用于定量检测生物医药制品中残留cho宿主细胞蛋白的elisa试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及用于定量检测生物医药制品中残留CH0宿 主细胞蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地 位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞 (ChineseHamsterOvary，CH0)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。该细胞 具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用 于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种（乙肝疫苗）是 由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CH0细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有 活性的二聚体（如白介素2)，也不具有糖基化的功能（如EP0)，而CH0却具有如上的功能， 因此CH0成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个 优点，该细胞属于成纤维细胞（fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CH0内 源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。
[0003] 虽然，CH0分泌的内源蛋白很少但是依然会有少量蛋白残留在生物制品的半成品 或成品中。人们将由CH0细胞产生或编码的，但与重组蛋白无关的一类蛋白质残留物称作 宿主细胞蛋白（HostCellProtein，HCP)。使用遗传修饰过的CH0细胞系来生产蛋白药物 的企业都会受到生产过程相关的杂质的污染。CHOHCP可能会存在于生产过程的每一个环 节。常规的分析方法可以较好的对生物医药产品进行精确的定量。但是对于产品或半成品 中残留的HCP即宿主细胞蛋白来说，即使经过多道纯化工艺，依然会有残留。作为药物使用 的蛋白制剂，安全是第一位的。残留在成品中的CHOHCP可能会引起免疫应答，甚至给病人 带来病理反应。同时残留的HCP也有可能会降低蛋白药物的效果。因此，生物医药企业在 质控环节必须对生产的半成品或成品的HCP进行定量测定。
[0004] 目前，用于HCP测定的方法主要有：SDS-PAGE(银染），HPLC(高效液相色谱）， WesternBlot以及Immunoassay。这四种方法各有优略。SDS-PAGE可以检测到100pg/ band的HCP含量，灵敏度较高，但是主观性较强，仅能进行定性的检测，操作繁琐复杂，且 容易受到实验条件的限制。HPLC分辨率高，能进行定量检测，但是其灵敏度低，缺乏特异 性。WesternBlot仅能对残留的HCP进行定性测定，有时甚至不能检测到特异性的HCP。 Immunoassay可以检测到lng/ml以下的HCP，能对生物医药半成品或成品进行半定量分析， 且可以实现高通量检测。
[0005] 对于生物医药制品中HCP的检测，2010版《中国药典》规定的检测方法是双抗夹 心ELISA法。截至目前，《中国药典》仅对残留的大肠杆菌和Vero细胞HCP有明确的规定检 测方法，对CH0细胞残留的宿主细胞的检测没有明文的规定。中华人民共和国境内也没有 相关专利的报道。因此，开发CHOHCP的检测既能填补该领域的空白，也能为以后制定检测 CHOHCP的行业标准方法奠定基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种用于定量检测生物医药制品中残 留CH0宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 用于定量检测生物医药制品中残留CH0宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒，其特征在 于，该ELISA试剂盒包括：
[0009] 包被有GoatantiCHOHCP抗体的ELISA微孔板；
[0010] CH0HCP抗原液；
[0011] 羊抗CHOHCP辣根过氧化酶标记的抗体贮存液；
[0012] ELISA专用洗液100倍浓缩液；
[0013] ELISA专用稀释液；
[0014] ELISA显色底物A液和B液；
[0015] 终止液。
[0016] 所述CHOHCP抗原液是由CHO-S，CH0-K1和CH0-DHFR三类CH0细胞的HCP组成。
[0017] 使用ELISA试剂盒定量检测生物医药制品中残留CH0宿主细胞蛋白的方法，其包 括如下步骤：
[0018] 步骤一，向包被有羊抗CHOHCP抗体的平底微孔板加入CHOHCP抗原的样本溶液， 并洗涤；
[0019] 步骤二，向洗涤后的酶标板中加入HRP抗CHOHCP抗体溶液，再次洗涤；
[0020] 步骤三，向再次洗涤后的酶标板中加入显色剂显色，然后加入终止液反应，测定 450mm下的吸光度制；
[0021] 步骤四，根据标准曲线得到所述样本溶液中CHOHCP抗原的含量。
[0022] 其中，羊抗CHOHCP抗体溶液的浓度为0. 5-2mg/L。
