专利名称：：含有来自宿主细胞蛋白的肽的hpv疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有来自宿主细胞蛋白的肽的人乳头状瘤病毒(HPV)疫苗，更特别地，但不是排他地，涉及对抗与HPV感染相关的癌症如宫颈癌、头颈癌和皮肤癌的疫苗。肽包括已经通过HPV蛋白如E6和E7靶向降解的宿主细胞蛋白的片段。此外，本发明涉及新肽的鉴定及其用途。此外，本发明涉及新的肽肽复合物及其用途。
背景技术：
：人乳头状瘤病毒(HPV)是非常常见的引起足部、手部、声带、口部和生殖器官组织异常生长的病毒。已经鉴定出60多种类型的HPV，每种类型都感染身体的某些部位。HPV主要通过与感染个体的身体接触来传播。在大多数情况中，HPV在1-2年内消失，实际上，在感染过程中可能是亚临床的；个体可能没有察觉到它们的感染。然而，在少数情况中，HPV可以进展和发展成癌症。存在两种由HPV引起的异常组织湿疣(疣)和发育异常(癌症前期)。可以在任何感染部位发现疣样生长并可能引起搔痒、灼烧或轻微的出血。在这些情况下，可以开抗病毒霜剂的药方，或，有时，可以通过冻烙(破坏组织的冷冻)或热烙术(用电器械或激光处理烧掉疣)来排除或破坏生长。如果HPV感染进展成癌症，则通过外科手术、放疗和化疗的结合来治疗癌症患者。然而，放疗和化疗具有不仅破坏恶性细胞也破坏健康细胞的缺点，并因此可引起严重的副作用，而外科手术是侵入性的并使患者易受到继发性感染。这些副作用和风险是不利的，且与此相联系的事实是这些治疗通常不成功，导致大部分患者开始复发并因此表现为疾病。因此清楚的是需要更有效的治疗，已经有人提出免疫系统的特异性可以用来对抗病毒感染的细胞。已经将这种概念称为“免疫治疗”。特别地，已经证实癌症患者具有能够识别其肿瘤细胞的T细胞，但是这些细胞不会分裂和分化成能够杀伤这些细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。细胞毒性T淋巴细胞杀伤“靶”细胞，如病毒感染的细胞，且还参与癌细胞的“免疫监视”。大部分CTL属于T细胞的CD8+-亚类，并具有T-细胞受体(TCR)。在与1类主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的细胞表面上表达时，这些TCR能够识别肽。在人中，每类MHC由多于一个基因座来表示；将这些称为人白细胞抗原(HLA)。1类HLA基因座是HLA-A、-B、-C、-E、-F和-G。此外，每个HLA具有不同的等位基因，表1中列出了迄今为止已经鉴定的那些等位基因。当CTL遇到其TCR对其具有特异性的抗原/MHC复合物时，它进入细胞周期并通过几轮的有丝分裂，接着分化成效应/杀伤细胞。分化包括形成大量的含有细胞杀伤蛋白穿孔素和颗粒酶的修饰溶酶体。一旦CTL已经杀伤靶细胞，其大部分将死亡，尽管小部分变成如果抗原再出现可以快速应答该抗原的记忆细胞。已经证实肿瘤反应性细胞毒性T淋巴细胞介导动物模型(1)和人(2)中的肿瘤退化，因此对使用肿瘤特异性CTL作为用于人癌症的免疫治疗存在着兴趣。在这方面，已经证实单克隆抗体针对一些癌症是有效的，尤其是白细胞癌，且瞄准与癌细胞相关的分子或受体。表2列出了这些抗体中的一些及其作用机制。另外，树突细胞疫苗已经用于引发肿瘤特异性CTL应答。树突细胞是最有效的抗原呈递细胞且它们通过吞噬抗原，将其加工成肽并呈递给T细胞来起作用。为了制备树突细胞疫苗，收集树突细胞，体外暴露于与患者肿瘤类型相关的抗原，然后将它们再注射至患者体内。迄今为止，这些疫苗已经显示出对抗黑素瘤、前列腺癌和淋巴瘤的一些成功的希望。理想地，这些疫苗靶向在癌细胞，而不是健康细胞上表达的分子。然而，一直难以找到这样的肿瘤特异性抗原，因此目前使用的许多免疫剂也靶向健康细胞，希望这些细胞最终会复原。如同放疗和化疗一样，这种治疗也会引起严重的副作用，还导致自体免疫的潜能(3)。实际上，在端粒酶疫苗的情况中，这种蛋白还存在于骨髓的干细胞、生殖器官和可能其他组织中。此外，一些树突细胞所接触的抗原包括酪氨酸酶，发现于一些黑素细胞中，或前列腺酸性磷酸酶(PAP)，发现于前列腺细胞中。