一种检测胰腺癌相关多肽dap44的elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一对经抗体配对实验筛选的胰腺癌相关多肽 DTNBPlAssociatedPeptide44 (DAP44)单克隆抗体，及上述单克隆抗体制备的ELISA检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 胰腺位于上腹部，属腹膜后器官，解剖位置隐蔽，周围紧邻胃、十二指肠、肝、脾、肾 等重要器官。胰腺癌起病隐匿，缺少典型的早期临床症状，早期便直接向胰周侵犯或经淋巴 管和/或血管向远近器官组织转移。因此，大部分胰腺癌患者确诊时已为晚期，失去了根治 性手术切除和放射治疗的胰腺癌的机会。当前，我国胰腺癌的发病率正以惊人的速度持续 上升。研究证实，胰腺癌的早期诊断是提高胰腺癌病人治疗效果和生存率的关键所在。而 肿瘤标志物是目前用于胰腺癌临床筛查和预测的主要依据。但目前能用于胰腺癌特异性诊 断的肿瘤标志物尚不多，其中最常用的是CA19-9,但本身也存在假阳性和假阴性等局限，对 直径<2cm的小胰腺癌诊断阳性率仅为30 %-40 %，而进展期可达80 %-90 %。因此，筛选 新的胰腺癌特异性肿瘤标志物并应用于临床检测具有重要的意义。
[0003] 本研究前期收集了胰腺癌病人术前术后血清，经高效色谱分选和蛋白质谱检 测，发现了一种胰腺癌相关糖蛋白，在胰腺癌病人术前血清中高表达而术后血清中表达 下降，经测序确定其氨基酸序列与DTNBP1高度同源，命名为DTNBPlAssociatedP印tide 44(DAP44)，可能是一种胰腺癌相关的肿瘤标志物。同时设计并制备了DAP44单克隆抗体， 经抗体配对实验筛选了两株特异性强、敏感性高的单克隆抗体及杂交瘤细胞株。本研究在 前期基础上制备DAP44ELISA检测试剂盒，并应用于胰腺癌的临床检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测胰腺癌相关多肽DAP44的ELISA试剂盒，该ELISA 试剂盒对胰腺癌患者的检测具有很好的敏感性。
[0005] 本发明的技术方案是：一种检测胰腺癌相关多肽DAP44的ELISA试剂盒，包括：特 异性DAP44抗体包被的酶标板、酶标试剂、洗涤缓冲液、样品稀释液、显色剂A液、显色剂B 液、终止液、DAP44标准品和标准品稀释液。
[0006] 酶标板上的单克隆抗体由保藏号为CCTCCC201564的杂交瘤细胞所产生，酶标试 剂中的单克隆抗体由保藏号为CCTCCC201565的另一株杂交瘤细胞产生。
[0007] 酶标试剂包含5. 8g/L磷酸氢二钠、0? 593g/L磷酸二氢钠、8.Og/L氯化钠、200ml/L 小牛血清、0. 5ml/LProclin-300和0. 4mg/L辣根过氧化物酶标记的胰腺癌相关抗原DAP44 单克隆抗体。
[0008] 洗涤缓冲液（PH7. 4 0? 15MPBS) :KH2P040 . 2 克，Na2HP04 ? 12H20 2. 9 克，NaCl8. 0 克，KC1 0? 2 克，Tween- 200. 05% 0? 5ml，加蒸馏水至 1000ml。
[0009] 样品稀释液：牛血清白蛋白（BSA)O. 1克，加洗涤缓冲液至100ml或以羊血清、兔血 清等与洗涤液配成5~10%使用。
[0010] 显色剂A液为H202,显色剂B液为TMB。
[0011] 终止液为 2MH2S04。
[0012] DAP44ELISA试剂盒的制备方法：
[0013] (1)酶标板包被：用纯化的保藏号为CCTCCC201564的抗DAP44抗体包被96孔板 (12X8)酶标板，并封闭、抛光。
[0014] (2)酶标记抗体的制备：用辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP)标记 保藏号为CCTCCC201565的抗DAP44单克隆抗体；
[0015] DAP44ELISA试剂盒的使用方法：
[0016] (1)加入标准品和样本至相应的酶标板微孔中，使标准品或样本中的DAP44分子 与酶标板中的抗体充分结合，洗去未结合的杂质；
[0017] (2)加入酶标试剂，使已结合的DAP44与HRP标记的DAP44单克隆抗体结合，洗去 未结合酶标抗体；
[0018] (3)加入显色剂A、B液，充分混匀，终止液终止反应，酶标仪检测0D值。
[0019] 本发明利用前期合成和筛选的一对高效特异DAP44单克隆抗体，制备了ELISA检 测试剂盒。
[0020] 本发明采用双抗体夹心ELISA方法，在微孔条上预包被DAP44抗体，血清样本中的 DAP44结合固定在酶标板微孔表面的抗体，加入HRP偶联DAP44抗体后，形成抗体-抗原-酶 标抗体复合物，底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成 最终的蓝色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（0D值），将样本吸光值与标准曲线比较 即可得出相应DAP44的含量。
[0021 ] 本发明试剂盒具有高敏感性，有助于胰腺癌临床检测。
【附图说明】
[0022] 图1是采用本发明的试剂盒绘制的标准曲线。
[0023] 图2是采用本发明的试剂盒检测健康血清样本与胰腺癌血清中DAP44含量检测值 (ng/ml)
【具体实施方式】
[0024] 实施例1DAP44ELISA检测试剂盒的制备。、
[0025]1包被：用pH9. 5包被缓冲液稀释保藏号为CCTCCC201564纯化抗体（10ug/ml)， 包被96孔板，100y1/孔，4°C包被过夜。空白对照孔设4孔/板，加入包被液100y1。包 被液标准配方：Na2C03l. 59克，NaHC032. 93克，加蒸馏水至1000ml。
[0026] 2洗板：用自动洗板机洗板三次，5分钟/次，洗涤缓冲液（pH7. 4 0. 15MPBS): KH2P040 . 2 克，Na2HP04 ? 12H20 2. 9 克，NaCl8. 0 克，KC1 0? 2 克，Tween-20 0? 05% 0? 5ml，加 蒸馏水至l〇〇〇ml。
[0027] 3封闭：用1 %BSA封闭酶标板上没有结合上抗体的位点。200y1/孔，室温作用1 小时，洗板。
[0028] 4抗体的标记：（1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中；（2)于上液中加入0. 2ml新 配的0. 1MNaI04溶液，室温下避光搅拌20分钟；（3)将上述溶液装入透析袋中，对ImMpH 4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜；(4)加20y1 0. 2MpH9. 5碳酸盐缓冲液，使pH升高到 9. 0~9. 5,然后立即加入10mgIgG(抗体，或SPA5mg在lml0? 01M碳酸盐缓冲液中），室温 避光轻轻搅拌2小时。（5)加0.lml新配的4mg/mlNaBH4液，混匀，再置4°C2小时。（6) 将上述液装入透析袋中，对0. 15MpH7.4PBS透析