专利名称：动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法
技术领域：
本发明属于食品安全-兽药残留领域，特别是动物源性食品中磺胺类药物残留检测的一种 方法。
技术背景磺胺类药物(sulfonamides， SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类 传统的人工合成抗菌药物。它与对氨基苯甲酸(PABA)的化学结构相似，二者竞争二氢叶酸合 成酶，抑制细菌二氢叶酸的合成，影响细菌核酸生成，进而阻止了细菌的生长繁殖。磺胺药 物抗菌谱较广，对大多数革兰阳性菌和某些革兰阴性菌有抑制作用。在动物饲养过程中，磺 胺类药物常用于治疗家畜子宫炎、呼吸道和消化道感染、猪萎縮性鼻炎、禽霍乱、伤寒、副 伤寒和球虫感染。磺胺类药物在动物体内的作用时间和代谢时间较长，往往造成动物可食性 组织中有磺胺类药物残留，而长期食用有磺胺类药物残留的食品，就可能引起磺胺类药物在 体内的逐渐蓄积，对人类的健康有害[李俊锁，邱月明，王超，兽药残留分析[M]， 2002， 228-251; 段振娟，张鸿雁，王硕，动物性食品中磺胺类药物残留分析研究进展[J]，食品研究与开发， 2007， 28(6): 149-153]，主要表现为变态反应与过敏反应、细菌耐药性、致畸作用、致突变 作用、致癌作用以及激素样作用。而且食品、饲料中的残留极易引发细菌的耐药性和环境污 染。动物排泄物中的抗菌药物和耐药性菌株被释入环境后，将污染水源和土壤，在污泥中细菌 可长期保持耐药性。同时，磺胺类药物残留也是目前动物性产品贸易的主要技术问题，严重 影响了畜牧业的正常发展。为了保障动物用药的安全性和有效性，以及人类摄食动物性食品后的安全性，许多国家 规定了磺胺类药物的最高残留限量(maximum residue limits, MRL)，加拿大、欧盟、美国规定 动物组织中磺胺类药物总量的最大残留量是100 ^g/kg，日本为20 pg/kg。根据我国农业部1998 年制定的"兽药及其他化学物质在动物可食性组织中残留检测方法"，磺胺类药物在可食性动 物组织中的允许残留标准为100吗/kg 300 pg/kg。几十年来，国内外对SAs残留的分析进行 了深入全面的研究，出现了许多检测磺胺类药物的方法。目前有高效液相色谱法(HPLC)、气 相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)、酶联免疫分析法(ELISA)、微生物法、生物传感器免疫分析法(BIA)、分光光度法(UV)、荧光法(FL)、气相色谱-质谱法 (GC/MS)、液相色谱-质谱法(HPLC/MS)和超临界流体色谱法(SFC)等方法。研究最多的动物性 食品有肌肉、肝脏、肾、皮和脂肪，最常见的分析物为磺胺二甲基嘧啶(SMZ)、磺胺嘧啶(SDZ)、 磺胺甲基嘧啶(SMR)和磺胺噻唑(STZ)[段振娟，张鸿雁，王硕，动物性食品中磺胺类药物残留 分析研究进展[J]，食品研究与开发，2007， 28(6): 149-153]。在磺胺类药物的诸多检测方法 中，HPLC方法具有灵活、通用、选择性强、灵敏度高、检测限低等优点。HPLC方法主要用 C^和Q反相柱，有时也用离子对柱。常用的流动相为磷酸-乙腈梯度洗脱[刘宏程，黎其万， 佴注，等，HPLC测定动物组织中己烯雌酚、呋喃唑酮、磺胺类药物残留[L]，化学通报，2006, (1): 66-69;万春花，龙洲雄，胡海山，等，RP-HPLC法同时测定动物组织中十五种磺胺类 药物残留[J]，食品科学，2007,28(10): 493-496;曹芳，王茜，谢世红，高效液相色谱法测定 鸡肉中的磺胺类药物残留[J]，江西饲料，2005， (1): 25-26]，甲酸-乙腈梯度洗脱[陈振桂，占 春瑞，郭平，等，高效液相色谱法同时测定水产品中13种磺胺类药物残留的研究[J]，食品 科学，2007， 28(10): 448-451]，甲醇-磷酸盐缓冲液-三乙胺[刘艽岩，姜宁，王洪宇，固相萃 取-高效液相色谱法同时测定猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类兽药残留量[J]，化学通报，2006， (8): 572-576],甲醇-乙腈-水-乙酸[张艳，吴银良，固相萃取-高效液相色谱法测定动物肉组织中磺 胺类药物的残留[L]，色谱，2005， 23(6): 636-638;林红英，陆桂萍，沈子龙，猪肉中磺胺 二甲基嘧啶残留量的高效液相色谱法测定[L]，江苏农业学报，2006， 22(3): 285-288]，甲醇-乙酸[宋艳红，王冉，刘铁铮，高效液相色谱法测定蛋清和蛋黄中五种磺胺类药物残留[L]，浙 江农业学报，2007， 19 (1): 42-45];甲醇-甲酸梯度洗脱[吴宗贤，沈崇钰，陈惠兰，等，高 效液相色谱-串联质谱法测定肠衣中17种磺胺类药物残留量[L]，分析试验室，2007， 26(5): %-99]等。