专利名称：一种测定奶体细胞数的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定奶体细胞数的方法。
背景技术：
奶制品是营养最丰富的食品之一，在我国的发展速度极快；原料奶则是加工一切奶制品的基础。在原料奶的品质指标中，体细胞数是一个重要的品质和卫生指标。体细胞数是指每毫升奶中的细胞总数，体细胞中的98％～99％是白细胞(即巨噬细胞、嗜中性白细胞和淋巴细胞)，其他1％～2％是乳腺组织脱落的上皮细胞。因此原料奶体细胞的主要组成为白细胞，其在原料奶中的数量直接与原料奶的品质和卫生状态有关；因为，只有在细菌感染或其它刺激的条件下，动物本身才会产生应急，产生大量的白细胞，进行抵御。因此，牛奶生产中，原料奶中的体细胞数与奶牛感染乳房炎、特别是隐性乳房炎有直接的关系，直接关系到原料奶的品质。同时，在加工工艺中，处理体细胞数量多的牛奶与处理一般的奶是不一样的。
例如奶牛体细胞数增加将引起奶牛产奶量下降，这是由于侵入乳房的细菌及其分泌的毒素损伤乳腺组织的结果；同时还使牛奶中不欢迎脂肪酶及血纤维蛋白酶奶乳酸菌繁殖，从而减少奶品存储时间。血纤维蛋白酶还会减少牛奶中酪蛋白含量，从而影响干酪产量。即使在冷藏条件下，这些酶仍然会发挥作用，影响奶制品的质量。因此，牛奶中体细胞数是奶牛乳房健康状况和牛奶质量的重要指标，目前世界上大部分国家将牛奶体细胞数作为牛奶收购标准之一。
如上所述，牛奶体细胞数与奶牛乳房炎密切相关，与牛奶的品质密切相关，这两者足以影响牛奶的质量；因此牛奶体细胞数是奶牛养殖和管理的一个重要指标，目前世界各奶业发达国家都将牛奶体细胞数作为牛奶收购的主要质量指标和诊断隐性乳房炎的指标，其测定技术对于乳品行业的发展十分重要。目前，测定奶体细胞数的方法如下显微镜镜检法是测定奶体细胞数的标准方法，但制备样品计数和镜检显得费时、费力，不适合于作为现场快速和批量较大时使用；荧光显微镜计数法的制片、镜检要占许多时间，不适合于大量快速检测应用；加利福尼亚乳房炎试验(CMT)是凭经验，不能得到具体的体细胞数，只能划分出一个大致的范围；高速体细胞计数仪售价极贵，不能普及使用。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种成本低廉、操作简便易行、能快速准确获知结果的测定奶体细胞数的方法。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的提供一种测定奶体细胞数的方法，依次包括以下步骤1)、在原料奶中加入任意投料比的显色试剂，于强酸性条件下在沸水浴中加热使原料奶呈现颜色，此显色试剂是以DNA染色剂为基础配制而成的试剂；2)、将上述带色原料奶作为样品置于比色装置中，采用D65作为标准光源，使样品与标准光源间的距离为45cm；在上述条件下用图像摄入设备获得所述样品的颜色信息；
3)、将上述颜色信息换算成相应的AdobeRGB颜色系统分量平均值R8代表红色分量平均值，G8代表绿色分量平均值，B8代表蓝色分量平均值；或者将上述颜色信息换算成相应的RGB颜色系统分量平均值R代表红色分量平均值，G代表绿色分量平均值，B代表蓝色分量平均值；或者将上述颜色信息换算成相应的国际照明委员会(CIE)XYZ颜色系统三刺激值X代表红原色值，Y代表绿原色值，Z代表蓝原色值；或者将上述颜色信息换算成相应的国际照明委员会(CIE)L*a*b*颜色系统分量平均值L*代表明度值；4)、每毫升样品的体细胞含量T可采用以下计算公式中的任意一种T＝-2.1299R8+285.5、T＝-2.7935G8+342.89、T＝-3.3999B8+416.14；T＝-647.68R+155.74、T＝-952.73G+187.12、T＝-1129B+221.35；T＝-807.55X+170.66、T＝-852.99Y+178.16、T＝-1010Z+216.72；或者T＝-6.2072L*+334.06。
作为本发明的测定奶体细胞数的方法的一种改进上述以DNA染色剂为基础配制而成的试剂为二苯胺试剂、吲哚试剂或甲基绿试剂。
在原料奶中可以任意的体积投料比加入显色试剂，例如原料奶∶显色试剂＝1∶2。
本发明中的原料奶是指生产中作为原料使用的奶，如新鲜的牛奶、羊奶、山牛奶、加防腐剂或冷藏的奶等等。
本发明中所使用的图像摄入设备可以是各种适用的摄入设备，例如数码相机、扫描仪、摄像机、摄像头、色差计等等。
