经修饰的宿主细胞的建立方法
【专利说明】经修饰的宿主细胞的建立方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及使用培养动物细胞的重组蛋白质的制造，更具体而言涉及建立如可有 效制造目的蛋白质的宿主细胞的技术。 【【背景技术】】
[0002] 使用基因重组技术生产作为医药有用的蛋白质时，使用动物细胞，则由于原核细 胞实现不了的复杂的翻译后修饰或折叠变得可能，从而动物细胞作为用于重组蛋白质生产 的宿主细胞而多用。
[0003] 近年、抗体或生理活性蛋白质等的多种生物药品辈出，但在动物细胞中有效生产 重组蛋白质的技术与生物药品的低成本化连系，约束向患者的稳定的供给。
[0004] 从而，期望生产效率更高的蛋白质的制造方法。
[0005] 知通过向宿主细胞，除目的蛋白质的基因之外，导入其他结构基因而使以高的表 达量表达，从而使目的蛋白质的生产效率升高的技术。
[0006] 例如，公开有包括培养高表达作为膜输送蛋白质的牛磺酸转运子（TauT)基 因、并且导入编码希望得到的蛋白质的DNA的细胞的蛋白质的制造方法（专利文献1 : W02007/119774、专利文献 2 :W02009/051109)。
[0007] 另外公开有，通过使用导入作为牛磺酸合成途径的酶的半胱氨酸亚磺酸脱羧酶 (CSAD)基因的细胞来增加希望得到的蛋白质的生产量（专利文献3 :W02008/114673)。
[0008] 另外公开有，通过使用导入丙氨酸氨基转移酶（ALT)基因的细胞而使希望得到的 蛋白质的生产量增加（专利文献4 :W02009/020144)。丙氨酸氨基转移酶是使从丙氨酸生 成谷氨酸的酶，也被知为人肝细胞中含的酶GTP (谷氨酰胺-丙酮酸转氨酶）。
[0009] 另外公开有，通过使用导入有碳酸氢根转运子功能的阴离子交换剂（AE)的基因 的细胞而使希望得到的蛋白质的生产量增加（专利文献5 :W02009/054433)。
[0010] 再公开有，CSAD和TauT的共表达、ALT和TauT的共表达、碳酸氢根转运子和CSAD、 或者碳酸氢根转运子和ALT的共表达结果，更加增加希望得到的蛋白质的生产量（专利文 献 3-5)〇
[0011] 但是，本发明人，从至今的研宄发现，向宿主细胞导入2种外来基因时，即使是名 自单独导入则可建立该基因稳定地表达的细胞株的情况，也有无法建立使所述2种外来基 因一同稳定地高表达的细胞株的情况。此时，与至少一方的所述外来基因相同的基因或对 应基因的在宿主细胞的表达量用qPCR在检测限界以下时，导致无法建立使2种基因一同稳 定地高表达的细胞株。特别是，有相同的功能的蛋白质的基因或与相同的代谢系统反应相 关的酶的基因、例如，使2种膜输送蛋白质一同高表达的宿主细胞或使2种酶一同高表达的 宿主细胞的建立是不可能的。另外，GlycArt公司的2种糖链关联酶基因在宿主细胞中表 达，但再使高表达的宿主细胞来源的抗体产生细胞由于酶基因表达不稳定，见到抗体的无 岩藻糖基含量脱离期待的范围的事例。
[0012] 如此，使不同的2种以上的基因高表达伴随多个困难。
[0013] 【现有技术文献】
[0014] 【专利文献】
[0015] 专利文献 I :TO2007/119774
[0016] 专利文献 2 :W02009/051109
[0017] 专利文献 3 :W02008/114673
[0018] 专利文献 4 :W〇2〇〇9/〇2〇144
[0019] 专利文献 5 :W02009/054433 【
【发明内容】
】
[0020] 【发明要解决的技术课题】
[0021] 本发明提供在重组蛋白质生产中使用的宿主细胞中，用于使表达困难的基因稳定 地高表达的新颖的技术。另外，也提供建立倍增时间短、稳定增殖的细胞株的技术。
[0022] 【解决课题的技术方案】
[0023] 本发明人的研宄组以前发现了，作为不编码蛋白质的核酸序列，通过在宿主细 胞内作为RNA表达，控制NfkBia(核因子κ B抑制剂α、或者Ι-κ B(抑制剂-K B)) 的表达，有使重组抗体等的蛋白质的产生能力升高的功能的特定的核酸序列（PCT/ JP2012/058577 (W02012/137683))。本发明人将有那样的功能的RNA或DNA或它们的序列 总称而命名为APES (抗体产生增强序列）（根据情况，也称为PPES (多肽产生增强序列））。
[0024] APES被认为是，经NfkBia (或者I- κ B)的表达抑制而活化NF- κ ( κ ) B的功能性 核酸。另外，作为有这样的功能的核酸，也知KSHV miRNA-Kl等（Lei，Xiufen et al.，Nat. Cell. Biol.，12(2)，pl93-199, 2010)。