因此清楚的是需要其他的病毒疗法，尤其是用于那些具有晚期疾病的未能响应常规病毒或癌症治疗的患者。最近，许多研究已经表明肿瘤细胞中某些蛋白的高水平表达足以使得CTL能够区分肿瘤细胞和正常细胞(4，5)。避免肿瘤免疫治疗中自体免疫的一种方法是靶向15％的与病毒相关的人恶性肿瘤。这些恶性肿瘤中最强烈相关的是宫颈癌和人乳头瘤状病毒，99.7％的宫颈癌含有HPVDNA(6)。存在超过25种感染生殖器粘膜并引起恶性肿瘤如宫颈癌、头颈癌和皮肤癌的HPV。这些“高危”HPV的特征在于至少两个致癌基因产物E6和E7，其发挥作用使上皮细胞在子宫颈中无限增殖和转化。认为这些蛋白的表达对保持癌细胞的转化表型是必要的，因此这些非自体病毒蛋白对于CTL介导的免疫治疗是有吸引力的靶。可以通过接种疫苗来诱导有效对抗HPVE6/E7的CTL(7)，且在癌变前的宫颈疾病(8)或癌症(9)患者中检测到这样的具有可变出现率的CTL。然而，一直难以在体外产生这些CTL，可能是因为它们以低频率出现(10)。使用这些蛋白作为肿瘤特异性靶的主要限制在于它们在癌细胞中以低水平表达(11)。此外，E6和E7蛋白自身较小并含有很少的适于CTL识别的抗原决定部位(12)。
发明内容本发明的目的在于通过以下方法克服这些问题，即，鉴定且然后靶向由CTL识别的肽，该肽对HPV转化的细胞是特异性的且极不可能引起自体免疫。这些肽在HPV转化的细胞中是唯一呈递的或超量呈递的，且产生这些肽的蛋白在HPV转化的细胞中通常是不存在的或看来似乎以非常低的水平被表达。相反，这些蛋白在正常细胞中以正常或高水平出现。本发明是基于HPVE6和E7癌蛋白用来介导宿主细胞蛋白特别是如成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)、C-MYC和HMCM7(参见表3)的靶向降解的机理，所述的靶向降解发生于感染细胞的转化过程中。众所周知，HPV癌蛋白结合并促进宿主细胞蛋白如Rb的降解。因此，HPV转化的宫颈癌的分析揭示了没有全长Rb蛋白的明显表达，而正常细胞具有高细胞水平的Rb蛋白，因为它通常不受蛋白水解性降解(13)。已经证实Rb蛋白通过遍在蛋白依赖性蛋白水解系统来降解(13)，且新近，已经众所周知的是称为蛋白酶体的胞内细胞器与E6或E7癌蛋白相互作用后，在介导宿主细胞蛋白的降解(18，19)中起作用。我们已经认识到以下事实例如遍在化蛋白底物通过蛋白酶体的降解可能是主要的机理，通过该机理产生由CTL识别的肽(20，21)。例如，在病毒感染的细胞中，细胞质中新合成的病毒蛋白通过蛋白酶体降解成肽片段。这些肽通过与抗原加工相关的转运蛋白(TAP)转运到内质网(ER)中。一旦在ER之内，肽将结合游离的I类MHC分子和β2微球蛋白来形成成熟的MHC/肽复合物。将这种复合物转运至细胞表面，在那里其可以被CTL所识别。图1显示了该过程的图示。因此，本发明是基于以下的理论在HPV转化的细胞中，Rb蛋白(和其他蛋白，参见表3)将被靶向而降解、加工，它的肽将作为可以被CTL识别的肽在细胞表面上得到呈递。在非HPV转化的细胞或正常细胞中，这些蛋白不会得到显著的降解，因此这些肽不能有效地供CTL识别。因此，与正常细胞相反，HPV转化的细胞应当在肽HLA复合物中具有高水平的例如Rb衍生的肽，其通常在细胞表面上得到共同呈递，但是全长蛋白的胞内水平较低(图2)。使用宿主细胞蛋白作为免疫治疗的靶不是新奇的。然而，之前的一切情况下，这种方法均依赖于与正常细胞相比较，肿瘤中蛋白的超表达。例如，宿主细胞蛋白如p53(5)、Wilms转录因子(WT1)、Her2/Neu(16)和hTert(17)已被推荐为“肿瘤特异性”抗原，因为所有这些蛋白都在肿瘤细胞中得到超表达。据我们所知，这是第一次将HPV或癌症疫苗瞄准“肿瘤特异性”蛋白，更特别的是它的肽，与正常细胞相比较，它们以正常的、低的或不可检测的水平在HPV转化的细胞中得到表达。之前，为了使CTL能够区分肿瘤细胞和正常细胞，认为高水平的抗原表达是有利的。此外，到现在为止HPV疫苗包含由HPV产生的蛋白，而不是被该病毒靶向降解的宿主蛋白。总而言之，本发明依赖于肽在细胞表面上相对高水平的呈递而不一定依赖于相应蛋白质在病毒感染的细胞中的相对高水平的表达或明显表达。