特异性识别重金属Cd的纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及单克隆抗体技术领域，更具体地，本发明涉及特异性识别重金属Cd的 纳米抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着工业的迅速发展，镉（Cd)的生产和使用不断增加，环境镉污染及其引起的疾 病不时可见报导。最近研究表明，一般人群中低剂量镉环境暴露即可引起肾功能损伤、骨矿 密度降低、钙排泄增加及生殖毒性。因此检测环境中或样品中的重金属镉的存在与否以及 存在量是非常重要的。
[0003] 传统的重金属离子检测方法主要有原子吸收光谱法、紫外分光光度法、阳极溶出 伏安法、示波极谱法和各种仪器联用技术，如电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体 原子发射广谱分析等；这些分析方法虽然能够对环境中的镉离子进行有效分析，而且测量 精度较高，但它们大多需要大型仪器，成本高，样品要经过消解，检测步骤烦琐，不适合现 场、在线分析检测，难以适应现场抽查、大规模检测的需求。
[0004] 重金属免疫检测方法为重金属污染物检测提供了另一种方式，这种方法检测速度 快、费用低廉、易于现场使用。但是，重金属的免疫检测的关键在于重金属特异性抗体的制 备。由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆反应，导致动物中 毒，因此，常规的制备抗体的方法得不到理想的抗体。并且，重金属离子本身分子量很小不 具有免疫原性，且其本身带有电荷，会与分子发生强烈的不可逆反应，所以需选择合适的载 体蛋白以制成完全的免疫原。
[0005] 然而，即使获得了合适的携带重金属离子的免疫原，后续筛选抗体的过程仍然存 在较多的瓶颈，特别是在完全免疫原中金属离子很小，筛选过程中获得的特异性抗体很微 小，甚至难以鉴定到；而针对完全免疫原中金属离子以外的材料如螯合剂、载体蛋白的特异 性抗体将占很大比例；因此筛选难度远远高于常规的单抗筛选方法。
[0006] 综上，本领域需要开发用于检测重金属Cd的免疫检测抗体，以期应用于实时重金 属检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供特异性识别重金属Cd的纳米抗体及其应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供一种特异性识别重金属Cd的纳米抗体，所述的纳米抗 体的互补决定区具有下组的氨基酸序列：
[0009] SEQ ID N0:2 所示的 CDR1，
[0010] SEQ ID NO:3 所示的 CDR2,和
[0011] SEQ ID NO :4 所示的 CDR3。
[0012] 在一个优选例中，所述的纳米抗体的骨架区具有下组的氨基酸序列：
[0013] SEQ ID N0:5 所示的 FR1，
[0014] SEQ ID N0:6 所示的 FR2，
[0015] SEQ ID NO:7 所示的 FR3,和
[0016] SEQ ID NO:8 所示的 FR4。
[0017] 在另一优选例中，所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0018] 在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的纳米抗体。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种表达载体，该表达载体中含有所述的多核苷酸。
[0020] 在另一优选例中，所述的多核苷酸可以通过分子克隆技术克隆至表达载体pET28a 中，进行表达。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞（为非繁殖细胞），该宿主细胞中含有所 述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种产生纳米抗体的方法，包括：培养所述的宿主细 胞，使之表达所述的纳米抗体。
[0023] 在本发明的另一方面，提供一种纳米抗体噬菌体（噬菌粒），其包括：噬菌体（噬 菌粒），以及展示于噬菌体表面的所述的纳米抗体。
[0024] 在另一优选例中，所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的 噬菌体。例如，所述的噬菌体是Ml3丝状噬菌体。
[0025] 在本发明的另一方面，提供所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体的用途，用 于检测重金属Cd ;或用于制备检测重金属Cd的试剂或试剂盒。
[0026] 在另一优选例中，所述的用途为非诊断性的用途。较佳地，用于检测来自人体或动 物体以外的样品（如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等）中的重金属Cd。
[0027] 在本发明的另一方面，提供一种用于检测重金属Cd的试剂盒，所述的试剂盒中包 括所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体。
[0028] 在一个优选例中，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体或纳米抗体噬 菌体被固定于固相载体（如多孔板、盖玻片、微珠）或游离存在。
[0029] 在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：
[0030] 能与所述的纳米抗体连接的可检测标记物（如HRP)，所述的可检测标记物被连接 于所述的纳米抗体或分离地存在于试剂盒；和/或
[0031] Cd标准品或Cd偶联物（为Cd与载体蛋白的偶联物，如Cd-DTPA-BSA、 Cd-DTPA-〇VA)标准品；和/或
[0032] 与可检测标记物相对应的底物；和/或
[0033] 酶联免疫反应试剂（包括但不限于：包被（缓冲）液，洗涤（缓冲）液，封闭液，固 定液，终止液，显色液）；和/或
[0034] 说明检测重金属Cd的方法的使用说明书。
[0035] 在本发明的另一方面，提供一种检测待测样品中重金属Cd存在情况的方法，所述 方法包括：
[0036] 以所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体作为重金属Cd的检测抗体，通过酶 联免疫反应法来检测待测样品中重金属Cd的存在情况。
[0037] 在另一优选例中，将待测样品包被于固相载体上，以携带或不携带可检测标记物 (以携带可检测标记物的抗抗体进一步结合）的所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体 作为检测抗体，检测重金属Cd的存在情况。
