一种新型乙型肝炎动物模型的建立方法与用途
【专利摘要】本发明涉及转染HBV基因的HepG2.2.15细胞分泌的病毒液诱发的乙型肝炎动物模型的制备方法，特别是一种易于获得和调控的诱导剂及简单的操作程序，产生与人类疾病更具有相似性的乙型肝炎疾病模型及其在乙肝发病机制研究和抗肝炎药物评价中的应用。
【专利说明】一种新型乙型肝炎动物模型的建立方法与用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种动物疾病模型的制备方法，特别是一种简单的诱导剂及简单的操作程序，产生与人类疾病更具有相似性的乙型肝炎疾病模型及其在乙肝发病机制研究和抗肝炎药物评价中的应用。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)感染是严重的公共健康问题。我国是HBV感染高发流行区，约有7亿人曾经感染HBV，其中慢性感染人数高达1.2亿，占全球HBV感染总数的1/3左右。15%~35%的慢性乙肝患者因肝硬化、肝癌等终末期肝病而死亡。全球53%的肝癌与HBV感染密切相关。尽管HBV感染是肝癌发生的最主要病因，但HBV慢性感染机制至今仍未完全阐明。缺乏合适的HBV感染疾病模型是阻碍HBV基础研究进展的主要瓶颈，其根本原因在于HBV感染宿主的种属范围极窄，除人类之外，只有黑猩猩感染HBV模型得到公认，但因其为濒危珍稀动物而不适用于实验研究而受到限制。因此，建立方便有效的、与人类有较近亲缘关系的动物感染人HBV模型，是阐明HBV生物学特性、感染致病机理及建立有效防治措施所亟需。[0003]HBV是一种较为严格的嗜肝DNA病毒，其感染有高度的种属和组织特异性，由于病毒黏附以及DNA转录和复制对宿主有严格的要求，HBV只感染人类和类人猿。嗜肝DNA病毒科分为哺乳类和禽类两个属，前者包括人、毛猴、土拨鼠和地松鼠的嗜肝DNA病毒HBV、WMHBV.WHV和GSHV ;后者包括鸭和苍鹭的嗜肝DNA病毒DHBV和HHBV。HBV是嗜肝DNA病毒的原型，在基因组结构的相似性和基因序列的同源性等方面与本家族其他成员有程度不同的差别。多年来，鸭感染DHBV模型和土拨鼠感染WHV模型在探索HBV感染人体的机制和研发临床用药等方面做出了重要贡献，但将这两个动物模型的相关研究结果用于阐释人类感染HBV的相关事件，均尚存很明显的屏障。
[0004]树斷I (Tupaia belangeri)作为小型低等灵长类动物,与人类在生理机能、生化代谢和基因组等方面的相似性远高于小鼠、大鼠、土拨鼠等常用实验动物。世界卫生组织多年前就呼吁用树駒代替大型灵长类动物进行科学实验，我国近年来也已开始树駒资源的开发利用和标准化研究。国内外研究表明含HBV的乙肝患者血清确实可以感染树駒，但由于乙肝患者血清采集不方便且危险性高、难以标化，不利于模型的推广应用。而转染HBV的H印G2.2.15细胞是目前抗乙肝药物药效评价最常用的细胞模型，它不仅能支持HBV DNA复制，而且还能支持Dane样颗粒的包装和分泌，将该细胞培养上清静脉注射黑猩猩可致典型肝炎。因此，采用IfepG2.2.15细胞培养上清(含病毒颗粒)感染树駒，建立乙肝模型，具有感染源易于获得、建模方便、易于标化，且适于普通实验研究等优点，对乙肝感染机制的深入研究和抗乙肝药物的评价具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种新型的乙型肝炎动物模型，该模型建模方便，感染源易于获得，成模率高，易于标化和调控，为乙肝感染机制的研究和抗乙肝药物评价提供一种与人类疾病更具相似性的、稳定可靠的疾病模型。为此，本发明采取以下技术方案:
[0006]由于HBV感染宿主的种属范围极窄，除人类之外，只有黑猩猩感染HBV模型得到公认，但因其为濒危珍稀动物而不适用于实验研究而受到限制。目前研究常用的鸭感染DHBV模型和土拨鼠感染WHV模型的相关研究结果用于阐释人类感染HBV的相关事件，均尚存很明显的屏障。而本发明采用转染HBV的H印G2.2.15细胞培养上清(含病毒颗粒)感染树鼠句建立的乙型肝炎模型，由于感染源易于获得和调控，能更方便地模拟人类乙型肝炎。
[0007]一种用转染HBV的H印G2.2.15细胞分泌病毒液诱发，无需特殊装置，简单易行，成模率高的乙型肝炎动物模型的建立方法。具体制备方法如下:
