本发明属于兽药残留分析和免疫分析检测技术领域，具体涉及一种能识别三氮脒药物的单克隆抗体制备及其酶联免疫检测试剂盒。本发明的单克隆抗体是由申请人建立的杂交瘤细胞株C2F3C2所分泌。本发明公开了特异性单克隆抗体、包被原、免疫原的制备方法和酶联免疫检测方法。与现有技术相比，本发明的试剂盒和方法具有简便、快速、灵敏、准确等优点，能同时检测动物源食品，尤其是肉类产品、水产品、蜂产品及奶制品中三氮脒药物残留总量。
背景技术：
三氮脒又名血虫净、贝尼尔，为黄色或金黄色结晶性粉末，无臭，味微苦，易溶于水，微溶于乙醇，遇日光易变色，水溶液偏酸性。在我国三氮脒是一种兽医临床上应用广泛的抗血液原虫药，对各种家畜的锥虫病、巴贝斯梨形虫病、泰勒梨形虫病等均有良好的疗效。同时还有报道用于治疗猪的附红细胞体感染。三氮脒能抑制虫体的DNA合成，并能与虫体细胞核形成不可逆性结合，使虫体不能分裂繁殖，从而产生抗虫作用。从已有的临床报道看，该药安全范围小，连续使用或用量较大时，动物易出现不良反应，三氮脒进入动物体内后，吸收、分布迅速，消除缓慢，主要通过肾以原形排出体外，在体内几乎没有代谢。三氮脒在非洲、南美洲等锥虫病、巴贝斯虫病高发区域广泛使用，在我国北方也有一定程度的使用，为了减少药物借由食物链进入人体的机会，我国和世界卫生组织都规定了三氮脒在动物源食品中的最大残留量。本发明基于酶联免疫测定法（ELISA），研制了高灵敏的三氮脒单克隆抗体，在此基础之上，形成了用于检测动物源食品三氮脒残留的试剂盒产品，能同时检测动物源食品，尤其是肉类产品、水产品、蜂产品及奶制品中三氮脒的残留总量。
技术实现要素：
（一）本发明要解决的技术问题
本发明目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带、灵敏度高的用于动物源食品中三氮脒残留快速检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、灵敏、适合大量筛选的定量检测方法。
（二）本发明的技术方案
为解决所述问题，本发明综合采用蛋白质偶联和生物化学制备等技术制备了识别三氮脒单克隆抗体。将三氮脒与载体蛋白偶联制备成人工免疫抗原和包被抗原；用此人工免疫抗原免疫动物制备三氮脒单克隆抗体；将三氮脒包被吸附于固相载体上；将检测用的试剂配置成可直接使用的试剂。使用时，将三氮脒标准品或待测样品加入三氮脒药物抗体工作液，待测样品中残留的三氮脒药物与固相载体上包被的三氮脒药物抗原竞争三氮脒类药物单克隆抗体，再加入酶标记二抗进行酶活性放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中三氮脒药物残留呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中三氮脒类药物的含量。
本酶联免疫检测试剂盒由下列成分组成：
（1）包被了三氮脒抗原的酶标板
（2）三氮脒药物抗体
（3）三氮脒标准品
（4）标准品稀释液
（5）酶标二抗
（6）底物显色液
（7）洗涤缓冲液
（8）终止液
其中包被了三氮脒药物抗原的酶标板有24孔、或48孔、或96孔。
其中，三氮脒抗原及氟三氮脒单克隆抗体的制备方法为：
（1）三氮脒抗原的合成
将载体蛋白（BSA）的羧基用乙二胺活化，再通过水溶性碳化二亚胺法（EDC）将三氮脒与活化载体蛋白（BSA）的氨基相偶联制备三氮脒抗原。本发明合成的免疫原采用免疫电泳测定其纯度为98.6%。
（2）三氮脒单克隆抗体制备
动物免疫程序：采用三氮脒为免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫剂量为50 μg，首次免疫为含弗氏完全佐剂的免疫原，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，可以得到血液里含有三氮脒抗原特异性抗体的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞。
细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，筛选能稳定分泌三氮脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将BALB/C小鼠腹腔注入灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水，经硫酸铵盐析纯化，分装待用，-20℃保存。
其中，本发明的试剂盒所用试剂的配制方法如下：
（1）三氮脒标准溶液配制：准确称取标准三氮脒1 mg，精确到0.00001 g，配成1 μg/mL标准品溶液母液；使用时，用标准品稀释液稀释成所需的浓度（10-1000 ng/mL）；
（2）标准品稀释液为0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.9%NaCl的缓冲液；
