余 的为骨架区，符合典型的纳米抗体序列特点。
[0181] 重组表达纳米抗体的方法：首先，将VHH编码序列插入到pET28a载体的多克隆位 点中，在宿主菌Rosta (购自北京全式金生物技术有限公司）中进行蛋白表达，重组菌株表 达方法如下：
[0182] (1)取保存的甘油菌20 μ 1于10ml含有50 μ g/ml卡那抗性的LB培养液中，37°C 振荡培养过夜。
[0183] (2)在50ml培养瓶中，取过夜培养液500 μ 1加入含有50ml 50 μ g/ml卡那抗性的 LB培养液中，37 °C振荡培养至0D600达到0. 4-0. 6。
[0184] (3)各取lml培养液测其0D600值，6000rpm离心3min，去上清。按(?600Χ100μ1 的量加入IX上样缓冲液，作为未诱导对照。
[0185] (4)诱导时加入相应的0. 5mMIPTG浓度，30°C摇床培养。
[0186] (5)诱导约6小时后收集菌液，取40ml菌液于50ml离心管中，6000rpm，4°C离心 15min，去上清。
[0187] (6)以每100ml菌液加入4ml 1XPBS的比例重悬湿菌，先用枪头打碎菌块，再混 匀。
[0188] (7)加入终浓度为ImM的PMSF蛋白酶抑制剂，防止目的蛋白降解。PMSF有剧毒， 拿装PMSF的试管时必须带上手套。
[0189] (8)取lml PBS重悬菌液于1.5ml EP管中超声，超声时EP管置于冰上。10s超声， 15s间隔，200W，30次循环。
[0190] (9)超声后加入终浓度2% Triton-100帮助目的蛋白融解于上清，不会影响目的 蛋白活性。
[0191] (10)4°C，12000rpm离心15min。上清置于新EP管中，沉淀用lml PBS充分重悬。
[0192] (11)按比例加入6X上样缓冲液，样品处理方法同前。
[0193] (12) SDS-PAGE和蛋白免疫印记分析方法检验抗体表达情况。
[0194] (13)选取小量抗体诱导表达中条件，在保证培养环境相同的情况下，扩大表达时 LB的体积，以使抗体能在近似相同的条件下表达，表达出的抗体直接用于纯化。经验证，表 达纯化后获得序列正确的纳米抗体。
[0195] 实施例4、Cr-单克隆抗体（Cr-DTPA-VHH 4-63)反应条件优化
[0196] 1、棋盘法最佳抗原抗体反应浓度摸索和常数Kaff测定
[0197] 用棋盘法（抗原梯度包被，抗体梯度稀释）摸索最佳抗原抗体反应浓度，并根据该 结果计算抗体的亲和力，选择合适的抗原抗体浓度进行之后的特异性检测。在特定的抗原 抗体浓度条件下，在最佳反应浓度条件下对其进行包被温度、包被时间及螯合物与抗体孔 外孵育时间等条件进行摸索。棋盘法具体步骤如下：
[0198] 抗原（Cr-DTPA-BSA/OVA)、抗体（Cr-DTPA-VHH 4-63)棋盘法测其最佳抗原抗体浓 度条件，并通过非竞争性ELISA法计算该VHH的亲和常数Kaff。
[0199] (1)抗原包被：抗原Cr-DTPA-BSA梯度包被，四个浓度梯度分别为5 μ g/ml、 2. 5 μ g/ml、1. 25 μ g/ml和0. 625 μ g/ml，碳酸盐包被缓冲液稀释后包被96孔板，阴性对照 组包被对应浓度的BSA，100 μ 1/孔，4°C包被过夜；
[0200] (2) 5% 的脱脂奶粉，200 μ 1/ 孔，37°C封闭 1. 5h ;
[0201] (3)抗体孵育：用5%的脱脂奶粉梯度稀释，抗体浓度分别为1. 66nM，0. 332nM， 0. 0664nM 和 1. 328*10 2nM，共四个梯度；
[0202] (4) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将上各梯度的抗体稀释液分别加入对应的 孔内，100μΙ/孔，37°C静置lh ;
[0203] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100 μ 1/孔，37°C 静置lh ;
[0204] (6) 1 X PBST洗涤3遍，加满洗涤液后于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣 干孔内液体，加入显色底物A液+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴 性对照组定；
[0205] (7)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0206] (8)酶标仪读取吸光值（0D450)，并进行数据分析。
[0207] 通过对该噬菌体抗体与抗原浓度关系的摸索（图11):随着抗体浓度的逐渐增加， 0D450也逐渐增大，在最大浓度1 X 10npfu/孔（对应1. 66ηΜ)时开始进入平台期；而就抗 原包被浓度，随着抗原浓度的增加，抗体与抗原的结合能力明显增加。但是在最大抗体浓度 下，抗原在5 μ g/ml和2. 5 μ g/ml浓度条件下，结合力增加的幅度很小，几乎接近平台期。
