(perforin)而达到杀伤肿瘤细胞的过程。在T细胞与肿瘤 细胞发生反应的时，CD107a迀移到T细胞膜上的特性已经被广泛地应用于反应T细胞杀伤功 能的一个指标。
[0120]虽然IL-12具有显著的抑瘤效果，但是由于其系统性全身给药会引起全身性毒副 反应，因而受到极大的限制。在本发明之前，IL-12的临床应用由于其所诱导的全身性毒副 作用，以及早期临床试验通过全身系统性给药引起的两例患者的意外死亡，使其临床应用 受到大大的限制。
[0121 ]为了避免全身性给药的毒副作用从而实现临床应用的目的，临床科研工作者们通 过肿瘤局部注射、瞬时表达及多点注射等途径应用于肿瘤的临床试验，但是由于IL-12的治 疗效果同回输的IL-12的剂量直接相关，上述局部的临床方案并未有取得显著的抑瘤效果。
[0122] 本发明为了解决IL-12系统性分泌而导致的系统性细胞毒性，通过构建IL-12/ ⑶107a融合蛋白系列的策略，通过⑶107a膜迀移从而实现IL-12的肿瘤抗原反应性的瞬时 膜迀移的技术难题，不但可以增强抗肿瘤反应，对抗肿瘤T细胞的体外扩增亦无影响，是一 种有广泛应用前景的抗肿瘤策略，在肿瘤的免疫细胞的治疗中将发挥重要的作用。
[0123] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
[0124] 参考文献
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【主权项】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件： (i) 任选的位于N端的信号肽和/或前导肽； (ii) 第一蛋白元件； (iii) 第二蛋白元件；以及 (i v)任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的连接肽元件； 其中，所述信号肽可操作地连于由和(iv)所构成的融合元件； 并且第一蛋白元件为IL-12蛋白元件;第二蛋白元件为⑶107a蛋白元件； 在另一优选例中，所述的CD107a是去掉CD107a分泌肽的CD107a成熟的蛋白元件； 在另一优选例中，所述的"可操作地连于"指所述信号肽可引导所述融合元件的表达或 跨膜转移(定位）； 在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构： (1) 式la所述结构： D~A-B (Ia)，或 (2) 式Ila所述结构： D_A_C_B (Π a)， 其中， A为IL-12蛋白元件； B为CD107a或CD107a成熟蛋白元件； C为任选的连接肽元件； D为任选的信号肽信号肽和/或前导肽序列； 表示连接上述元件的肽键或肽接头； 在另一优选例中，所述的连接肽元件包括序列如SEQ ID NO.: 12所示的连接肽； 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白来源于人或非人哺乳动物； 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括野生型和突变型； 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括全长的、成熟形式的IL-12,或其活性片段； 在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括IL-12蛋白的一个或两个亚基； 在另一优选例中，所述的IL-12蛋白的亚基选自下组:P40和P35亚基； 在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括连接在一起的IL-12蛋白P40和P35亚基； 在另一优选例中，所述的P40和P35亚基为"头-头"、"头-尾"、"尾-尾"相连； 在另一优选例中，所述的P40和P35亚基之间存在或不存在接头(linker); 较佳地，所述的接头为柔性的4-20个氨基酸的接头，更佳地，所述的接头为GGGGGGS (GeS)(SEQ ID NO.:14)； 在另一优选例中，所述的IL12蛋白元件的序列如SEQ ID NO. :6所示； 在另一优选例中，所述的成熟CD107a蛋白元件中缺少了分泌肽； 在另一优选例中，所述的CD107a蛋白来源于人或非人哺乳动物； 在另一优选例中，所述的CD107a蛋白包括全长的、成熟形式的CD107a，或其活性片段； 在另一优选例中，所述的⑶l〇7a蛋白元件的序列如SEQ ID NO. :8所示； 在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0-15个氨基酸，较佳地1-10个氨基酸； 在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肽元件D; 在另一优选例中，所述的融合蛋白中，在单链IL-12(第一蛋白元件)和CD107a(第二蛋 白元件)之间设有连接肽，优选SGSG序列（SEQ ID N0.:12); 在另一优选例中，所述的融合蛋白中，第一蛋白元件为单链IL-12,在所述单链IL-12 中，在P40亚基及P35亚基设有连接肽G6S(SEQ ID N0.:14); 在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. :2所示； 在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下多种特征： a) 所述融合蛋白CD107a去掉了分泌肽； b) 所述融合蛋白包含IL-12的两条亚基，即P40和P35亚基，并由GGGGGGS(G6S)连接； 在另一优选例中，所述的融合蛋白为单体、或二聚体。