[0038] 在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。所述的待测样品是来自人体或 动物体以外的样品（如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等）。
[0039] 在本发明的另一方面，提供一种筛选特异性识别重金属Cd的纳米抗体的方法，所 述方法包括：
[0040] (1)将Cd分别与载体蛋白BSA、0VA偶联，分别获得Cd与BSA偶联物和Cd与0VA 偶联物；
[0041] ⑵分别以⑴获得的Cd与BSA偶联物和Cd与0VA偶联物作为抗原，筛选纳米抗 体库，富集与之特异性结合的纳米抗体；筛选方案为以Cd与BSA偶联物和Cd与0VA偶联物 交替进行筛选，筛选3-8轮；
[0042] (3)应用酶联免疫反应法来鉴定特异性识别重金属Cd的纳米抗体，获得特异性良 好的纳米抗体。
[0043] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【附图说明】
[0044] 图1、本发明的实施例中进行的研究工作的整体流程步骤示意图。
[0045] 图 2、SDS-PAGE 分子量检测的结果。其中，1、Marker ;2、BSA ;3、DTPA-BSA ; 4、Cd-DTPA-BSA ;5、0VA ;6、DTPA-0VA ;7、Cd-DTPA-〇VA ;8、Cd-DTPA-BSA 超滤液；9、 Cd-DTPA-〇VA 超滤液。
[0046] 图3、抗原紫外检测图谱。
[0047] 图4、噬菌体VHH库的富集筛选示意图。
[0048] 图5、Cd-DTPA抗体库第一至七轮抗体库富集度。
[0049] 图6、Cd-DTPA抗体库富集度及特异性检测。
[0050] 图7、第四轮单克隆ELISA验证。
[0051] 图8、第六轮单克隆ELISA验证。
[0052] 图9、Cd-单克隆噬菌体VHH-螯合物竞争性ELISA示意图。
[0053] 图10、第四轮阳性单克隆特异性初检测。
[0054] 图11、第六轮阳性单克隆特异性初检测。
[0055] 图12、Cd-VHH-螯合物竞争性ELISA结果。
[0056] 图 13、Cd-DTPA-VHH 4-18 亲和常数 Kaff 测定。
[0057] 图14、Cd-DTPA-VHH 4-18与DTPA浓度关系摸索结果。
[0058] 图 15、Cd-DTPA-VHH 4-18 与 Cd-DTPA 及 DTPA 间接竞争性 ELISA。
[0059] 图16、间接竞争性ELISA标准抑制曲线。
[0060] 图17、测定Cd-单克隆抗体（Cd-DTPA-VHH 4-18)与其他重金属的交叉反应的间接 竞争性ELISA标准抑制曲线。
[0061] 图18、间接竞争性ELISA检测法检测加强的水样。
【具体实施方式】
[0062] 本发明人经过深入的研究和试验，揭示了一种针对重金属Cd的纳米抗体，所述的 纳米抗体对于重金属Cd具有良好的特异性，与其它金属的交叉反应性很低。本发明的纳米 抗体可灵敏检测重金属Cd，重复性好，结果稳定；利用所述的纳米抗体，可制备方便、快速 且准确地检测重金属Cd的试剂盒。
[0063] 术语
[0064] 如本文所用，所述的"纳米抗体"是指缺失轻链的重链抗体（如：来源于骆驼体 内），克隆其可变区得到的单域抗体，是最小的功能性抗原结合片段，相对分子质量（Mr)仅 约为15000。纳米抗体具有分子质量小、稳定性强、可溶性好、易表达，免疫原性低等特点。 [0065] 如本文所用，所述的"检测抗体"是指特异性地抗重金属Cd的抗体。
[0066] 如本文所用，所述的"可检测标记物"是指位于检测抗体上的，用于确定待检测样 品中重金属Cd的存在与否以及存在的量的标志物。如：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金 等。优选的，所述的标记物选自：辣根过氧化物酶（HRP)、碱性磷酸酯酶（AP)、葡萄糖氧化 酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0067] 如本文所用，所述的"与可检测标记物相对应的底物"是指可被检测抗体的标记物 所催化显色，用于显示检测抗体与重金属Cd发生结合的识别信号。所述的底物比如：用于 辣根过氧化物酶的邻苯二胺（0PD)、四甲基联苯胺（TMB)、ABTS ;用于碱性磷酸酯酶的对硝 基苯憐酸酯（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP);等等。
[0068] 抗重金属Cd蛋白的纳米抗体
[0069] 本发明提供了一种纳米抗体，所述的纳米抗体筛选自驼源性天然单域重链抗体 库。
[0070] 本发明所述的纳米抗体，能高亲和力特异性与重金属Cd结合。
[0071] 本发明也包括所述的纳米抗体的变异体、衍生物和类似物。如本文所用，术语"变 异体"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的纳米抗体相同的生物学功能或活性 的多肽。本发明的多肽变异体、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性 氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是 也可以不是由遗传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用 来纯化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽）。根据本文的定义这些变异体、衍生物和 类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0072] 此外，在所述的纳米抗体的氨基端或羧基端还可添加其它基本上不影响本发明所 述的纳米抗体的活性、表达量和稳定性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利 于表达（如信号肽），有利于纯化（如6 X His序列），或其它可促进所述的纳米抗体的活性、 表达量或稳定性的序列。
[0073] 本发明还包括编码本发明的纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA分子。所述的DNA 分子可以全部人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。
[0074] 为了进一步提高宿主细胞的表达量，可以对本发明的纳米抗体的编码序列进行改 造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。
[0075] 在获得了编码本发明新纳米抗体或其变异体、衍生物的DNA序列之后，将其克隆 入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化 得到本发明的新的纳米抗体。
[0076] 如本文所