分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫检测及诊断领域，尤其涉及分泌沙门菌SpiC蛋白单抗的杂交瘤 细胞株、其分泌的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] SpiC是第一个被鉴定出的由沙门氏菌毒力岛2编码的效应蛋白，SpiC全长为127 个氨基酸，分子量约为14. 7kDa，推测其有双重功能，与宿主蛋白TassC和Hook的相互作用， 预测了 SpiC在避免SCV与溶酶体融合机制中的重要作用，因为两个靶蛋白均为膜泡运输相 关蛋白。
[0003] SpiC的免疫学检测是在特异性抗SpiC的单克隆抗体的基础上建立的用于对样本 中的SpiC进行定性定量分析的实验方法。应用不同的单抗标记物和检测技术，已经开发出 多种方法，如酶免疫分析法（EIA)，酶联免疫吸附法（ELISA)，酶联免疫斑点法（ELISP0T)， 流式细胞术（FCM)分析法等。
[0004] 竞争酶联免疫吸附试验（Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assay，简 称竞争ELISA)技术具有高度的敏感性和应用广泛性，已成为近年来最吸引人的免疫检测 方法之一，在疫苗的研发、临床诊断以及基础研宄等方面得到广泛应用。建立在免疫基础上 的沙门菌检测方法的灵敏度和特异性更高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该 杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，以及该杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体在免疫检测 领域的应用。
[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0007] 本发明的第一方面提供了一种分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞 株，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO :C201563。
[0008] 所述杂交瘤细胞株已于2015年4月26日在中国典型培养物保藏中心（地址：湖 北省武汉市武汉大学）注册保藏，保藏号为CCTCC NO :C201563,分类命名为：杂交瘤细胞株 5F8〇
[0009] 本发明的第二方面提供了一种沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO :C201563的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
[0010] 本发明的第三方面提供了前述分泌沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株 及前述沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体在制备鸡疫病的检测试剂或诊断试剂中的应用。
[0011] 本发明第四方面提供了一种沙门菌检测试剂盒，所述试剂盒包括：
[0012] 1.选自以下任一：
[0013] 1)酶标板和检测原；
[0014] 2)包被有检测原的酶标板；
[0015] 所述检测原是沙门菌SpiC蛋白。
[0016] 本发明的一个优选实施例中采用的检测原的制备方法详见耿士忠，刘欢，焦新安 等.鸡白痢沙门菌SpiC蛋白原核表达及其间接ELISA方法的建立[J].细胞与分子免疫学 杂志，2015, 31(2) : 149-158。
[0017] 2. HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体；
[0018] 所述试剂盒中，酶标板可以事先包被有检测原，也可以只提供空白酶标板与检测 原，在检测前由操作者自行采用常规方法在酶标板上包被检测原。
[0019] 所述酶标板可为各种常见规格的酶标板，如96孔酶标板。
[0020] HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体的方法采用常规。
[0021] 进一步优选的，所述HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体中的沙门菌SpiC蛋白 单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO :C201563的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
[0022] 保藏号为CCTCC NO !C201563的杂交瘤细胞株已于2015年4月26日在中国典型 培养
[0023] 物保藏中心（地址：湖北省武汉市武汉大学）注册保藏，分类命名为分类命名为： 杂
[0024] 交瘤细胞株5F8。
[0025] 进一步的，所述试剂盒中还包括下列试剂中的一种或多种：
[0026] 1)底物液；
[0027] 2)洗涤液。
[0028] 上述试剂均为竞争ELISA检测中的通用试剂，不受具体检测项目的限制，因此即 可根据需要有选择地加入试剂盒，也可由操作者自行配置或者单独购买。为方便操作者，最 优的选择是试剂盒中，同时包括底物液和洗涤液。所述底物液可为竞争ELISA检测试剂盒 中常用的通用底物液，如3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)底物液。
[0029] 所述洗涤液可为竞争ELISA检测试剂盒中常用的洗涤液，如磷酸盐缓冲液等。可 以根据需要选用浓缩或未浓缩的洗涤液。
[0030] 进一步的，所述试剂盒中还可以有选择地包括其他竞争ELISA检测所需通用试 剂，如封闭液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐吐温缓冲液等。
[0031] 所述封闭液可为包被酶标板常用的封闭液，如脱脂乳液、FBS、BSA或酪蛋白等。
[0032] 通常情况下，本发明的试剂盒中，各试剂分别隔离储存。
[0033] 本发明进一步基于上述SpiC蛋白竞争ELISA检测试剂盒，建立了具有较好特异性 和灵敏度的沙门菌的竞争ELISA检测方法，用于检测鸡血清，从而进行机体免疫状态评价 及疾病诊断方面的研宄。
[0034] 本发明的试剂盒可用于检测感染沙门菌的鸡血清样品。
[0035] 利用本发明的试剂盒检测感染沙门菌的鸡血清样品的检测方法包括下列步骤：
[0036] 1、检测原包被酶标板；
[0037] 2、制备鸡血清
[0038] 3、检测
[0039] ①将检测原用碳酸盐缓冲液稀释至最佳包被浓度，每孔IOOy L，轻轻混匀，4°C包 被过夜。弃去，？831'洗3次。每孔加入20(^1^1%834,37°〇反应211，弃去，？831'洗3次。
[0040] ②在上述包被的酶标板中加入最佳稀释度的血清，每孔100 μ L，37°C孵育2h，
[0041] ③弃去样品，PBST洗3次，加入HRP标记沙门菌SpiC蛋白单克隆抗体IOOL/孔， 37 0C
[0042] 孵育 Ih ;
[0043] ④弃去检测抗体，PBST洗6次，加入TMB显色液，100 μ L/孔，37°C避光反应5min ; [0044] ⑥加入2M H2SO4, 50 μ L/孔，使用酶标仪于OD45tl波长下测定吸光值。
[0045] 上述方法通过离心分离鸡血清，以阳性鸡血清作为阳性样品，以阴性鸡血清作为 对照样品，并以纯化的保藏号为CCTCC NO !C201563的杂交瘤细胞株分泌的单抗为检测抗 体，结果显示，该方法可以有效检测出沙门菌。
[0046] 本发明的有益效果为：
[0047] 本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲 和力强的优势，基于此建立的检测试剂盒，在检测鸡血清样品时，具有较好的灵敏度和特异 性。采用本发明的试剂盒操作简便，极大缩短了检测时间，可以广泛应用于免疫学研宄，用 作鸡机体免疫状态的评价及感染性疾病诊断相关的研宄。
[0048] 本发明杂交瘤细胞株保藏信息如下：
[0049] 杂交瘤细胞株名称：杂交瘤细胞株5F8 ;
[0050] 保藏号为：CCTCC NO :C201563 ;
[0051] 保藏日期：2015年04月26日；
[0052] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
[0053] 保藏单位简称：CCTCC ;
[0054] 保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
【附图说明】
[0055] 图 I :5F8Western Blotting 鉴定图，其中，1 为 rHis-SpiC 纯化蛋白；2 为 BL21 (DE3) (pET) ;3 为 rGST-SpiC 纯化蛋白；4 为 BL21 (pGEX-6p-l)。
【具体实施方式】
[0056] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0057] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术 领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技 术及相关领域的常规技术。这些技术在现有