IL-12/CD107a融合蛋白增强CTL抗肿瘤效果的治疗剂及其制法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域，具体地涉及一种基于IL-12膜迀移瞬时表达的高效低毒的 肿瘤治疗剂及其制法和用途。
【背景技术】
[0002] IL-12是一种非常重要的免疫刺激因子。IL-12是由共价键链接的异质性二聚体细 胞因子，由P35和p40亚基组成，在体内由激活的免疫细胞分泌。IL-12是重要的细胞免疫调 控因子，在抗感染免疫及恶性肿瘤的免疫中通过NK细胞以及CTL发挥作用。
[0003] 虽然IL-12具有显著的抑瘤效果，但是由于其系统性全身给药会引起全身性毒副 反应，因而受到极大的限制。在本发明之前，IL-12的临床应用由于其所诱导的全身性毒副 作用，以及早期临床试验通过全身系统性给药引起的两例患者的意外死亡，使其临床应用 受到大大的限制。
[0004] 为了避免全身性给药的毒副作用从而实现临床应用的目的，临床科研工作者们通 过肿瘤局部注射、瞬时表达及多点注射等途径应用于肿瘤的临床试验，但是由于IL-12的治 疗效果同回输的IL-12的剂量直接相关，上述局部的临床方案并未有取得显著的抑瘤效果。
[0005] 为了解决这一问题，本发明人曾经试图通过基因修饰抗肿瘤T细胞持续分泌IL-12 来实现抗肿瘤效果的最大化，但是由于未知的原因（一种可能的原因是IL-12的毒副作用） 通过持续分泌IL-12方案基因修饰的T细胞在体外不能有效扩增，并引起大量的T细胞凋亡。 [0006]肿瘤已经成为超越心血管疾病危害人类健康的第一杀手，本领域尚缺乏高效且低 毒副作用的基于IL-12的抗肿瘤药物。因此，本领域迫切需要开发高效且低毒副作用的肿瘤 治疗药物。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是提供了一种高效且毒副作用低的肿瘤治疗药物及其制法和应 用。
[0008] 本发明构建了一系列IL-12/CD107a的融合蛋白，包括IL-12的全序列（包括IL-12 的分泌片段），及在IL-12的C-端与⑶107a的N-端加入一个链接肽段(SGSG)分别同⑶107a 的全长序列及去掉分泌肽的CD107a连接的分子策略。实验数据显示，上述两种融合蛋白基 因修饰抗肿瘤CTL后，可以增强体内外的抗肿瘤反应，其中无分泌肽的CD107a融合蛋白不但 可以显著延长荷瘤小鼠生存，同时对基因修饰的抗肿瘤T细胞的体外扩增没有明显的毒副 作用，是一种非常有临床应用前景的抗肿瘤增效方案。
[0009] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0010] 图1.抗肿瘤CTL表达融合蛋白hscIL-12/CD107a的增效分子机制示意图。CD107a (又称为LAMP1)是一种表达于溶酶体上的跨膜蛋白，它的N-端位于溶酶体腔囊一侧，C-端是 一小段肽段，朝向胞浆一侧，当抗肿瘤T细胞在识别肿瘤抗原时，溶酶体与T细胞膜融合而发 生T细胞或NK细胞的脱颗粒效应，即T细胞或NK细胞释放效应分子颗粒酶(Granzyme B)及穿 孔素(perforin)而达到杀伤肿瘤细胞的过程。在T细胞与肿瘤T细胞发生反应的时，CD107a 迀移到T细胞膜上的特性已经被广泛地应用于反映 T细胞杀伤功能的一个指标。如图左侧所 示，当抗肿瘤T细胞识别肿瘤的同时，T细胞内的溶酶体向胞膜一侧迀移并融合，CD107a分子 暴露于细胞膜外，并可以检测，标示为CD107a阳性细胞。如图右侧所示，为了实现IL-12的溶 酶体囊内表达，本发明构建了一系列IL-12/⑶107a的融合蛋白，包括IL-12的全序列(包括 IL-12的分泌片段）及在IL-12的C-端与⑶107a的N-端加入一个链接肽段分别与全长的 ⑶107a分子及去除分泌肽段的⑶107a分子融合，当T细胞识别肿瘤细胞时，IL-12分子通过 CD107a迀移到T细胞膜表面，实现抗肿瘤的增效反应。
[0011] 图2.hscIL-12/⑶107a融合蛋白系列的构建及转导抗肿瘤T细胞介导的表达。A.慢 病毒表达IL-12/CD107a融合蛋白系列载体的构建。通过第三代慢病毒载体表达融合蛋白， 所选用的启动子为MSCV及EF-la，已经被广泛地应用于人体的肿瘤免疫细胞治疗，具有表达 的稳定性及安全性，表达基因构件可以替代为需要表达的基因，即MART-1TCR以及IL-12/ 0)107a融合蛋白系列等。该载体的5'及3'LTR( long terminal repeat)被改造成SIN-LTR (self-inactivating-LTR)，目的是降低慢病毒重组的机率，增强安全性能，联合WPRE终止 RNA转录的功能，是目前广泛应用于临床的最新一代的基因工程载体结构。B.T细胞的基因 修饰策略。T细胞活化后，通过两次转导即MART-1TCR(第一天)及图示中三个载体的序贯转 导（第4天），于第14天，与表达MART-1识别靶点的肿瘤细胞526、938共培养。C.抗肿瘤T细胞 膜表面IL-12分子的表达。共培养4小时后，通过流式细胞仪检测T细胞膜表面hscIL-12的表 达。
[0012] 实验数据显示，细胞膜表面的IL-12只有在表达a-12/CD107a的融合蛋白组同表 达MART-1的MHC A2+反应组中可以检测出来，分泌型的IL-12膜表面没有表达。