（3）包被缓冲液为0.1 mol/L碳酸缓冲液，pH7.8，含0.05% NaN3，0.9% NaCl；
（4）封闭液为0.05 mol/L Tris-HCl溶液，pH8.0，含0.5% BSA，0.9% NaCl，0.04% NaN3；
（5）洗涤缓冲液为0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.9% NaCl，0.04% Tween20；
（6）三氮脒单克隆抗体工作液：将抗体用pH7.4，0.02 mol/L，含1%卵清蛋白的磷酸盐缓冲液稀释成蛋白浓度为0.1-1 ug/L使用；
（7）酶标二抗工作液：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；
（8）底物显色液A液：过氧化氢或过氧化脲；
（9）底物显色液B液：邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TMB）；
（10）底物显色液对硝基磷酸盐缓冲液：pH8.1，含有MgCl2 0.01% 100 mmol/L Tris-HCl；
（11）终止液：2 mol/L硫酸；
其中，酶标板的包被方法为：包被抗原（CIP-BSA）以合适浓度与包被缓冲液混合，添加于酶标板中且置于室温下反应14 h。用洗涤缓冲液洗涤3次后，用封闭缓冲液在37℃进行封闭（约1 h），去除孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
本发明试剂盒的检测原理和检测方法：
将三氮脒抗原偶联物包被吸附于固相载体上，加入三氮脒标准品或待测样品，并加入三氮脒抗体工作液，待测样品中残留的三氮脒与固相载体上包被的三氮脒抗原竞争三氮脒单克隆抗体，洗涤去除游离的抗原抗体复合物，再加入酶标记二抗进行酶活性放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中三氮脒残留呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中三氮脒的含量。
（三）本发明的有益效果
本发明所制备的能识别三氮脒的酶联免疫试剂盒，具有简便、快速、灵敏、准确等特点，可用于定性或定量检测动物组织、血清、尿液、蜂蜜、虾、水产品等样品中氟喹诺酮类药物的残留量；其最低检测限为0.01 ng/g，检测时间仅需3小时。本方法平均回收率为97-121%，批内误差小于8%，批间误差小于13%。
本发明的试剂盒采用高特异性的三氮脒单克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少操作步骤，节省时间；同时，由于三氮脒单克隆抗体识别谱广泛，使得产品能同时检测动物源食品，尤其是肉类产品、水产品、蜂产品及奶制品中三氮脒残留总量。
具体实施方式
实施例1 试剂盒组分的制备
1、抗原的合成
a、取载体牛血清白蛋白（BSA）10 g 溶于35 mL pH9.6 碳酸盐缓冲液中，加入10g 乙二胺进行活化；
b、取三氮脒1 g溶于10 ml 0.5 M的氢氧化钠溶液中；
c、取1 g碳化二亚胺溶于5 ml纯水，然后加到三氮脒溶液中室温搅拌反应3小时；
d、将活化的载体蛋白BSA滴加到三氮脒溶液中4℃搅拌反应过夜；
e、将反应完所获得的人工抗原对0.1 M的PBS缓冲液透析5天，每天更换缓冲液4次；将获得的纯化的人工抗原经超滤浓缩或冻干保存。
2、三氮脒单克隆抗体制备
a、动物免疫程序：采用三氮脒人工抗原为免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫剂量为50 μg，首次免疫为含弗氏完全佐剂的免疫原，颈背部皮下多点注射，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐剂的免疫原加强免疫，前后共四次，可以得到血液里含有氟喹诺酮类药物三氮脒特异性抗体的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾细胞；
b、细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞，按照5:1的比例与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞杂交融合，制备杂交瘤细胞，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，筛选能稳定分泌三氮脒单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
c、单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将BALB/C小鼠腹腔注入0.5 mL灭菌石蜡油，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞，7-10天后采集腹水，经硫酸铵盐析纯化，分装待用，-20℃保存。