实际上，肿瘤特异性蛋白的低水平表达或无表达通常表明该蛋白正在受到病毒蛋白的靶向降解，因此以低胞内水平存在，但降解后，在细胞膜上呈递，因此可用作CTL识别的肽。因此，本发明的一方面中，提供了疫苗，包含至少一种分离的、纯化的、合成的或重组的肽，其中肽是通过人乳头状瘤病毒癌蛋白降解，并给药于哺乳动物时可以引发CTL应答的宿主细胞蛋白的片段。在此提及的已经通过人乳头状瘤病毒癌蛋白降解的细胞蛋白包括已经通过HPV癌蛋白选择性靶向降解的蛋白，并因此包括在HPV转化的细胞中将会得到选择性靶向降解的蛋白或以最典型地但非排他地通过遍在蛋白途径直接或间接被降解的方式受到人HPV癌蛋白作用的蛋白。本发明优选的实施方案中，哺乳动物是人。优选，癌蛋白是E6或E7。宿主细胞蛋白可以是被病毒蛋白如E6或E7降解的任何蛋白，且表3列出了目前已知的被E6或E7靶向降解的那些蛋白。优选地，肽是HPV-特异性的或肿瘤特异性的，意思是相对于正常细胞，其在HPV转化的细胞或肿瘤细胞的细胞表面上大量呈递。更优选地，肽是9至30个氨基酸长。或者，肽可以是9至11个氨基酸长。CTL应答优选是HPV特异性或肿瘤特异性的CTL应答，意思是CTL可以识别表达疫苗的肽的HPV转化的细胞或肿瘤细胞。更优选地，疫苗含有一种或多种表4中所示的肽(SEQIDNO1-163)。再更优选地，疫苗含有上述任一种肽加上含有主要组织相容性复合体分子的另一种蛋白或肽，理想地，I类分子，更具体地，人白细胞抗原(HLA)，再更理想地，选自表1的HLA。本发明的另一方面中，提供了疫苗，包含至少一种分离的、纯化的、合成的或重组的肽，其中肽选自表4中所列的那些。本发明的另一方面中，提供了疫苗，包含至少一种选自表4的分离的、纯化的、合成的或重组的肽，和此外至少一种选自表1中所列那些的分离的、纯化的、合成的或重组的HLA。本发明另一方面中，提供了疫苗，包含至少一种编码任一种如上所述的肽或肽/HLA复合物的分离的、纯化的、合成的或重组的核酸分子。该实施方案中，核酸分子可以是含有重组构建体的载体形式。理想地，所述构建体适于所述疫苗在所选宿主系统中的表达。宿主系统是细胞、质粒、病毒、活的生物体或其他相似的载体。根据本发明的再一方面，提供了用本发明的载体转化或转染的宿主细胞。此外，本发明提供了制造疫苗的方法，该方法包括培养用如上所述的含有重组构建体的载体转化或转染的宿主细胞；并分离/纯化所得到的构建体产物。本发明的肽还可以用于在体外产生和分离HPV特异性的或肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞或其T细胞受体或编码所述受体的基因，用于获得性免疫治疗中。例如这可以通过用至少一种上述的肽培养T淋巴细胞来进行。根据本发明的再一方面，提供了鉴定HPV特异性或肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的方法，包括(a)用至少一种肽培养含有细胞毒性T淋巴细胞的样品，这种肽表示用HPV转化或转染所述宿主细胞时通过HPV蛋白降解的该宿主细胞蛋白的片段，借此所述肽最终在病毒感染细胞的表面上呈递；和(b)选择通过与其结合而识别所述肽的CTL。本发明优选的方法中，所述肽是选自表4中所示目录的一种。本发明另一优选的方法中，CTL是CD8+细胞。本领域技术人员清楚的是可以使用上述方法来进一步鉴定CTL受体。本发明可以用于治疗HPV相关疾病，特别是癌症，优选宫颈癌、头颈鳞状上皮细胞癌、非黑素瘤皮肤癌、肝癌、间皮瘤或前列腺癌。此外，本发明还提供了治疗方法，该方法包括将如上所述的疫苗给药于待治疗的哺乳动物。理想地，哺乳动物是人。根据本发明的再一方面，提供了选自表4中所示目录的肽或编码这种肽的核酸分子。本发明再一实施方案中，所述肽用作疫苗，特别是用作HPV疫苗来治疗HPV相关病症。根据本发明的另一方面，提供了含有至少一种表4中所列的肽与HLA共呈递肽相结合的复合物。更优选地，HLA肽是表1中所列的肽之一，更具体地是HLA-A结合蛋白，再更具体地是HLA-A0201。