[0013] 图3.慢病毒载体表达hscIL-12/CD107a转导的T细胞的增效反应。如图所示，T细胞 序贯转导抗肿瘤TCR及hscIL-12/CD107a融合蛋白系列14天后，与肿瘤细胞526及938共培 养，16小时后，上清中IFN γ及IL-12表达水平通过ELISA试剂盒检测。同TCR基因修饰组比 较，序贯转到融合蛋白组表现出明显的抗肿瘤增效反应，即分泌高水平的IFNy ;但是实验 上清中，只有C1组（持续分泌IL-12组）可以检测到分泌的IL-12。*表示与对照组比较，p〈 0.001。
[0014] 图4.慢病毒载体表达IL-12/⑶107a系列转导的T细胞可以有效避免持续性分泌 IL-12造成的体外Τ细胞扩增的毒副作用。Τ细胞序贯转导抗肿瘤TCR及IL-12/CD107a融合蛋 白系列14天后，各组细胞与对照转导组(T-cell)的扩增倍数比较，转导持续分泌IL-12组较 其它各组的扩增倍数显著降低，*，Ρ〈〇.〇〇1。其中，转导IL-12/CD107a的C2组与转到IL-12/ (no signal peptide)无分泌肽⑶107a的C3组比较，扩增倍数显著降低，**，Ρ〈0.01 <Χ3组与 TCR-T组比较，扩增倍数接近，未见显著差异。
[0015] 图5.慢病毒载体hscIL-12/⑶107a系列转导鼠 T细胞介导的细胞回输治疗显著延 长荷瘤小鼠的生存。雌性pme 1小鼠（每组7只小鼠）通过B16F10细胞(5000细胞八鼠）植入颅内 (IC) 5天，细胞回输前1天小鼠接受5 G y全身放疗。鼠的T细胞取自小鼠的脾脏细胞，通过 10ug/ml的刀豆蛋白（Con A)在IL-2(5IU/ml)存在的条件下活化;第2天，用图示中慢病毒载 体转导T细胞，然后继续培养6天，收集细胞，通过小鼠尾静脉注射（IV) 5X 106个T细胞。星号 (*)表示该实验组与其它组比较，P〈〇.〇〇l;其中C3组与C2组比较(**)，C3组的存活天数显著 延长，有统计学意义，P〈〇. 05。
【具体实施方式】
[0016] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种结构新颖的、具有高效杀伤肿 瘤细胞活性且毒副作用很小的IL-12融合蛋白。该IL-12/CD107a或IL-12/缺失分泌肽的 CD107a融合蛋白通过基因修饰抗肿瘤T细胞后，IL-12存在于细胞浆的溶酶体内，细胞膜表 面不能检测到表达。实验表明，当本发明融合蛋白在T细胞中表达后，只有在抗肿瘤CTL识别 杀伤肿瘤时会瞬时有效展示在T细胞的表面。出乎意料的是，该IL-12/缺失分泌肽CD107a融 合蛋白系列对T细胞的活力(viability)基本无影响，并且携带本发明融合蛋白的抗肿瘤T 细胞在接近肿瘤细胞时，IL-12才会瞬时表达在细胞膜表面，导致位于细胞膜表面IL-12更 有效而安全地作用于肿瘤细胞。在本发明中，通过T细胞攻击肿瘤的局部并通过细胞表面瞬 时迀移的IL-12改变T细胞-肿瘤组织的免疫微环境，从而协同而有效地实现抗肿瘤免疫效 果的最大化，同时极其显著地降低IL-12的毒副作用。在此基础上完成了本发明。
[0017] 具体地，本发明人利用通过CD107a表达IL-12,开发了一种IL12/缺失分泌CD107a 的全新的融合蛋白，并通过慢病毒基因修饰抗肿瘤T细胞。实验数据，显示IL12/缺失分泌肽 CD107a慢病毒基因修饰抗肿瘤T细胞后，在抗肿瘤CTL识别肿瘤时瞬时表达于T细胞表面，对 肿瘤抗原的反应表现出增强免疫反应的效应。临床前荷瘤鼠模型显示，该方案修饰的T细胞 可以显著延长荷瘤小鼠的生存期，没有发现明显的细胞毒效应。换言之，瞬时膜表达所述融 合蛋白的T细胞一方面可有效地杀灭肿瘤细胞，另一方面经证实具有体内外的安全性。此 外，所述经修饰的T细胞自身似乎仅受到所表达IL-12轻微的不利影响或基本上不受其影响 (与持续分泌IL-12的T细胞比较，本发明融合蛋白对T细胞的体外扩增无明显影响）。
[0018] 术语
[0019]如本文所用，术语"头部"指多肽或其片段的N端，尤其是野生型多肽或其片段的N 端。
[0020] 如本文所用，术语"尾部"指多肽或其片段的C端，尤其是野生型多肽或其片段的C 端。
[0021] 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……构成"、 "基本上由……构成"、和"由……构成"；"主要由……构成"、"基本上由……构成"和 "由……构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0022] ⑶107a又称为LAMP1，是一种表达于溶酶体上的跨膜蛋白，它的N-端位于溶酶体腔 囊一侧，（Eskelinen 2006)C-端是一小段肽段，朝向胞楽;一侧，当抗肿瘤T细胞在识别肿瘤 抗原时，溶酶体与T细胞膜融合而发生T细胞或NK细胞的脱颗粒效应，即T细胞或NK细胞释放 效应分子颗粒酶(Granzyme B)及穿孔素(perforin)而达到杀伤肿瘤细胞的过程。在T细胞 与肿瘤细胞发生反应的时，CD107a迀移到T细胞膜上的特性已经被广泛地应用于反应T细胞 杀伤功能的一个指标。
[0023]