[0025] 这次，本发明人发现了 APES的新的用途。
[0026] 即，本发明人发现，APES使（1)在通常的细胞中使表达困难的特定的基因高表达 的细胞的构建，或（2)在通常的细胞中建立困难的使不同的2种以上的基因稳定地高表达 的细胞的构建成为可能，具有使导入基因稳定地高表达的功能。
[0027] 从而，本申请提供通过将APES基因导入宿主细胞，使表达困难的外来基因或表达 不稳定的外来基因在所述细胞内稳定地高表达的方法。
[0028] 另外，本申请提供，通过向宿主细胞导入APES基因，建立倍增时间快，稳定增殖的 细胞的方法。
[0029] APES基因是编码抑制NfkBia的表达的非编码RNA(不翻译成蛋白质的RNA)的 DNA0
[0030] 本申请发明的要点如下。
[0031] (1)建立可使2个以上的外来基因稳定地表达的用于重组蛋白质生产的细胞株的 方法，其包括：向细胞导入抑制NfkBia的表达的非编码RNA的基因，使该基因表达。
[0032] (2)⑴的方法，其中2个以上的外来基因编码同时稳定地表达困难的蛋白质。
[0033] (3) (2)的方法，其特征在于，同时稳定地表达困难的蛋白质均属于有类似的功能 的蛋白质。
[0034] (4) (3)的方法，其中有类似的功能的蛋白质是转运子或代谢酶。
[0035] (5) (1)~（4)的方法，其中向细胞导入2种以上的转运子（TauT和AE1)的基因。
[0036] (6)⑴~（4)的方法，其中向细胞导入2种以上的代谢酶（丙酮酸代谢途径的酶、 ALTl和PC)的基因。
[0037] (7) (1)~（4)的方法，其中向细胞导入TauT及2种代谢酶的基因。
[0038] (8)构建倍增时间快的细胞的方法，其包括：向细胞导入含抑制NfkBia的表达的 非编码RNA的基因的DNA构建物，使该非编码RNA在细胞内表达。
[0039] (9)细胞，其中向细胞导入抑制NfkBia的表达的非编码RNA的基因，使该基因表 达，并且，使2个以上的外来基因稳定地表达。
[0040] (10) (1)~⑶的方法或者（9)的细胞，其中抑制NfkBia的表达的非编码RNA是 含可由碱基对形成结合于NfkBia的mRNA的一部分的19~25碱基长的连续的序列的至30 个碱基长的低分子RNA。
[0041] (11) (1)~⑶的方法、或者（9)的细胞，其中抑制NfkBia的表达的非编码RNA 是含可由碱基对形成结合于NfkBia的mRNA的一部分的19~25碱基长的连续的序列的至 561碱基长的mRNA型非编码RNA。
[0042] (12) (1)~⑶的方法、或者（9)的细胞，其中抑制NfkBia的表达的非编码RNA 是含可由碱基对形成结合于NfkBia的mRNA的一部分的19~25碱基长的连续的序列的 561~1579碱基长的mRNA型非编码RNA。
[0043] (13) (10)~（12)的方法或细胞，其中19~25个碱基长的连续的序列是SEQ ID NO:2所示的碱基序列中的任意的部分序列或其互补序列。
[0044] (14) (1)~⑶的方法、或者（9)的细胞，其中抑制NfkBia的表达的非编码RNA的 基因是有SEQ ID NO: 1~16及29之任一个的碱基序列。
[0045] (15) (1)~⑶的方法、或者（9)的细胞，其中抑制NfkBia的表达的非编码RNA的 基因是有以下的喊基序列或其互补序列的DNA :
[0046] (a)可由碱基对形成结合于SEQ ID NO: 1~16及29之任一个的碱基序列的序列；
[0047] (b)与SEQ ID NO: 1~16及29之任一个的碱基序列除1或数碱基外相同的碱基 序列；
[0048] (c)含SEQ ID NO: 1~16及29之任一个的碱基序列的，NfkBia基因的3'侧非翻 译区域的部分序列；
[0049] (d)与上述（c)的序列除1或数碱基外相同的碱基序列。
[0050] (16) (1)~⑶的方法或（9)的细胞，其中向细胞再导入有希望得到的蛋白质的基 因。
[0051] (17) (16)的方法或细胞，其中希望得到的蛋白质是抗体。
[0052] (18)上述（1)所述的建立可使2个以上的外来基因稳定地表达的用于重组蛋白质 生产的细胞株的方法，其包括：
[0053] 向细胞导入第1外来基因及抑制NfkBia的表达的非编码RNA的基因，使这些基因 表达，及