根据本发明的再一方面，提供了HPV特异性肽用于生产HPV疫苗的用途，其中所述肽是已经通过人乳头瘤状病毒癌蛋白降解的哺乳动物细胞蛋白的片段，并且其与HLA结合，在转化的或转染的HPV细胞的表面上呈递，借此通过细胞毒性T淋巴细胞对这种肽HLA复合物的识别来导致免疫应答的引发。现在将通过以下的实施例并参照以下的附图来描述本发明，其中图1显示了人乳头状瘤病毒转化的细胞中宿主细胞蛋白的T细胞识别的机理。图2显示了正常细胞和HPV转化的细胞中宿主细胞肽呈递的差异。图3显示了宿主蛋白衍生的肽的HLA-A2结合。具体地，用100μg测试肽孵育过夜后，用流式细胞计来监视T2细胞的HLA-A*0201表达。每个肽重复测试四份。认为高于50％的HLA-A*0201表达提高％是显著的；图4显示了对抗源自人Rb蛋白的肽的体内T细胞应答的产生。具体地，用100μg乳化于不完全弗氏佐剂中的测试肽使HLA-A2/Kb转基因小鼠免疫。每种肽测试两至四只小鼠。十至十一天后，将小鼠处死并在ELISPOT测定中测试脾细胞。这些测定测量了产生IFNγ的对免疫肽特异的T细胞的数量(斑点)。在至少两个进一步重复实验中证实了阳性结果。显示了测试M158-66、Rb1、Rb7和BAK18肽的1个实验的代表性数据；图5显示了可以在健康HLA-A2+捐献者中检测到识别Rb7的CD8+T细胞。具体地，用Rb7(画面C&D)或Melan-A/Mart126-35(画面A&B)肽培养CD8+T细胞14天。在第0天和第14天，使用合适的荧光化肽HLA-A2五聚物来测量肽特异性CD8+T细胞的数量。在流式细胞器上分析这些细胞的数量并以门控细胞的％表示，不包括死细胞和CD14+细胞。显示了捐献者5的结果(来自表4)；和图6显示了在健康捐献者中可以检测到识别Rb7的功能性CD8+T细胞。具体地，富集来自HLA-A2+健康捐献者的外周血淋巴细胞中的CD8+T细胞，然后用Rb7肽和抗原呈递细胞(APC)培养14天。收集培养过的细胞并在酶联免疫斑点(ELISPOT)测定中测试来测量能够响应Rb7肽而分泌IFNγ的T细胞的数量。七名捐献者中的三名(A、B、C)能够产生显著的应答(T细胞+Rb7+PBMC的斑点数＞超出T细胞+PBMC的2个标准偏差)。具体实施例方式实施例1选择来自15种蛋白的9或10个氨基酸的候选肽来用于分析，参见表4中的肽的详尽目录。根据公开的算法(33，34)，选择了一百零二个预测结合HLA-A*0201的肽。(表4)。我们使用的算法以前已经成功地用于预测其他肿瘤特异性CTL抗原决定部位(17)。我们选择了HLA-A*0201作为共同呈递的肽，因为这是高加索人中最常见的HLA等位基因(～40％)，且存在定义明确的体内和体外模型系统来帮助证实概念实验。从102种肽的初始目录中，合成了62种用于测试。测试肽与HLA-A*0201的结合CTL识别结合细胞表面上的HLAI类分子的肽。因此，肽必须表明结合HLA是有用的。这可以使用基于细胞的测量由结合所致的HLA-A*0201表达提高的测定法来测量。将基于细胞的肽结合测定法((35))用来说明大部分(43/62)的候选肽能结合HLA-A*0201(表3，图3)。宿主蛋白衍生的肽的HLA-A2结合用100μg测试肽孵育过夜后，用流式细胞计来监视T2细胞的HLA-A*0201表达。将每种肽重复测试四份。认为高于50％的HLA-A*0201表达的百分比提高是显著的。可以将所观察到的结合水平分类为强或中等，并可与两个公知的HLA-A*0201限制性CTL抗原决定部位(流感M1和EBVBMFL1)相比较(图3)。选择了43种显示出HLA-A*0201表达的提高高于50％的肽作为在免疫原性实验中测试的候选物。测试小鼠的体内免疫原性我们已经使用HLA*A0201转基因小鼠来测试可能的人疫苗(36)。可以用肽和佐剂一起免疫这些小鼠来监视体内应答的发生。使用ELISPOT测定法检测这些应答来测量脾脏内分泌IFN-γ的肽特异性T细胞的数量。使用来自Rb(6)、Mupp1(7)、BAK(3)、DLG(2)、AP(2)蛋白的20种肽来进行测试。基于肽结合的强度(图3)来选择所有的肽。将来自流感的M158-66肽，一种已知的HLA-A*0201结合剂，用作阳性对照。