>[0116] 注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。
[0117] 结果显示：除了固相的单克隆抗体10B11与酶标的单克隆抗体10H4检测0.0 lHA 的犬细小病毒CVCC AV298株病毒稀释液为阳性，其它搭配检测均为阴性。
[0118] 根据上述实验结果：选择单克隆抗体10B11作为固定原料，单克隆抗体10H4作为 标记原料。
[0119] 实施例3犬细小病毒酶免检测试剂盒的制备
[0120] 3. 1单克隆抗体的辣根过氧化酶（HRP)标记
[0121] 根据实施例1制备的单克隆抗体10H4,按照Ti jssen P等（Ti jssen P，Kurstak E. Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidase antibody conjugates for enzyme immunoassays (J) . Anal Biochem，1984, 136:451-457)的文献对抗犬细小病毒单克隆抗体进行辣根过氧化酶（HRP) 记D
[0122] 3. 2单克隆抗体的固定
[0123] 用BioDot XYZ3050三维喷点平台将实施例1制备的单克隆抗体2固定在硝酸纤 维素膜上。
[0124] 3. 3检测试剂盒的组成
[0125] 检测试剂盒包含有检测试纸条、样品处理液、样品处理管、样品保存液。
[0126] (1)检测试纸条（其侧向示意图见图1)，包括硝酸纤维素膜1、酶标垫2、底物垫3、 吸水垫4、展开液垫5、检测线6、质控线7、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9、支撑物10。
[0127] (2)样品处理液在样品处理瓶中。
[0128] (3)样品处理管。
[0129] (4)样品保存液在样品保存瓶中，为PBS缓冲液，用于暂时保存样品。
[0130] 所述检测试纸条包括样品供应区，样品供应区包括酶标垫2,其上吸附有实施例 3. 2制备的标记单克隆抗体1 ;底物供应区，底物供应区包括底物垫3 ;缓冲液供应单元，缓 冲液供应单元包括展开液垫5、底物缓冲液槽8、底物缓冲液9 ;检测区，检测区包括检测线 6、质控线7,在检测线6固定化有实施例1制备的固定单克隆抗体2,在质控线7固定化有 羊抗鼠多抗。硝酸纤维素膜1粘附在所述支撑物10的全段；以及检测样品11加入的位置 为所述酶标垫2的位置。
[0131] 检测试纸条固定在塑料外壳中，其上从左到右依次固定展开液垫5、底物垫3、酶 标垫2、吸水垫4。吸水垫4卡在硝酸纤维素膜1的顶端；酶标垫2位于硝酸纤维素膜1的 中段；底物垫3卡在硝酸纤维素膜1的底端，其上有干燥的酶底物。展开液垫5的上端覆盖 了底物垫3,且其下端位于底物缓冲液槽8的底端。底物缓冲液槽8的上面覆盖了一层铝箔 纸，以防止底物缓冲液9渗漏，上方为缓冲液按钮（图1中未标出）。检测线6位于硝酸纤 维素膜1的中上端，质控线7位于硝酸纤维素膜1的中上端，并位于检测线6的上游。
[0132] 当使用试剂盒时，先使用样品处理管预处理样品；然后将预处理样品加入酶标垫 2的位置，同时按下缓冲液按钮，缓冲液按钮控制缓冲液9通过展开液垫5向吸水垫4的层 析过程。如果预处理样品中含有犬细小病毒其将与酶标记单克隆抗体1结合，犬细小病毒 与酶标记单克隆抗体1结合体以及过量的酶标记单克隆抗体1在毛细管作用下向吸水垫4 方向迀移。当迀移的犬细小病毒与酶标记单克隆抗体1结合体到达检测线6位置时，被固 定于检测线6位置的固定单克隆抗体2捕获，从底物供应区迀移来的底物到达检测线6时， 与酶标记单克隆抗体1产生显色反应。同时，过量的酶标记单克隆抗体1继续迀移到质控 线7,被固定在质控线7位置的羊抗鼠多抗捕获，并与从底物供应区迀移来的底物产生显色 反应。
[0133] 检测标准：整个反应进行约30分钟，反应结束后，若质控线处并无条带，无论检测 线处是否有条带，检测过程均无效，在质控线处有条带的情况下，若检测线处有条带，则为 阳性，说明样品中存在A型流感病毒，否则为阴性，说明样品中不存在犬细小病毒。
[0134] 实施例4样品前处理
[0135] 4.1样品的采集
[0136] 主要采集的样品源于犬肛门，详情如下：
[0137] 使用微生物拭子采集犬肛门样品时，将拭子插入肛门I. 5-2cm并轻轻转动，以获 得病毒丰度较高的肛拭子样品；
[0138] 4. 2样品的处理
[0139] 将采集完的微生物拭子插入到样品处理管中，紧靠管子内壁旋转多次使样品尽可 能溶解在溶液中，最后使微生物拭子头折断留与瓶中。
[0140] 实施例5犬细小病毒酶免检测试剂盒的研宄
[0141] 犬细小病毒酶免检测方法为：
[0142] (1)将采集完的微生物拭子插入到样品处理管中，紧靠管子内壁旋转多次使样品 尽可能溶解在溶液中，最后使微生物拭子头折断留与瓶中。
[0143] (2)将处理过的样品液挤出一滴加入加样孔，同时迅速按下缓冲液按钮；
