一种检测水产品中呋喃丹的Elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测呋喃丹残留量的试剂盒，特别是检测水产品中呋喃丹残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种酶免技术。
【背景技术】
[0002]呋喃丹是一种氨基甲酸酯类杀虫剂和杀线虫剂。1963年由美国创制，1967年推广。纯品为白色结晶，250C时水中溶解度为700ppm，在中性和酸性条件下较稳定，在碱性介质中不稳定，水解速度随PH值和温度的升高而加快。按中国农药毒性分级标准，呋喃丹高毒农药，不能用在蔬菜和果树上。呋喃丹对鸟类危害性最大，一只小鸟只要觅食一粒呋喃丹足以致命。受呋喃中毒致死的小鸟或其它昆虫，被猛禽类、小型兽类或爬行类动物觅食后，可引起二次中毒而致死。
[0003]呋喃丹的另一个环境行为特点是它在土壤中的残留期较长(降解半衰期为I?2个月)、在土壤中的移动性能较大(水溶解度为700mg/L)，在降水量大、地下水位浅的砂土地区易引起对地下水的污染，为此美国对呋喃丹使用作了一些地区性限制。危险特性:遇明火、高热可燃。受热分解放出有毒的氧化氮烟气。
[0004]本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与高效液相等仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，能最大限度地减少操作误差和工作强度。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的问题是提供一种小巧轻便的呋喃丹残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技木含量不高，可进行一次连续多个样品中呋喃丹残留量的测定，减少了检测样本所需要的时间。
[0006]本发明的技术方案是:一种检测水产品中呋喃丹残留量的酶联免疫试剂盒，试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔中预包被偶联抗原，样本中残留的呋喃丹和微孔中预包被的偶联抗原竞争抗呋喃丹抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所舍残留呋喃丹的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃丹的残留量。
[0007]本发明所提供的一种检测水产品中呋喃丹的ELTSA试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、14瓶试剂,其特征在于:酶标板是米用96孔试剂板作为固相载体,在试剂盒徼孔中预包被呋喃丹偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶呋喃丹标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。
[0008]还包括一张盖板膜和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，盒体是硬纸盒:96孔试剂板为聚苯乙烯酶标板，放于真空铝钼袋内:盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的白色PE塑料瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PB塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位共15个，由塑料泡沫制成。
[0009]酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被呋喃丹偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml /瓶；酶标二抗I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;显色液A液I瓶，7ml ;显色液8液I瓶，7m];终止液I瓶，7ml ;浓缩洗涤液I瓶，40ml ；浓缩复溶液I瓶，50ml。
[0010]经实验表明本试剂盒具有很闻的灵敏度:水广品样本的最低检测限为1.0 Ug /kg，回收率为80% ±20%，相对于其他呋喃丹检测方法，本试剂盒所需仪器较少，且所需仪器同类实验室一般均有配备，所需成本较低。
[0011]本发明的有益效果是:能快速、简便、灵敏、准确地用于水产品中呋喃丹残留量的检测。
【具体实施方式】
[0012]一、试剂盒组装
酶标反应徼孔条(2)预包被呋喃丹偶联抗原(3)固定于酶标板的外框支撑架(I)上，酶标反应徼孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱内反应时封盖酶标反应微孔条(2);透明帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色彼A液，红色帽￠)的黑色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml酶标二抗，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装7ml呋喃丹抗体工作液，黑色帽的白色塑料试剂瓶(9)用于封装Iml /瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为:40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11 )。7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml呋喃丹抗体工作液瓶位(16)，7ml酶标二抗瓶位(15)，7瓶Iml /瓶各种浓度的标准品溶液瓶位(I 7)，盒体为(19)是硬纸盒。
[0013]二、样本的前处理
1.配液:
配液1:
0.1M氢氧化钠溶液:称取2.0g氢氧化钠，加500ml去离子水溶解混匀配液2:
复溶工作液:用去离子水将5X浓缩复溶液按1:4体积比进行稀释(I份5X浓缩复溶液+4份去离子水)用于样本的复溶，复溶工作液在4°C环境下可保存一个月。
[0014]配液3:
洗涤工作液:用去离子水将20X浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释(I份20X浓缩洗涤液+19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。
[0015]2.样本处理步骤:
(1)取2.0±0.05g均质样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入Iml 0.1M氢氧化钠溶液，再加入7ml乙腈，用振荡器充分振荡5min:3000r以上，室温(20~25°C / 68~77 0F )离心1min
(2)取2ml上清液于1ml玻璃试管中，于50?60°C水浴氯气流下吹干；
(3)加入Iml正已烷用涡旋仪涡动30s，再加入Iml复溶工作液，涡动30s，3000r以上，室温(20~25°C / 68~77 0F )离心 5min:
(4)除去上层有机相,取下层50 ul用于分析。
[0016]三、使用试剂盒的操作步骤
1、将所需试剂从冷藏环境