与该阳性对照M158-66肽(7/12小鼠)和来自Rb485-493(Rb7)蛋白的肽(7/10小鼠)相对比，观察到显著的T细胞应答。结果显示于图4中。使用人T淋巴细胞测试体外免疫原性候选肽必须能够激活可以识别和杀伤癌细胞的人T淋巴细胞。我们在宫颈癌患者的外周血中检测到肽特异性T细胞。这证明了这类肽尽管源自“自体”蛋白但可以是免疫原性的概念。肽特异性T细胞的检测对抗本发明的肽的T细胞应当优先发现于HLA-A2+宫颈癌患者中。测试了4名患者的血样(3名患宫颈癌，1名患癌变前的疾病，CIN3)中识别Rb7肽的CD8+T细胞的存在。将荧光化的多聚体HLA-A2/肽复合物用于通过流式细胞计测量肽特异性T细胞的数量(10)。该测定表明了可以在2名宫颈癌患者的血液中检测到低出现率的Rb7肽特异性T细胞。这些出现率与以前对于HPV16E7肽特异性T细胞获得的出现率相似(10)。这提示了分离并繁殖Rb特异性T细胞用于进一步的实验应当是可能的。使用上述的技术，在健康捐献者中也可以容易地检测到识别某些“自体”肿瘤抗原如melan-A的T淋巴细胞(50)。然而，通常的情况是在健康捐献者中难以检测到识别“自体”抗原的T淋巴细胞。使用合适的荧光化多聚体(五聚物)，测试了8名健康捐献者的血样(全部HLA-A2+)中识别Rb7肽和melan-A肽的CD8+T细胞的存在。在所有8名健康捐献者中能够以可变的但通常较低频率检测到识别Rb7肽的T淋巴细胞(表6)。相反，针对melan-A的T淋巴细胞应答频率非常高，证实了以前的报道(50)。在捐献者5中发现了Rb7特异性T淋巴细胞的最高出现率(图5)。上述测定表明在患者和健康捐献者中都可以检测到识别Rb7的人T细胞。将ELISPOT测定法用于确定来自健康捐献者的培养的Rb7肽特异性CD8+T淋巴细胞是否能够分泌IFN-γ。测试了七名健康捐献者，其中3名捐献者显示了可检测数量的分泌IFN-γ的T淋巴细胞(图5)。全部这些结果表明通过HPV加工产生的宿主细胞蛋白片段，如Rb7肽，对于人CD8+T淋巴细胞是免疫原性的，并可以引发功能性(IFN-γ分泌)应答。这提示了分离并繁殖大量Rb特异性T细胞用于实验或临床治疗用途应当是可能的。于2005年7月确定的HLAI类等位基因的详尽目录表2用于治疗癌症的单克隆抗体，它们的靶和作用机制表3已知结合HPVE6或E7蛋白后被靶向降解的宿主细胞蛋白。*以其一致同意的标准名称而不是公布的名称来列出蛋白质。表4宿主细胞蛋白和HLA-A*0201结合肽表5肽结合的汇总表表6健康志愿者中识别Rb肽的CD8+T细胞的出现率富集来自HLA-A2+健康捐献者的外周血淋巴细胞中的CD8+T细胞，然后用Rb7肽和抗原呈递细胞(APC)或Melan-A(Mart126-35)肽培养14天。收获细胞并用HLA-A2/Rb7五聚物或HLA-A2/Melan-A五聚物来测试。用流式细胞计来测量CD8+五聚物+T淋巴细胞的数量，不包括死细胞和CD14+细胞。CD8+五聚物+细胞的出现率参考文献1.Mandelboim，O.，E.Vadai，M.Fridkin，A.Katz-Hillel，M.Feldman，G.Berke，andL.Eisenbach.1995.Regressionofestablishedmurinecarcinomametastasesfollowingvaccinationwithtumour-associatedantigenpeptides.NatureMedicine.11179.2.Heslop，H.E.，andC.M.Rooney.1997.AdoptivecellularimmunotherapyforEBVlymphoproliferativedisease.ImmunologicalReviews157217.3.Overwijk，W.W.，D.S.Lee，D.R.Surman，K.R.Irvine，C.E.Touloukian，C.C.Chan，M.W.Carroll，B.Moss，S.A.Rosenberg，andN.P.Restifo.1999.Vaccinationwitharecombinantvacciniavirusencodinga″self″antigeninducesautoimmunevitiligoandtumorcelldestructioninmicerequirementforCD4(+)Tlymphocytes.