[0144] (3) 30分钟后在观察窗观察记录结果。
[0145] 5. 1犬细小病毒酶免检测试剂盒灵敏度测定
[0146] 测定犬细小病毒CVCC AV298株病毒液的HA，对病毒液进行一系列稀释，稀释度依 次为10' 10' 10' 10' 10' 10' ΚΓ7,然后用实施例3制备的试纸条进行检测，结果见表 5 ：
[0147] 表5犬细小病毒酶免检测试剂盒灵敏度测定
[0148]
[0149] 注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。
[0150] 犬细小病毒CVCC AV298株病毒液的HA为640,结合检测结果（表5)可知：犬细 小病毒酶免检测试剂盒的灵敏度为0. 064HA。
[0151] 5. 2犬细小病毒酶免检测试剂盒敏感性测定
[0152] 犬细小病毒酶免检测试剂盒检测5份CPV强阳性样品（P1-P5)，5份CPV弱阳性样 品（P11-P15)结果见表6 :
[0153] 表6犬细小病毒酶免检测试剂盒敏感性测定
[0154]
[0155] 注：+表示阳性反应。
[0156] 由表6可知，10份样品均为阳性，证明该试剂盒有良好的敏感型。
[0157] 5. 3犬细小病毒酶免检测试剂盒特异性测定
[0158] 犬细小病毒酶免检测试剂盒检测IO(Nl-NlO)份包含健康犬粪便、犬瘟热病毒阳 性犬粪便、犬轮状病毒阳性犬粪便、犬冠状病毒细胞毒样品以及英特威的犬四联、犬二联苗 稀释液样品，结果见表7:
[0159] 表7犬细小病毒酶免检测试剂盒特异性测定
[0160]
[0161] 注：_表示阴性反应。
[0162] 由表7可知，10份样品检测结果均为阴性，证明该试剂盒有良好的特异性。
[0163] 5. 4犬细小病毒酶免检测试剂盒重复性试验
[0164] 用三个连续批号试剂盒由3人对包括强阳性参考品10份（Pl-PlO)、弱阳性参考 品10份（P11-P20)和特异性参考品10份（Nl-NlO)的30份被检样品重复检测三次，统计 检测结果之间的符合率，用5个单批号试剂盒由1人对30份被检样品进行检测，用以评价 三批试剂盒的批间、批内可重复性，检验结果见表8-9。
[0165] 表8 30份被检样品的批间检测结果
[0166]
[0167]
[0168]
[0169] 注：+表示阳性，-表示阴性。
[0170] 由表8可知：三个连续批号试剂盒对30份被检样品重复检测三次，经统计三个批 号试剂盒批间检测结果之间的阳性符合率分别为98. 3%，阴性符合率分别为100%，说明 三批制品批间有良好的重复性。
[0171] 表9 30份被检样品的批内检测结果
[0172]
[0173]
[0174] 注：+表示阳性，-表示阴性。
[0175] 由表9可知：五个单批号试剂盒对30份被检样品进行检测，经统计批内检测结果 之间的阳性符合率分别为98%，阴性符合率分别为100%，说明试剂盒批内具有良好的重 复性。
[0176] 5. 5犬细小病毒酶免试剂盒保存期
[0177] 将三个连续批号试剂盒分别于37土 1°C放置6天后进行稳定性试验，即试剂盒热 稳定性试验；为了防止37±1°C热稳定性试验与2_8°C存放条件之间存在差异，我们又将试 剂盒在2-8°C分别存放6个月、9个月、12个月和15个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对 不同保存条件的试剂盒用30份被检样品进行检验，用以评价该制品的保存期。检测方法按 实施例5进行检测。
[0178] 表10试剂盒热稳定性试验结果
[0179]
[0180] 表11试剂盒实时稳定性试验结果
[0181]
[0182] 本试剂盒在37± 1°C条件下保存，贮存7天；在2_8°C规定条件下保存，贮存15月， 仍能通过成品试剂盒质控标准，表明试剂盒有效期试验期间质量稳定，保存期至少可达12 个月。
[0183] 实施例6酶免检测试剂盒与现有方法比对
[0184] 6. 1犬细小病毒酶免检测试剂盒与HA方法的比较
[0185] 用犬细小病毒酶免检测试剂盒检测HA阳性样品10份（Pl-PlO)，结果见表12 :
[0186] 表12犬细小病毒酶免检测试剂盒敏感性测定
[0187]
[0188] 注：+表示阳性，-表示阴性。
[0189] 由表12可知，检测结果表明都为阳性，两种方法阳性符合率为100%。
[0190] 6. 2犬细小病毒酶免检测试剂盒与进口试剂盒的比较
[0191] 将已知病毒量（HA滴度640)的犬细小病毒CVCC AV298株病毒液做10'10'10_5各稀释度稀释，同时用犬细小病毒酶免检测试剂盒和韩国安捷胶体金试纸条进行检测，每 个稀释度重复三次，结果见表13。
[0192] 表13犬细小病毒酶免检测试剂盒与进口试纸条检测不同稀释度病毒液比较
[0193]
[0194] 注：+表示阳性，-表示阴性。
[0195] 由表13可知，犬细