犬细小病毒杂交瘤细胞、及单克隆抗体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及犬细小病毒杂交瘤细胞、其产生的单克隆抗体，以及其制备的疫苗组 合物，免疫检测系统和应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV)在自然界广泛存在，引发动物感染犬细小 病毒病，一年四季均可发病，临床症状以呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特征，发病率和死 亡率比较高。犬是CPV的主要自然宿主，各年龄和不同性别的犬均易感，CPV也可感染其它 犬科动物如貂、狐狸、狼、丛林狼、食蟹狐、南美狗和亚洲狸和鼠鼬科动物，以幼犬最为易感， 随抗原漂移，还可感染猫。CPV可随患病动物的粪便、尿液等排出体外，污染周围环境，康复 犬的粪便可长期带毒。有研宄表明，人、虱、苍蝇和蟑螂都可成为CPV的机械携带者。由该 病毒引起的犬细小病毒病的发病率为50%~100%，死亡率为0%~50%。该病严重威胁 宠物犬的健康，也给犬科经济动物养殖造成巨大经济损失。
[0003]目前，国内外犬细小病毒检测方法主要包括核酸检测法和胶体金快速检测法，其 中核酸检测法检测时需要配备PCR仪等昂贵设备和专业的技术人员，从而限制了其在大规 模筛查方面的应用，使得该方法偏向于实验室诊断；胶体金快速检测法的检测灵敏度较低。 基于此，亟需发展一种快速、简便、灵敏度高的检测方法。
[0004] 专利申请CN103604924A公开了一种犬细小病毒胶体金免疫层析检测试纸条，其 使用胶体金标记的抗犬细小病毒单克隆抗体进行检测，该检测方法快速，但是灵敏度较低。
[0005] 军事医学科学院实验动物中心用该研宄室研制的抗犬细小病毒单克隆抗体和多 克隆抗体，采用ELISA原理，研制成功了犬细小病毒诊断试剂盒。该试剂盒检测快速、与血 凝试验的符合率高，然而，其存在操作繁琐，结果判定主观性强，试纸条灵敏度低的缺点。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术的不足，本发明提供了两株犬细小病毒杂交瘤细胞，其分泌的单 克隆抗体，可以有效地诊断、预防和/或治疗犬细小病毒所引发的感染。
[0007] 本发明还提供了一种犬细小病毒酶免检测试剂盒，可用于犬细小病毒快速、简便、 准确地检测，克服了现有技术检测中灵敏度较低的问题，该试纸条比常规的胶体金快速检 测试纸条具有更高的灵敏度。
[0008] 术语"犬细小病毒"（Canine parvovirus，CPV)属于细小病毒科（Parvoviridae) 细小病毒属（Parvovirus)，是DNA病毒中分子量最小的病毒，可感染犬、紹、狐狸犬科动物 和鼠鼬科动物、猫，以幼犬最为易感，临床症状以呕吐、腹泻和白细胞减少为主要特征，发病 率和死亡率比较高。
[0009] 本发明的第一方面在于提供小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株，所述小鼠骨髓杂交瘤 细胞 10B11 株（Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0, strain 10B11)保藏 号为CCTCC N〇:C201578,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大 学，保藏时间为2015年05月20日。
[0010] 本发明的小鼠杂交瘤细胞10B11株由犬细小病毒CVCC AV298株抗原免疫小鼠后， 取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。
[0011] 本发明的第二方面在于提供小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株，所述小鼠骨髓杂交瘤 细胞 10H4 株（Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0, strain 10H4)保藏号 为CCTCC N〇:C201579,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉?武汉大学， 保藏时间为2015年05月20日。
[0012] 本发明的小鼠杂交瘤细胞10H4株由犬细小病毒CVCC AV298株抗原免疫小鼠后， 取其脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选制得。
[0013] 本发明的第三方面在于提供所述的10B11株分泌的抗犬细小病毒单克隆抗体 IOBllo
[0014] 本发明的小鼠杂交瘤细胞10B11株所产生的单克隆抗体10B11的相对亲和力常数 为1:5120,也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高；所述单克隆抗体10B11HI 效价大于1:12800,与犬细小病毒具有良好的反应性；所述单克隆抗体10B11的中和抗体效 价大于1:4466,具有良好的中和活性。
[0015] 本发明的第四方面在于提供所述的10H4株分泌的抗犬细小病毒单克隆抗体 10H4〇
[0016] 本发明的小鼠杂交瘤细胞10H4株所产生的单克隆抗体10H4的相对亲和力常数为 1:5120,也就是说，其与抗原的抗原决定簇的结合强度非常高；所述单克隆抗体10H4HI效 价大于1:12800,与犬细小病毒具有良好的反应性；所述单克隆抗体10H4的中和抗体效价 大于1:4466,具有良好的中和活性。
[0017] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个 体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该抗体的性质 不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌 合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有 抗原结合结构域的任何多肽。
