中取出，置于室温(20~25°c)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
2、取出需要数量的做孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2~8°C；
3、洗涤工作液在使用前也需回温；
4、编号:将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行。并记录标准孔和样本孔所在的位置；
5、加标准品/样本/酶标二抗和抗体工作液:加标准品/样本50ul到对应的微孔中，直接加入酶标二抗50 u I /孔，再加入抗体工作液50 ul /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应30min ；
6、洗板:小心揭开盖板膜+将孔内液体甩干，用洗涤工作液250ul/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
7、显色:加入底物液A液50u I /孔，再加底物液B液50 u I /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15min ；
8、测定:加入终止液50u I /孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450 / 630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。
[0017]四、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第I种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与呋喃丹的含量成负相关。
[0018]1、用样本的平均吸光度值与标准品比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本I的吸光度值为0.258，样本2的吸光度值为0.956，标准液吸光度值分别是:0ppb为1.988 ；
0.2ppb 为 1.454 ；0.6ppb 为 0.842 ；1.8ppb 为 0.454 ；5.4ppb 为 0.182 ；16.2ppb 为 0.078。则样本I的浓度范围是1.8ppb~5.4ppb，再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中喹酮类药物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.2ppb、0.6ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中喹酮类药物残留的浓度范围。
[0019]2、定量判定
(I)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光率)=B / B。X 100%
B一标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B。一 Oppb标准溶液的平均吸光度值
(2)标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以标准品浓度(PPb)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃丹实际浓度。
[0020]五、注意事项
1、室温低于20°c或试剂及样本没有回到室温(20°C ~25°C)会导致所有标准的OD值偏低。
[0021]2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
[0022]3、试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
[0023]4、反应终止液为2mol / L硫酸,避免接触皮肤。
[0024]5、储存条件:保存试剂盒于2~8°C，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
[0025]6、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
[0026]7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。O标准的吸光度值小于0.5 (A4M〈0.5)时，表示试剂可能变质。
[0027]8、加A, B液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间到20min(或更长)，但不得超过25min。反之，则减短反应时间。
[0028]9、该试剂盒最佳反应温度为25°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【主权项】
1.一种检测水产品中呋喃丹的ELISA试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、14瓶试剂，其特征在于:酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔中预包被呋喃丹偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶呋喃丹标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液，显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于:还包括一张盖板膜和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，盒体是硬纸盒；96孔试剂板为聚苯乙烯酶标板，放于真空铝钼袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液和高浓度标准品溶液均用黑色帽的白色PE塑料瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位共15个，由塑料泡沫制成。3.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于:酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被呋喃丹偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml /瓶；酶标二抗I瓶，7ml ;抗体工作液I瓶，7ml ;显色液A液I瓶，7ml ;显色液8液I瓶，7ml ;终止液I瓶，7ml:浓缩洗涤液I瓶，40ml ;浓缩复溶液I瓶，50ml。
【专利摘要】本发明涉及一种检测水产品中呋喃丹残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括：96孔酶标板、酶标二抗、呋喃丹抗体工作液、呋喃丹6个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法．在酶标板做孔中预包被偶联抗原，样本中含有的呋喃丹将和微孔中预包被的偶联抗原竞争结合抗呋喃丹抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色．样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中呋喃丹的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在水产品中呋喃丹的残留量检测中发挥重要作用。
【IPC分类】G01N33/543
【公开号】CN105572346
【申请号】CN201410548689
【发明人】杜霞, 刘静, 江振飞
【申请人】镇江先创生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月16日