[0208] 所以，从实验灵敏性和经济两方面考虑，之后的验证选择的最佳抗原包被浓度为 2. 5 μ g/ml，抗体孵育浓度为1 X 10npfu/孔，100 μ 1/孔。
[0209] 根据非竞争性亲和力计算法，Kaff= (n-l)/2(n[Ab' ]-[Ab])，式中[Ab]和[Ab' ] 分别代表当抗原浓度为[Ag]和[Ag' ]时0D50(即最大光吸收密度一半）对应的抗体浓度 (mol/L)，η = [Ag]/[Ag' ]。然后两两比较，n = 8时可得1个K值；当n = 4时，可得2个 K值；η = 2时可得3个K值；最后对6个K值求平均值作为即为最后结果。通过计算，该抗 体 Cr-DTPA-VHH 4-63 的 Kaff约为 1. 279Χ 10 9L/mol。
[0210] 在最佳抗原抗体浓度条件下，通过对不同包被温度、时间及游离半抗原孔外孵育 时间的优化，确定最优包被条件：4°C包被12h ;游离抗原与抗体孔外孵育时间：45min。
[0211] 2、VHH与DTPA浓度关系摸索
[0212] 因为通过螯合剂将重金属离子与蛋白偶联制备的抗原筛选得到的抗体很大程度 上要依赖于螯合剂，但浓度太高又会对抗原抗体的结合会有影响，所以需要确定抗体与 DTPA 的关系。DTPA 浓度：0mM，0· 125mM，0. 25mM，0. 5禮，11111，21111，41111及81111，分别与稀释好 的抗体1:1混和，充分混匀后于37°C反应45min。
[0213] (1)抗原包被：抗原Cr-DTPA-BSA用包被液稀释至2. 5 μ g/ml，包被96孔板；阴性 对照组：BSA 2. 5 μ g/ml包被，100 μ 1/孔，4°C过夜；
[0214] (2)5%的脱脂奶粉，20(^1/孔，37°(：封闭1.511;
[0215] (3)在一排EP管中，分别建立从浓度梯度的DTPA，加入单克隆VHH 4-63， 5 X 101。/ 孔（100 μ 1/ 孔），37°C孵育 45min
[0216] (4) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将上混合液分别加入对应的孔内，100 μ 1/ 孔，37°C静置lh ;
[0217] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100 μ 1/孔，37°C 静置lh ;
[0218] (6) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入显色底物A液+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴性 对照组定；
[0219] (7)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0220] (8)酶标仪读取0D450,分析结果。
[0221] Cr-DTPA-VHH 4-63与DTPA浓度关系摸索结果如图12。由上述结果可以看出，与 阳性对照组对比：随着DTPA浓度的增加会对抗原抗体的结合产生抑制作用，所以对抗体与 DTPA的浓度关系摸索还是很有必要的，但是，由上结果：DTPA浓度小于ImM的情况下对抗原 抗体的结合是影响较小，所以，之后的验证实验中螯合剂DTPA的含量应小于ImM。
[0222] 实施例5、Cr-单克隆抗体（Cr-DTPA-VHH 4-63)与其他重金属的交叉实验
[0223] 运用间接竞争性ELISA检测法，进行抗体与其他金属离子的交叉反应。选择其他 不同金属离子：Ca 2+、Mg' Mn2+、Zn2+、Sn2+、Fe3+、Al 3+，它们与金属镉与螯合剂DTPA螯合的步 骤完全相同（见实施例1)，金属离子与DTPA摩尔比均为4:1 (螯合剂DTPA的量相同），然 后用螯合好的金属螯合物分别进行竞争性ELISA (所有条件与Cr-DTPA -致），结果进行对 比。
[0224] ⑴抗原包被：抗原Cr-DTPA-BSA用包被液稀释至2. 5 μ g/ml，包被96孔板；阴性 对照组：BSA 2. 5 μ g/ml包被，100 μ 1/孔，4°C过夜；
[0225] (2)5%的脱脂奶粉，200 以1/孔，37°(：封闭1.511;
[0226] (3)在一排EP管中，分别加入相同浓度不同金属螯合物作为竞争剂，分别加入单 克隆 VHH ^θβ,δΧΙΟ1。/孔（100μΙ/孔），37°C孵育 45min
[0227] (4) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将上混合液分别加入对应的孔内，100 μ 1/ 孔，37°C静置lh ;
[0228] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100 μ 1/孔，37°C 静置lh ;