3、酶标二抗的制备
将辣根过氧化物酶（HRP）与羊抗鼠二抗进行偶联，方法如下：
a、8 mg辣根过氧化物酶溶解于2 mL蒸馏水中；
b、加入现配制的100 mmol/L NaIO4溶液0.4 mL，室温搅拌反应20分钟；
c、在4℃条件下，用1 mmol/L醋酸盐缓冲液透析过夜；
d、加入pH8.6，0.5 mol/L磷酸盐缓冲液40 ul和含有羊抗鼠二抗蛋白IgG 16 mg的pH8.6，5 mol/L磷酸盐缓冲液2 mL，室温搅拌反应5小时；
e、加入现配制的NaBH4水溶液（1 mol/L）0.1 mL 4℃反应5小时；
f、纯化保存。
4、酶标板的制备
a、用包被缓冲液将包被抗原稀释至0.05 μg/mL；
b、于酶标板中每孔加入150 μl，且置于室温下反应14 h；
c、去除包被液，用洗涤缓冲液洗涤3次后，用封闭缓冲液150 μl在37℃进行封闭（约1 h），去除孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例2用于一种快速检测动物源食品中三氮脒残留的酶联免疫试剂盒的组建
本酶联免疫检测试剂盒由下列成分组成：
（1）包被了三氮脒的酶标板；
（2）蛋白浓度为0.5 ug/L的三氮脒单克隆抗体工作液；
（3）浓度为1 μg/mL三氮脒标准品；
（4）标准品稀释液：0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.9%NaCl的缓冲液；
（5）用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠酶标二抗工作液；
（6）底物显色液A液位过氧化氢，底物显色液B液位邻苯二胺；
（7）洗涤缓冲液为0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.9% NaCl，0.04% Tween20。
（8）终止液为2 mol/L硫酸。
实施例3 样品中三氮脒残留的检测
1、样品前处理
a、乳制品：脱脂奶可用PBS缓冲液按照脱脂奶：PBS比例为1:10稀释后直接测定，全脂奶需要离心去除脂肪后，再按照1：10的比例稀释后测定；
b、组织样本：用匀浆器将精肉或内脏组织样本匀浆，准确称量4 g样品，加入4 mL乙酸乙酯，振荡10分钟，室温4000 rpm/min离心15分钟，取出2 mL上层液体，在氮气流下50-60℃干燥，加入1 mL正己烷溶解干燥的残留物，再加1 mL标准品稀释液强烈振荡1 min，室温4000 rpm/min离心5分钟，去除上层油相，取下层水相50 μl进行测定；
c、尿液：取2 mL尿液至离心管中，加入4 mL乙酸乙酯，振荡5分钟，室温4000 rpm/min离心5分钟，取出2 mL上层液体，在氮气流下50-60℃干燥，加1 mL标准品稀释液振荡溶解1 min，取50 μl进行测定；
d、血清样本：取1 mL尿液至离心管中，加入2 mL乙酸乙酯，振荡5分钟，室温4000 rpm/min离心5分钟，取出2 mL上层液体，在氮气流下50-60℃干燥，加1 mL标准品稀释液振荡溶解1 min，取50 μl进行测定；
e、蜂蜜：取2 g蜂蜜，于离心管中用4 mL去离子水溶解。加入4 mL乙酸乙酯，振荡10分钟，室温4000 rpm/min离心10分钟，取出2 mL上层液体，在氮气流下50-60℃干燥，加1 mL标准品稀释液振荡溶解1 min，取50 μl进行测定。
2、用试剂盒进行检测
配制浓度为1000 ng/mL三氮脒母液，进行倍比稀释，分别稀释为0，0.005，0.01，0.05，0.1，0.25，0.5，1，2.5，5，10，20 ng/mL 11个浓度的标准品，按照100 uL标准品或待测样品和50 uL 三氮脒单克隆抗体工作液共150 uL添加于包被有三氮脒的酶标板微孔中，于25℃进行竞争反应1 h。竞争反应结束后，倒出孔中液体，每孔加入250 uL洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸吸干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗工作液100 uL，用盖板膜封板，于25℃恒温反应30 min。取出酶标板，如前述洗板5次。每孔加入底物显色液A液50 uL，再加B液50 uL，轻轻震荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值（OD值）。
结果分析：
测量吸光度值（OD值）并绘制标准曲线，所测标准品的吸光度值（OD值）对应三氮脒浓度作标准曲线图，相对应每一个样品中三氮脒的浓度可以从标准曲线上读出，从而得到所测样品的三氮脒含量。