制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0066] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明实施例中所用的碳酸盐缓冲液，pH值为 9. 6,其IL体积配方为：Na2CO3L 59g、NaHC032. 93g，但该实施方式无论在任何情况下均不构 成对本发明的限定。
[0067] 本发明实例中所用的样品保存液为PBS磷酸缓冲液，pH值为7. 4,其IL体积配方 为：NaCl 8. 0g、KCl 0· 2g、Na2HPO4 · 12H20 2. 9g、KH2PO4 0· 24g，终浓度为 10000IU/mL 的青 霉素、8000IU/mL的链霉素和5000IU/mL的卡那霉素，但该实施方式无论在任何情况下均不 构成对本发明的限定。
[0068] 本发明实施例中所用的 PBS(pH7. 2,0· 15mol/L)为 Na2HPO4 · 12H20 39. 7g ; NaH2PO4 ·2Η20 6. 72g ;NaCl 9g ;蒸馏水加至1000ml。充分溶解后，混合均匀，121°C 30min高 压灭菌。
[0069] 本发明实施例中的酶标抗体以辣根过氧化物酶（HRP)为例进行标记，但该实施方 式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。
[0070] 本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
[0071] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说 明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0072] 实施例1抗犬细小病毒单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
[0073] I. 1抗犬细小病毒单克隆抗体的制备和纯化
[0074] 将犬细小病毒 CVCC AV298 株按照 Harlow E 等（Harlow E, Lane D.Antibodies:a laboratory manual (M) . New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998, 139-312)文献的操作方法制备杂交瘤细胞10B11株、杂交瘤细胞10H4株，进一 步分别制备并纯化抗犬细小病毒单克隆抗体10B11、抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。
[0075] 其中，杂交瘤细胞10B11株的保藏号为CCTCC No:C201578,保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏时间为2015年05月20日，其分泌抗犬 细小病毒单克隆抗体10B11 ;杂交瘤细胞10H4株保藏号为CCTCC N〇:C201579,保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉?武汉大学，保藏时间为2015年05月20日，所 分泌抗犬细小病毒单克隆抗体10H4。
[0076] 1. 2抗犬细小病毒单克隆抗体的鉴定
[0077] 1. 2. 1单克隆抗体类型和亚类的鉴定
[0078]运用 Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit 并参照说明书对抗体的亚 型进行鉴定。鉴定结果见表1 :
[0079] 表1各单克隆抗体类型的鉴定 [0080]
[0081] 注：+表示阳性反应，-表示阴性反应。
[0082] 由表1可知，单克隆抗体10H4、IOBll重链亚型都为IgG2a，轻链类型都为kappa。
[0083] 1. 2. 2单克隆抗体特异性的鉴定
[0084] 按照秦海斌（秦海斌等，犬细小病毒血凝的检测和血凝抑制试验方法的优化，中 国比较医学杂志，2009,19(7) :49-52)所提供的HI方法分别测定单克隆抗体10H4、10B11 与水紹细小病毒MEV、猫细小病毒FPV是否具有交叉反应性。
[0085] 测定结果显示：单克隆抗体10H4、10B11与MEV、FPV均无交叉反应，表明这2株单 克隆抗体均是抗犬细小病毒的特异性单克隆抗体。
[0086] 1. 3纯化单克隆抗体的检验
[0087] I. 3. 1纯化单克隆抗体的外观
[0088] 室温下，肉眼观察可见纯化抗体呈无色澄清状态，未见絮状物沉淀。
[0089] 1. 3. 2无菌试验
[0090] 采用无菌检验法，取纯化后的单克隆抗体原料接种IOmL/管的营养琼脂斜面培养 基、改良马丁培养基和硫乙醇酸盐培养基各2管（接种量为0. 5mL/管）。接种后的硫乙醇 酸盐培养基及营养琼脂斜面培养基各一管置于30-35?培养，另一管于20-25?培养。改良 马丁培养基置于20-25?培养。同时以无菌生理盐水同法操作做阴性对照。培养14天后均 未观察到培养基中有微生物生长，表明单克隆抗体10H4、10B11原料符合无菌要求。
[0091] 1.3. 3单克隆抗体纯度
[0092] 采用SDS-PAGE电泳鉴定，上样量为10 μ g，检测结果如图2所示。