2. -种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋 白； 在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO.: 1所示。3. -种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸； 在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体； 在另一优选例中，所述的病毒载体包括:慢病毒载体、腺病毒载体、黄热病毒载体； 在另一优选例中，所述的载体包括表达载体。4. 一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要 求2所述的多核苷酸； 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞； 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞； 在另一优选例中，所述的宿主细胞包括免疫细胞，较佳地T细胞、NK细胞。5. -种产生权利要求1所述的蛋白的方法，它包括步骤： (1) 在适合表达的条件下，培养本发明权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出权利要 求1所述的融合蛋白；和 (2) 任选地分离所述融合蛋白。6. -种免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞在膜表面上携带权利要求1所述的融合 蛋白； 在另一优选例中，所述的免疫细胞为至少1〇3个(较佳地1〇3_1〇9个，更佳地较佳地1〇 4-1〇8个)所述免疫细胞的细胞群； 在另一优选例中，至少一部分或全部所述的融合蛋白位于所述免疫细胞的细胞膜上， 并且所述的第一蛋白元件即IL-12蛋白元件位于胞外； 在另一优选例中，所述的免疫细胞包括T细胞； 在另一优选例中，所述的T细胞表面携带MART-1 TCR。7. -种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包含:权利要求6所述的免疫细胞，以及 药学上可接受的载体； 在另一优选例中，所述的药物组合物为液态； 在另一优选例中，所述的药物组合物含有1 X 1〇3_1 X 1〇7个所述的免疫细胞/mL。8. -种如权利要求1所述的融合蛋白和/或权利要求6所述的免疫细胞的用途，其特征 在于，用于制备治疗肿瘤的药物； 在另一优选例中，所述肿瘤包括:脑肿瘤、大肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝癌肿瘤、乳腺癌肿 瘤、胃癌肿瘤、胰腺癌肿瘤。9. 一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，包括步骤:给需要的对象施用权利要求1所述的 融合蛋白和/或权利要求6所述的免疫细胞； 在另一优选例中，所述的融合蛋白以单体和/或二聚体形式施用； 在另一优选例中，所述的对象是人。10. -种治疗性的体外杀灭肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括步骤:将权利要求6所述 的免疫细胞与肿瘤细胞进行接触，从而杀灭所述肿瘤细胞。
【专利摘要】本发明提供高效低毒的肿瘤治疗剂及其制法和用途。具体地，本发明提供了一种IL-12/CD107a融合蛋白。在本发明中，通过利用含IL-12/CD107a融合基因的慢病毒修饰抗肿瘤T细胞。CD107a在溶酶体与细胞膜融合的同时可以迁移到细胞膜的表面，把IL-12带到细胞膜上，从而实现肿瘤细胞膜表面IL-12的释放。实验表明，在本发明中，可在T细胞攻击肿瘤的局部实现定点和定时释放IL-12，从而改变T细胞-肿瘤组织的免疫微环境，进而实现抗肿瘤免疫效果的最大化，并显著降低毒副作用。
【IPC分类】C12N5/10, A61P35/00, C12N15/62, A61K38/20, A61K38/17, C07K19/00, A61K48/00
【公开号】CN105622759
【申请号】CN201610004707
【发明人】杨世成
【申请人】深圳精准医疗科技有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年1月4日