[0023] 其中，样本溶液中CHOHCP抗原的浓度为0_400g/L。
[0024] 其中，羊HRP抗CHOHCP抗体溶液的浓度为0. 05-1.Omg/L。
[0025] 本发明首先制备CHOHCP蛋白，蛋白电泳后，确认蛋白条带与预期的一致，然后用 HCP蛋白免疫山羊，制备多克隆抗体。用ELISA的方法对CHOHCP进行检测，条件优化完毕 后，用一系列蛋白样本进行验证检测。最后本发明提供了一种定量检测生物医药制品中残 留的CHOHCP蛋白的方法及ELISA检测试剂盒。
[0026] 本发明具有如下有益效果：
[0027] 本发明利用含有特异性的CHOHCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品 中残留的CHOHCP蛋白，检测时间短，检测效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏 度高（能达到0. 3ng/ml)，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低。
【附图说明】
[0028] 图 1 为CHOHCPELISA标准曲线。
[0029]图2为CHOHCP蛋白凝胶电泳图。
[0030] 图3为实施例1中CHOHCPELISA标准曲线。
[0031] 图4为实施例2中CHOHCPELISA标准曲线。
[0032] 图5为实施例3中CHOHCPELISA试剂盒标准曲线。
【具体实施方式】
[0033] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体实施例，进一步阐述本发明。
[0034]在图1，图3-5中，横坐标是CHO HCP标准品浓度，纵坐标是吸光度0D值。
[0035] 用于定量检测生物医药制品中残留CH0宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒，其包括： 包被有GoatantiCHOHCP抗体的ELISA微孔板、CHOHCP抗原液、羊抗CHOHCP辣根过氧 化酶标记的抗体贮存液、ELISA专用洗液100倍浓缩液、ELISA专用稀释液、ELISA显色底物 A液和B液、终止液。
[0036] 其中，CHOHCP抗原的制备方法包括如下步骤：
[0037] 1.CH0细胞培养：
[0038] 1. 1CH0 的复苏
[0039] ⑴预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37°C水浴锅内 预热。
[0040] ⑵取保存的安倍瓶迅速加入37度水浴锅中，不断摇动，保证lmin内解冻。
[0041] ⑶在超净台中加入37度预热的CH0无血清无蛋白培养基9mL至离心管中，同时加 入细胞冷冻液，800rpm离心5min。
[0042] ⑷弃上清，加入37度预热的CHO无血清无蛋白培养基，放入细胞培养板中 36. 5°C5 %二氧化碳培养箱中过夜。
[0043] ⑶第二天进行换液。
[0044]1. 2细胞的冻存
[0045] ⑴取出培养瓶，用移液枪将瓶中旧培养基吹打，吸至离心管内。1000rpm*10min离 心，离心后弃上清，加入新鲜培养基吹散沉淀。
[0046] ⑵取50y1细胞悬浮液与50y1trypanblue等体积混合均勾于1. 5ml小离心管 中。
[0047] ⑶取少许混合液（约15y1)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片， 于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。计数四个大方格之细胞总 数，再除4,乘以稀释倍数（至少乘以2,因与trypanblue等体积混合），最后乘以104,即为 每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞（或计下线与左线 之细胞）。
[0048] ⑷计数板计数，用新鲜完全培养基调节细胞浓度为5-10X106胞/ml。再离心，弃 上清。用预冷的冻存液重悬细胞，每个冻存管内加入lml重悬细胞液。放4°冰箱5min， 放-20° 30min，再放-80°过夜。
[0049] ⑶第二天将细胞置于液氮中。
[0050] 1. 3细胞的扩大培养
[0051] ⑴用移液器将细胞培养板中旧培养基吹打，吸至离心管内。800rpm*5min离心，离 心后弃上清，加入新鲜培养基吹散沉淀。加入一次性细胞培养瓶中，放入36. 5°C5%二氧化 碳培养箱中震荡培养两天。
[0052] ⑵CH0细胞培养震荡两天后，用移液器将细胞吹匀吸入离心管中，800rpm*5min离 心，离心后收集上清，沉淀中加入新的培养基将CH0细胞重悬，按照1:2的比例传代细胞培 养。
[0053] 2?蛋白提取
[0054] 2. 1CHOHCP提取
[0055] ⑴收集细胞扩大培养中离心后的上清，将收集的上清通过0.Sum的滤膜过滤。
[0056]⑵收集的滤液，吸入浓缩超滤离心管中（3K)，4°C，lOOOOrpm离心，30min。收集浓 缩液。
[0057] 2. 2蛋白浓度的检测
[0058] ⑴标准曲线的绘制，将标准品稀释成100ug，200ug，400ug，600ug，800ug，lOOOug 的稀释样本，稀释的样本加上空白对照与考马斯亮蓝染色1 :5比例混合，充分混合后，室温 下反应3-5min，595nm波长下检测。绘制标准曲线。
[0059] 将标准品按照以下倍数