[0054] 向细胞导入与第1外来基因同时稳定地表达困难的第2外来基因，
[0055] 其中
[0056] 第1和第2外来基因是编码蛋白质的基因，
[0057] 建立表达抑制NfkBia的表达的非编码RNA的基因、及编码蛋白质的第1和第2外 来基因的重组蛋白质生产用的细胞株。
[0058] (19)上述（1)所述的可建立使2个以上的外来基因稳定地表达的用于重组蛋白质 生产的细胞株的方法，其包括：
[0059] 向细胞导入第1外来基因及抑制NfkBia的表达的非编码RNA的基因，使这些基因 表达，
[0060] 向细胞导入第2外来基因，及
[0061] 向细胞导入与第2外来基因同时稳定地表达困难的第3外来基因，
[0062] 其中
[0063] 第1、第2、及第3外来基因是编码蛋白质的基因，
[0064] 建立表达抑制NfkBia的表达的非编码RNA的基因、及编码蛋白质的第1、第2、第 3外来基因的重组蛋白质生产用的细胞株。
[0065] (20) (18)或（19)所述的方法，其中第1外来基因是TAUT (牛磺酸转运子）基因。
[0066] (21) (18)~（20)之任一项所述的方法，其中向细胞再导入希望得到的蛋白质的 基因，建立所述希望得到的蛋白质的生产用的宿主细胞株。
[0067] 【发明效果】
[0068] 由本发明可在宿主细胞中使各种的外来基因稳定地高表达。从而，利用本发明，可 将在通常的细胞中表达困难的多肽制造成药品。另外，提高表达困难的抗原蛋白质的表达 量，对那样的抗原的抗体的开发变得容易。另外，由本发明可构建使多个基因稳定地高表达 的细胞，从而重组多个有用基因的，用于产生重组蛋白质的宿主细胞的制作变得可能。
[0069] 另外，由本发明的别的实施方式，可建立倍增时间快、稳定增殖的细胞。从而，在使 用培养动物细胞的重组蛋白质的生产中，将那样的细胞作为宿主利用，则可有效生产目的 蛋白质。 【【附图说明】】
[0070] 【图1】图1示鉴定的AI462015转录产物的在序列及小鼠基因组的位置。（参考例 D
[0071] 【图2】图2示在CH0-DG44细胞中使Mabl (抗IL-6受体抗体）高表达的产生抗体 的细胞的继代培养第3天的AI462015转录产物的表达强度。（参考例2)
[0072] 【图3】图3示在CHO-DXBlls细胞中使Mab2(抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体）高 表达的产生抗体的细胞的继代培养第3天的AI462015转录产物的表达强度。（参考例2)
[0073] 【图4】图4示在Mab2 (抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体）产生细胞的IL罐流加培 养第3天的AI462015转录产物的表达强度。（参考例2)
[0074] 【图5】图5示在产生Mab2的细胞的IL罐的流加培养后期第13天的AI462015转 录产物的表达强度之上调。（参考例2)
[0075] 【图6】图6示在Mabl (抗IL-6受体抗体）产生潜力低的细胞的IL罐流加培养第 3天的AI462015转录产物的表达强度。（参考例2)
[0076] 【图7】图7是转录产物AI462015(437p)之一部分序列434bp的表达质粒。（参考 例3)
[0077] 【图8】图8是转录产物AI462015(437p)之一部分序列165bp的表达质粒。（参考 例3)
[0078] 【图9】图9是作为对照仅使潮霉素抗性基因表达的质粒。（参考例3)
[0079] 【图10】图10示由转录产物AI462015(437p)的一部分序列的强表达而增加 Mabl 产生量。（参考例3)
[0080] 【图11】图11示在抗体高产生细胞的转录产物AI462015的强表达和NfkBia表达 抑制。（参考例4)
[0081] 【图12】图12示NfkBia表达定量中使用的探针组。（参考例4)
[0082] 【图13】图13示在抗体高产生细胞的NfkBia表达抑制的定量结果。（参考例4)
[0083] 【图14】图14示小鼠 MCMV IE2启动子上（SEQ ID NO:23)的8个的NfkB结合部 位（加下划线部）。（参考例4)
[0084]【图15】图15是表达microRNA的解析法的概略。（参考例5)
[0085] 【图16】图16示在抗体高产生细胞中高表达的microRNA来源的PCR产物。（参考 例5)
[0086] 【图17】图17是在表达pHyg-TAUT的细胞中使转录产物AI642048 (437p)的一部