[0018] 术语"抗体"应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗 原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd ;和双链抗体（diabodies)。融合至另一多肽 的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达 在 EP. A. 0120694 和 EP. A. 0125023 中描述。
[0019] 术语"抗体"可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异 性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决 定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。参见，EP. A. 184187， GB2188638A或EP. A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或 其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。
[0020] 用于本发明的"单克隆抗体"可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的 DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据氨基酸序列人工合成或用PCR法扩 增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达 载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技 术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。
[0021] 术语"中和抗体"在本文以最广义使用，指的是抑制犬细小病毒重复感染靶细胞 的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细 胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附 着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体（Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病 毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用 (endocytosis)抑制来自受感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限 于实现中和的机制。
[0022] 本发明的第五方面在于提供一种所述疫苗组合物，所述疫苗组合物包括：免疫量 的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11，和/或免疫量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗 体10H4 ;以及药学上的载体。
[0023] 所述单克隆抗体具有良好的中和活性，其制备的疫苗组合物可抑制犬细小病毒重 复感染靶细胞。
[0024] 术语"免疫量"当理解为"预防有效量"时，是指能够在接种的个体中足以引发免 疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述"预防有效量"随免疫接种的方式、时机、给药 对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应 的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的"预防有效 里。
[0025] 术语"免疫量"当理解为"治疗有效量"时，是指能够对受试个体产生有效保护以 及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述"治疗有效量"随治疗方案、病程、治疗对象的 状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应 的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的"治疗有效量"。
[0026] 术语"药学上可接受的载体"是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和 特性的载体或者稀释剂。
[0027] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物经肌肉注射给药。
[0028] 作为本发明的一种优选实施方式，所述疫苗组合物包括但不限于粉末剂、颗粒剂、 丸剂、片剂、胶囊剂。
[0029] 术语"预防和/或治疗"在涉及犬细小病毒感染时是指抑制犬细小病毒的复制、抑 制犬细小病毒的传播或防止犬细小病毒在其宿主体内定居，以及减轻犬细小病毒感染的疾 病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以 认为所述治疗达到了治疗效果。
[0030] 本发明的疫苗组合物可使用下述方法制备：（1)使用所述杂交瘤细胞10B11株分 泌表达单克隆抗体，和/或所述杂交瘤细胞10H4株分泌表达单克隆抗体；以及（2)将所述 步骤（1)中表达的单克隆抗体加入药学上可接受的载体。
[0031] 本发明的第六方面在于提供一种犬细小病毒检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括 检测有效量的所述的抗犬细小病毒单克隆抗体10B11，和/或检测有效量的所述的抗犬细 小病毒单克隆抗体10H4。
[0032] 术语"检测有效量"又称"诊断有效量"，是指能够利用所述单克隆抗体有效检测样 品中是否存在犬细小病毒的量。根据已知的免疫化学检测方法，本领域技术人员能够知晓， 所用单克隆抗体的量随采用的具体免疫检测方