本发明的工作原理如下当产奶体的乳腺受伤害或感染时会大量增加体细胞，体细胞与乳中的其它细胞或细菌相比含有大量的脱氧核糖核酸(DNA)；因此，选择显色反应试剂在酸性或碱性条件下将体细胞的膜和细胞核壁溶解，就能释放出DNA，大量的DNA与显色剂发生化学反应，生成有色物质，使样品溶液呈现一定的颜色，在一定的光照条件下，获取其反射光的颜色信息，颜色深浅以及由此计算出的颜色平均分量值的大小与体细胞数的数量呈线性关系，因此，测定并计算此奶样品溶液的颜色信息即可准确测定原料奶中体细胞数量。
本发明采用化学反应试剂与奶中体细胞核的DNA发生化学反应从而显色的原理测定奶体细胞数，它比公认方法的显微镜镜检法、荧光显微镜计数法的测定速度要快50倍以上，所用的设备和仪器简便易行，价格便宜，便于在收奶站和中小牛奶企业中推广应用。
图1是奶体细胞数T与AdobeRGB颜色系统中平均分量值R8的关系示意图；图2是奶体细胞数T与AdobeRGB颜色系统中平均分量值G8的关系示意图；图3是奶体细胞数T与AdobeRGB颜色系统中平均分量值B8的关系示意图；图4是奶体细胞数T与RGB颜色系统中平均分量值R的关系示意图；图5是奶体细胞数T与RGB颜色系统中平均分量值G的关系示意图；图6是奶体细胞数T与RGB颜色系统中平均分量值B的关系示意图；图7是奶体细胞数T与CIE的XYZ颜色系统中三刺激值X的关系示意图；
图8是奶体细胞数T与CIE的XYZ颜色系统中三刺激值Y的关系示意图；图9是奶体细胞数T与CIE的XYZ颜色系统中三刺激值Z的关系示意图；图10是奶体细胞数T与CIE的L*a*b*颜色系统中L*的关系示意图。
具体实施例方式
参照上述附图，对本发明的具体实施方式
进行详细说明。
实施例1、一种测定奶体细胞数的方法，分别进行以下步骤1)、取2ml新鲜牛奶，在其中加入4毫升二苯胺试剂，混合均匀后；于强酸性条件下置沸水浴中加热10-15分钟，使原料奶呈现颜色，2)、冷却后将上述带色原料奶作为样品注入比色杯中，采用D65作为标准光源，使样品与标准光源间的距离为45cm，在保证上述实验条件的前提下，在特制的灯箱内用数码相机摄入图像，获得样品的颜色信息；3)、再用专用图像颜色处理软件计算其AdobeRGB颜色系统中各颜色分量R8、G8、B8的平均值。此时，R8代表红色分量平均值，G8代表绿色分量平均值，B8代表蓝色分量平均值。
4)、每毫升样品的体细胞含量T可采用下列公式中的任意一种进行计算T＝-2.1299R8+285.5；T＝-2.7935G8+342.89；T＝-3.3999B8+416.14。
T与R8关系如图1所示，从此图1得知R8与T的相关系数为0.9817。
T与G8关系如图2所示，从此图2得知G8与T的相关系数为0.9834。
T与B8关系如图3所示，从此图3得知B8与T的相关系数为0.9832。
注以上相关系数指的是两个变量间线性相关强弱的程度，数值越接近1，则线性关系越强。
实施例2、一种测定奶体细胞数的方法，分别进行以下步骤步骤1)、2)同实施例1；3)、再用专用图像颜色处理软件计算其RGB系统中各颜色分量R、G、B的平均值。此时，R代表红色分量平均值，G代表绿色分量平均值，B代表蓝色分量平均值。
4)、每毫升样品的体细胞含量T可采用下列公式中的任意一种进行计算T＝-647.68R+155.74；T＝-952.73G+187.12；T＝-1129B+221.35；T与R关系如图4所示，从此图4得知R与T的相关系数为0.9589。
T与G关系如图5所示，从此图5得知G与T的相关系数为0.9869。
T与B关系如图6所示，从此图6得知B与T的相关系数为0.9896。
注以上相关系数指的是两个变量间线性相关强弱的程度，数值越接近1，则线性关系越强。
实施例3、一种测定奶体细胞数的方法，分别进行以下步骤步骤1)、2)同实施例1；3)、再用专用图像颜色处理软件计算其CIE的XYZ颜色系统三刺激值X代表红原色值，Y代表绿原色值，Z代表蓝原色值；4)、每毫升样品的体细胞含量可采用下列公式中的任意一种进行计算T＝-807.55X+170.66；T＝-852.99Y+178.16；
T＝-1010Z+216.72；T与X关系如图7所示，从此图7得知X与T的相关系数为0.9782。
T与Y关系如图8所示，从此图8得知Y与T的相关系数为0.986。
T与Z关系如图9所示，从此图9得知Z与T的相关系数为0.9919。
注以上相关系数指的是两个变量间线性相关强弱的程度，数值越接近1，则线性关系越强。
实施例4、一种测定奶体细胞数的方法，分别进行以下步骤步骤1)、2)同实施例1；3)、再用专用图像颜色处理软件计算其CIE(国际照明委员会)L*a*b*颜色系统分量平均值L*代表明度值；4)、每毫升样品的体细胞含量可采用下列公式进行计算T＝-6.2072L*+334.06。