[0008]以定量病毒载量的H印G2.2.15细胞培养上清液为感染源，经静脉注射感染3月龄树駒，每周注射I次，每只0.5毫升，共接种3次，即可诱发乙型肝炎。[0009]本发明与现有技术相比具有如下优点:(I)采用转染HBV的H印G2.2.15细胞分泌病毒液作为感染源，由于ifepG2.2.15细胞分泌病毒载量易于调控，能更方便地模拟乙型肝炎；(2)无需特殊装置，简单易行，成模率高，易于标化和调控；(3)与人类乙型肝炎具有良好的相关性；(4)适于肝炎发病机制研究和抗肝炎药物评价研究。
【具体实施方式】
[0010]实施例1:新型乙型肝炎模型的制备及评价
[0011]I准备以下材料:
[0012]1.1实验动物:树駒由中国科学院昆明动物研究所提供。
[0013]1.2HepG2.2.15细胞:由HBV基因转染H印G2肝癌细胞而来。
[0014]2制备方法按如下步骤:
[0015]2.1转染HBV的H印G2.2.15细胞，采用含10%胎牛血清、青霉素100IU/m及链霉素100 μ g/mL的DMEM培养基，在37°C、5% C02条件下常规培养，并用G418进行克隆筛选。吸取细胞培养上清液，离心分离和纯化HBV颗粒，采用荧光定量PCR方法测定HBV载量，制备接种病毒液。
[0016]2.2取3月龄树駒，以定量病毒载量的病毒液为感染源，经静脉注射途径感染，每周注射I次，每只0.5毫升，共接种3次，即可形成乙肝模型。
[0017]3评价方法按如下步骤:
[0018]3.1接种后定期采血作HBV感染标志物检测，用生化分析仪检测血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平；采用ELISA法检测血清HBV表面抗体和HBV核心抗体表达水平；采用荧光定量PCR方法检测血清HBV DNA载量。
[0019]3.2取肝组织，采用免疫组化方法检测HBV表面抗原(HBsAg)和HBV核心抗原(HBcAg)水平；采用原位分子杂交法检测HBV DNA水平。
[0020]3.3电镜下观察树駒血清中是否存在Dane氏颗粒及HBsAg颗粒。
【权利要求】
1.一种新型乙型肝炎动物模型的建立方法，包括模型的制作程序及模型评价标准，其特征在于采用一种简单的诱导剂及简单的操作程序，复制出稳定、可靠的乙型肝炎模型及其在乙肝感染机制研究和抗肝炎药物评价中的应用。
2.根据权利要求1所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的实验动物为树鼠句。
3.根据权利要求1所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的诱导剂为乙肝病毒基因转染的ifepG2.2.15细胞分泌的病毒颗粒。
4.根据权利要求1或2所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的感染途径为静脉注射。
5.根据权利要求1和3所述的新型乙型肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的诱导剂乙肝病毒基因转染的H印G2.2.15细胞不仅能支持乙肝病毒DNA复制且支持乙肝病毒颗粒的包装和分泌。
6.根据权利要求1所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的模型评价标准为小鼠转氨酶水平升高，乙肝病毒表面抗体和乙肝病毒DNA检测呈阳性，以及电镜检查出现Dane氏颗粒。
7.一种新型乙型肝炎模型的建立方法如权利要求1所述一种简单的诱导剂及简单的操作程序，复制出稳定可靠的乙型肝炎模型，其特征在于所述的模型制备方法为每周注射诱导剂I次，0.5毫升/只，共注射3次。
8.根据权利要求1所述的乙型肝炎模型的建立在乙肝感染机制研究和抗肝炎药物评价中的应用，其特征在于所诱 发的肝炎与人类乙型肝炎在病程特点和肝脏病理改变等方面具有良好的相关性。
【文档编号】A61K49/00GK103920166SQ201310014446
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月10日 优先权日:2013年1月10日
【发明者】伍义行, 张虹莉, 贾袁媛, 戴灵豪, 沈钰明 申请人:中国计量学院