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica962982.4.Gao，L.，I.Bellantuono，A.Elsasser，S.B.Marley，M.Y.Gordon，J.M.Goldman，andH.J.Stauss.2000.SelectiveeliminationofleukemicCD34(+)progenitorcellsbycytotoxicTlymphocytesspecificforWT1.Blood952198.5.Theobald，M.，J.Biggs，D.Dittmer，A.J.Levine，andL.A.Sherman.1996.Targetingp53asageneraltumourantigen.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica9211993.6.Walboomers，J.M.，M.V.Jacobs，M.M.Manos，F.X.Bosch，J.A.Kummer，K.V.Shah，P.J.Snijders，J.Peto，C.J.Meijer，andN.Munoz.1999.Humanpapillomavirusisanecessarycauseofinvasivecervicalcancerworldwide.JoumalofPathology18912.7.Borysiewicz，L.K.，A.Fiander，M.Nimako，S.Man，G.W.G.Wilkinson，D.Westmoreland，A.S.Evans，M.Adams，S.N.Stacey，M.E.G.Boursnell，E.Rutherford，J.K.Hickling，andS.C.lngglis.1996.Arecombinantvacciniavirusencodinghumanpapillomavirustype16andtype18，e6ande7proteinsasimmunotherapyforcervicalcancer.Lancet3471523.8.Nimako，M.，A.N.Fiander，G.W.Wilkinson，L.K.Borysiewicz，andS.Man.1997.Humanpapillomavirus-specificcytotoxicTIymphocytesinpatientswithcervicalintraepithelialneoplasiagradeIII.CancerRes574855.9.Evans，E.M.，S.Man，A.S.Evans，andL.K.Borysiewicz.1997.Infiltrationofcervicalcancertissuewithhumanpapillomavirus-specificcytotoxicT-lymphocytes.CancerRes572943.10.Youde，S.J.，P.R.Dunbar，E.M.Evans，A.N.Fiander，L.K.Borysiewicz，V.Cerundolo，andS.Man.2000.Useoffluorogenichistocompatibilityleukocyteantigen-A*0201/HPV16E7peptidecomplexestoisolaterarehumancytotoxicT-lymphocyte-recognizingendogenoushumanpapillomavirusantigens.CancerRes60365.11.Frazer，I.H.，R.Thomas，J.Zhou，G.R.Leggatt，L.Dunn，N.McMillan，R.W.Tindle，L.Filgueira，P.Manders，P.Bamard，andM.Sharkey.1999.Potentialxstrategiesutilisedbypapillomavirustoevadehostimmunity.ImmunologicalReviews168131.12.Khammanivong，V.