T与L*关系如图10所示，从此图10得知L*与T的相关系数为0.9898。
注以上相关系数指的是两个变量间线性相关强弱的程度，数值越接近1，则线性关系越强。
为了证明本发明的测定方法具有快速、正确率高的优点，发明人选用了5份不同的原料奶作为样品，进行了如下的对比实验(本次对比实验中均采用了实施例1的测定方法，其余实施例2～4的实施方法可依此类推。)实验1、选用样品1采用本发明测得R8＝114计算得T＝42.7万个/毫升；G8＝108计算得T＝41.2万个/毫升；
B8＝110 计算得T＝42.1万个/毫升。
采用显微镜镜检法，测得T＝41万个/毫升。
实验2、选用样品2R8＝133.4计算得T＝1.37万个/毫升；G8＝122.2计算得T＝1.52万个/毫升；B8＝121.9计算得T＝1.7万个/毫升。
采用显微镜镜检法，测得T＝1.5万个/毫升。
实验3、选用样品3R8＝96 计算得T＝81.5万个/毫升；G8＝92.7 计算得T＝84万个/毫升；B8＝97 计算得T＝86.3万个/毫升。
采用显微镜镜检法，测得T＝83万个/毫升。
实验4、选用样品4R8＝78 计算得T＝119.4万个/毫升；G8＝81.2 计算得T＝116万个/毫升；B8＝87.9 计算得T＝117.3万个/毫升。
采用显微镜镜检法，测得T＝115万个/毫升。
实验5、选用样品5R8＝126.8计算得T＝15.4万个/毫升；G8＝118 计算得T＝13.3万个/毫升；B8＝118 计算得T＝14.9万个/毫升。
采用显微镜镜检法，测得T＝14万个/毫升。
以上实验证明采用本发明的测定方法，在大大提高测定速度的前提下，所得结果基本等同于利用显微镜镜检法所得的结果。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种测定奶体细胞数的方法，其特征是依次包括以下步骤1)、在原料奶中加入任意投料比的显色试剂，于强酸性条件下在沸水浴中加热使原料奶呈现颜色，所述显色试剂是以DNA染色剂为基础配制而成的试剂；2)、将上述带色原料奶作为样品置于比色装置中，采用D65作为标准光源，使样品与标准光源间的距离为45cm；在上述条件下用图像摄入设备获得所述样品的颜色信息；3)、将上述颜色信息换算成相应的AdobeRGB颜色系统分量平均值R8代表红色分量平均值，G8代表绿色分量平均值，B8代表蓝色分量平均值；或者将上述颜色信息换算成相应的RGB颜色系统分量平均值R代表红色分量平均值，G代表绿色分量平均值，B代表蓝色分量平均值；或者将上述颜色信息换算成相应的国际照明委员会XYZ颜色系统三刺激值X代表红原色值，Y代表绿原色值，Z代表蓝原色值；或者将上述颜色信息换算成相应的国际照明委员会L*a*b*颜色系统分量平均值L*代表明度值；4)、所述每毫升样品的体细胞含量T可采用以下计算公式中的任意一种T＝-2.1299R8+285.5、T＝-2.7935G8+342.89、T＝-3.3999B8+416.14；T＝-647.68R+155.74、T＝-952.73G+187.12、T＝-1129B+221.35；T＝-807.55X+170.66、T＝-852.99Y+178.16、T＝-1010Z+216.72；或者T＝-6.2072L*+334.06。
2.根据权利要求1所述的一种测定奶体细胞数的方法，其特征是所述以DNA染色剂为基础配制而成的试剂为二苯胺试剂、吲哚试剂或甲基绿试剂。
全文摘要
本发明公开了一种测定奶体细胞数的方法，依次包括以下步骤1)在原料奶中加入任意投料比的显色试剂，于强酸性条件下在沸水浴中加热使原料奶呈现颜色，显色试剂是以DNA染色剂为基础配制而成的试剂；2)将上述带色原料奶作为样品置于比色装置中，采用D65作为标准光源，使样品与标准光源间的距离为45cm；在上述条件下用图像摄入设备获得所述样品的颜色信息；3)将上述颜色信息换算成相应的颜色系统分量平均值，4)利用计算公式进行计算。本发明的测定奶体细胞数的方法，成本低廉、操作简便易行、能快速准确获知结果。
文档编号G01N21/27GK1789983SQ20051006175
公开日2006年6月21日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者叶兴乾, 程文健, 刘东红, 陈健初, 童军锋 申请人:浙江大学, 杭州三博科技有限公司