[0093] 结果表明：单克隆抗体10H4、10B11的纯度均不低于90%。
[0094] 1. 3. 4单克隆抗体相对亲和力的测定
[0095] 对纯化的单克隆抗体进行其相对亲和力的测定：将纯化开始作倍比稀释，分别加 入包被有CPV抗原（1:200倍V/V稀释）的96孔酶标板，同时设阴性血清和空白对照37 °C反 应30分钟，用PBST洗板3次，拍干；每孔加入山羊抗小鼠 IgG-HRP (I: I X IO4稀释）100 μ L/ 孔，反应过后洗涤同上，每孔加入100 μ L/孔TMB (四甲基联苯胺）底物溶液显色，用2m〇L/ LH2SO4 (50 μ L/孔）终止反应，读取OD45tllJI。结果以与包被抗原出现50%结合时的单克隆 抗体的蛋白含量，即为该株单克隆抗体的相对亲和力。
[0096] 以纯化单克隆抗体的稀释度与其相对应的OD45tlnm值作图，曲线趋于平坦时的 OD45to作为100%，即抗原与单克隆抗体的结合已达到饱和状态。取曲线上50%饱和度所对 应的单克隆抗体浓度，即为该株单克隆抗体的相对亲和力，亲和力越大，所需单克隆抗体的 量越低。计算结果表明：单克隆抗体10H4、IOBll的相对亲和力均为1:5120。
[0097] 1. 3. 5单克隆抗体HI效价的测定
[0098] 参照犬细小病毒检测方法（GB/T 14926. 57-2008)进行血凝和血凝抑制实验。 采集纯白色，健康状况良好的架子猪全血与等体积红细胞保存液混合，用PBS(pH7. 2， 0. 15mol/L)洗绦5次，每次均以1500rpm离心5min，最后一次为1500rpm离心10min，洗绦 后用PBS配制成体积分数为1 %红细胞悬液，4°C保存备用。
[0099] 将待检样品，使用PBS (pH7. 2,0. 15mol/L)做1:10倍稀释，在96孔V型板1-12孔 均加入50 μ L PBS，将待检CPV病毒悬液50 μ L加入第1孔，混匀。从第1孔吸取50 μ L混合 液加入第2孔，混匀后吸取50 μ L到第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，最后弃去50 μ L， 第12孔为血球对照；每孔均加入50 μ L的1 %的猪红细胞悬液（将猪红细胞悬液充分摇匀 后加入），震荡均匀，在4°C下静置2h后观察结果。将微量反应板倾斜，观察红细胞有无呈 泪滴状流淌。在红细胞对照成立的条件下，以50%出现凝集的病毒最高稀释倍数为血凝素 (HA)的效价。
[0100] 根据HA结果制备16单位抗原。在微量反应板的1-11孔加入25 μ LPBS，第12孔 加入50 μ L PBS。吸取10倍稀释的CPV单克隆抗体25 μ L，分别加入第1孔和第11孔，第 1孔充分混匀后吸取25 μ L于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，最后弃去25 μ L，第11孔为 抗体对照，第12孔为血球对照。第1至10孔均加入25 μ L含16单位混匀的病毒抗原液， 37°C静置30min。每孔均加入50 μ L 1 %的猪红细胞悬液（将猪红细胞悬液充分摇匀后加 入），震荡均匀，4°C静置2h后观察结果。将微量反应板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流 淌。在对照系统成立的条件下，以完全抑制16单位抗原的样品最高稀释倍数为该样品的血 凝抑制（HI)滴度。
[0101] 表2单克隆抗体的HI效价
[0102]
[0103] 1. 3. 6单克隆抗体中和活性的测定
[0104] 按常规方法分别测定CPV的TCID5tl，然后采用固定病毒稀释抗体法，分别测定单克 隆抗体IOBll、10H4对CPV的中和效价。
[0105] 将腹水进行1:100开始倍比（2倍）稀释至1:12800倍，用含100个TCID5tl的病毒 与倍比稀释后的腹水等量混合，每个滴度重复4孔。同时设健康细胞、单克隆抗体和病毒对 照，置37°C作用Ih后，再将细胞消化后计算，用含8 %血清的1640稀释至28万细胞/mL， 100 μ L/孔加入以上96孔细胞培养板，于37°C、5% CO2培养箱培养5d，观察细胞病变情况， 病毒对照孔应符合IOOTCID5ci接种孔应全部病变，0.1 TCID5tl接种孔应全部无病变。在各种 对照都成立的情况下，再根据细胞病变情况计算出腹水的中和效价。
[0106] 表3单克隆抗体IOBll、10H4中和效价
[0107]
[0108] 通过上述试验证明该单克隆抗体具有很好的中和病毒的能力，中和效价均在 1:5120以上。表明该株单克隆抗体所对应的抗原表位是比较重要的抗原表位，可以用于开 发制备预防和治疗犬细小病毒病的药物，并用单克隆抗体提供很有价值的保护性抗原基因 序列相关信息。
[0109] 实施例2单克隆抗体的配对
[0110] 2. 1单克隆抗体配对模式的选择
[0111] 筛选单克隆抗体配对组合时，主要考虑以下几个因素：一是单克隆抗体的活性； 二是单克隆抗体与除犬细小病毒外其他病毒是否存在非特异性反应；三是本底显色。
[0112] 2. 2单克隆抗体活性检测
[0113] 选择犬细小病毒CVCC AV298株，稀释到0. 01HA，对于不同搭配模式进行检测，结 果见表4 :
[0114] 表4单克隆抗体搭配检测
[0115]