，X.S.Liu，W.J.Liu，S.J.Rodda，G.R.Leggatt，R.W.Tindle，I.H.Frazer，andG.J.Fernando.2003.PaucityoffunctionalCTLepitopesintheE7oncoproteinofcervicalcancerassociatedhumanpapillomavirustype16.ImmunolCellBiol811.13.Scheffner，M.，MungerK，HuibregtseJM，andH.PM.1992.TargeteddegradationoftheretinoblastomaproteinbyhumanpapillomavirusE7-E6fusionproteins.EuropeanMolecularBiologyOrganisationJournal112425.14.Scheffner，M.，B.A.Werness，J.M.Huigbretse，A.J.Levine，andP.M.Howley.1990.TheE6oncoproteinencodedbyhumanpapillomavirustypes16and18promotesthedegradationofp53.Cell631129.15.Higashitsuji，H.，K.Itoh，T.Nagao，S.Dawson，K.Nonoguchi，T.Kido，R.J.Mayer，S.Arii，andJ.Fujita.2000.Reducedstabilityofretinoblastomaproteinbygankyrin，anoncogenicankyrin-repeatproteinoverexpressedinhepatomas.NatureMedicine696.16.Rongcun，Y.，F.Salazar-Onfray，J.Charo，K.Malmberg，K.Evrin，H.Maes，K.Kono，C.Hising，M.Petersson，O.Larsson，L.Lan，E.Appella，A.Sette，E.Celis，andR.Kiessling.1999.IdentificationofNewHER2/neu-DerivedPeptideEpitopesThatCanElicitSpecificCTLAgainstAutologousandAllogeneicCarcinomasandMelanomas1.TheJournalofImmunology，，1631037-1044.17.Vonderheide，R.H.，W.C.Hahn，J.L.Schultze，andL.M.Nadler.1999.Thetelomerasecatalyticsubunitisawidelyexpressedtumor-associatedantigenrecognizedbycytotoxicTlymphocytes.Immunity10673.18.Berezutskaya，E.，andS.Bagchi.1997.ThehumanpapillomavirusE7oncoproteinfunctionallyinteractswiththeS4subunitofthe26SproteasomeJBiolChem27230135.19.Boyer，S.N.，D.E.Wazer，andV.Band.1996.E7proteinofhumanpapillomavirus16inducesdegradationofretinoblastomaproteinthroughtheubiquitinproteasomepathway.Cancerresearch564620.20.Michalek，M.T.，E.P.Grant，C.Gramm，A.L.Goldberg，andK.L.Rock.1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