[0229] (6) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入显色底物A液+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴性 对照组定；
[0230] (7)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0231] (8)酶标仪读取0D450,分析结果。
[0232] 用不同金属离子的螯合物作为竞争剂，运用间接竞争性ELISA法进行抗体与不同 金属离子的交叉反应。由于此方法为间接竞争性ELISA方法，如果抗体与金属离子具有交 叉性，则金属离子螯合物作为竞争剂可以竞争抗原与抗体的结合，从而使得最终结果为阴 性。而如果抗体与其它金属离子交叉性小，则其金属螯合物不能与抗原竞争抗体，抗体依旧 与包被在板上的抗原结合，因此最终结果为阳性。
[0233] 由图13可以看出，该抗体与其他金属离子（包括一价、二价及三价等不同价态的 金属离子）没有交叉性或是交叉性很小（误差允许范围内），说明该抗体的特异性非常好。
[0234] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种特异性识别重金属Cr的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的互补决定区 具有下组的氨基酸序列： SEQ ID N0:2 所示的 CDR1， SEQ ID N0:3 所示的 CDR2,和 SEQ ID N0:4 所示的 CDR3。2. 如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的骨架区具有下组的 氨基酸序列： SEQ ID N0:5 所示的 FR1， SEQ ID NO:6 所示的 FR2， SEQ ID NO:7 所示的 FR3,和 SEQ ID NO :8 所示的 FR4。3. 如权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的氨基酸序列如 SEQ ID N0:1 所示。4. 一种多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1-3任一所述的纳米抗体。5. -种纳米抗体噬菌体，其特征在于，其包括：噬菌体，以及展示于噬菌体表面的权利 要求1-3任一所述的纳米抗体。6. 权利要求1-3任一所述的纳米抗体或权利要求5所述的纳米抗体噬菌体的用途，用 于检测重金属Cr ;或用于制备检测重金属Cr的试剂或试剂盒。7. -种用于检测重金属Cr的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求1-3 任一所述的纳米抗体或权利要求5所述的纳米抗体·菌体。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳 米抗体或纳米抗体噬菌体被固定于固相载体或游离存在。9. 如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括： 能与所述的纳米抗体连接的可检测标记物，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米 抗体或分离地存在于试剂盒；和/或 Cr标准品或Cr偶联物标准品；和/或 与可检测标记物相对应的底物；和/或 酶联免疫反应试剂；和/或 说明检测重金属Cr的方法的使用说明书。10. -种检测待测样品中重金属Cr存在情况的方法，其特征在于，所述方法包括： 以权利要求1-3任一所述的纳米抗体或权利要求5所述的纳米抗体菌体作为重金属 Cr的检测抗体，通过酶联免疫反应法来检测待测样品中重金属Cr的存在情况。11. 一种筛选特异性识别重金属Cr的纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 将Cr分别与载体蛋白BSA、0VA偶联，分别获得Cr与BSA偶联物和Cr与OVA偶联 物； (2) 分别以（1)获得的Cr与BSA偶联物和Cr与OVA偶联物作为抗原，筛选纳米抗体 库，富集与之特异性结合的纳米抗体；筛选方案为以Cr与BSA偶联物和Cr与OVA偶联物交 替进行筛选，筛选3-8轮； (3) 应用酶联免疫反应法来鉴定特异性识别重金属Cr的纳米抗体，获得特异性良好的 纳米抗体。
【文档编号】G01N33/543GK105985439SQ201510058480
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】姚刚, 王娟, 俞华齐, 姜忍忍, 依布拉音
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院