流动相的pH值对磺胺类药物的保留时间影响很大，因为磺胺类药物结构式中含有 氨基，具有弱碱性，调节流动相中的pH，可以抑制弱碱的离解，从而导致保留时间的改变， 因此在HPLC检测中，必须保持流动相pH的稳定，pH变化则可能引起分析结果和分离效果 的变化。例如用RP-HPLC法同时测定动物组织中十五种磺胺类药物残留时[万春花，龙洲雄， 胡海山，等.RP-HPLC法同时测定动物组织中十五种磺胺类药物残留[J]，食品科学，2007, 28(10): 493-496]，结果表明在乙腈-水中加入磷酸，可有效地抑制色谱峰拖尾，且有利于磺 胺噁唑与磺胺二甲嘧啶的分离，但加入磷酸多了，磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲噻二唑很难分开。 HPLC方法常用的检测器有紫外-可见检测器(UV)、荧光检测器(FLD)、光二极管阵列检 测器(DAD)和质谱(MS)。紫外-可见的检测波长通常选为270 nm~280 nm，有时为255 nm。 荧光检测的激发波长为405 nm ~420 nm，发射波长为485 nm~495 nm。光二极管阵列通常选 267 nm、 268 nm或263 nm的波长。MS具有高特异性并且可以确证被分析物。在进行HPLC色谱分析前，通常需要对样品进行净化和浓縮，以避免样品基质中的复杂 组分损害色谱仪器和对目标分析物的干扰。常用的方法是用甲醇或乙腈提取药物，再经正己 垸液-液分配除脂肪，浓縮后过SPE柱净化；常用的SPE柱包括Alumina B SPE、阳离子MCX SPE柱、ENVI-18SPE柱、氨基SPE柱和C!8SPE柱等。基质固相分散(Mat rix solid phase dispersion, MSPD)是另一种样品前处理方法。MSPD 是由Barker在1989年首次提出并给予理论解释的一种样品处理技术。MSPD将常规的固相 分散技术与反相键合填料相结合，组织匀浆、提取和净化在同一操作中完成，分析环节大为 减少、操作简化，所以具有简便快捷、样品和溶剂用量少等优点。国内这方面的研究资料比 较少，报道的有猪肌肉组织中磺胺类药物的MSPD净化和HPLC测定[张素霞，李俊锁，钱传 范，猪肌肉组织中磺胺类药物的MSPD净化和HPLC测定[J]，畜牧兽医学报，1999， 30(6): 531-535]，方法是将0.5g肌肉组织与2gd8填料混合，研磨30 s，制成半固态装取于5 mL 玻璃注射器内，填装高度为4.2mL,用8mL正己烷洗涤，真空抽干后，磺胺类药物用12mL 二氯甲烷洗脱药物于鸡心瓶中，加0.1mL乙二醇，旋转蒸发除去二氯甲烷，残留物用0.4mL 流动相溶解，转入玻璃离心管中，2000 g离心10min;上清液进经ds柱分离，0.017mol/L磷 酸-乙腈(80 : 20)为流动相，UV检测波长270 nm下用反相HPLC测定。在0.1 0.5 mg/kg 添加浓度范围内7种磺胺类药物的平均回收率为70.6 % ±20.3 %，检测限为0.01 0.1 mg/kg。 同样耿志明等采用基质固相分散-高效液相色谱法测定鱼肉中磺胺类药物残留进行了研究[耿 志明，李鹏，陈明，等，基质固相分散-高效液相色谱法测定鱼肉中磺胺类药物残留[J]，江苏 农业学报，2006， 22(3): 310-312]，即0.5 g鱼肉样品和2.0 g C18填料放入研钵中，轻轻研磨 5min，使样品和<:18填料混合均匀，装于10mL注射器，填装高度为4mL左右，用8 mL正 已烷洗涤l次，真空抽干，再用8mL二氯甲烷洗脱，真空抽干；洗脱液在35 'C水浴中用氮 气吹干，残渣用1 mL40。/。(体积比)甲醇水溶液溶解，旋涡振荡，过0.45pm滤膜，供HPLC 分析；色谱柱W为ODS-3 C18，柱温35。C， UV检测波长270nm，流动相为0.5%乙酸-甲醇， 采用梯度洗脱，即为0 2 min 76:24 (体积比)、2 20 min由76:24 (体积比)改变为60:40 (体 积比)、20 30min为60: 40 (体积比)，流速为1.0 mL/min。在0.05 0.20 mg/kg的添加浓 度范围内，磺胺类药物的回收率为70.2% 93.7% ,变异系数为2.5% 9.9%，磺胺类药物的 检测限0.020 mg/kg 0.030 mg/kg。HPLC方法是分析磺胺类药物残留的国际公认的较为普遍的方法，有关的研究较多，但是 为了实现简单、快速、安全的分析目的，上述方法还存在以下问题1) HPLC分析时，流动相多采用酸(甲酸、乙酸、磷酸等)-有机溶剂，其中磷酸、甲酸、 乙酸等由于具有挥发性，放置过久浓度或含量会发生变化，所以不同时间里很难配制相同的精确pH值，影响不同分析时间内分析结果的重复性，导致保留时间的变化，甚至使分析物 不能彼此分开。2) MSPD洗脱是采用毒性有机溶剂二氯甲垸，对环境和操作者具有危害。3) 以上这种提取-净化的前处理方式经常使用有毒的有机溶剂(甲醇、乙腈)作提取剂； 同时又有液-液分配、浓縮等过程，由于磺胺类药物耐热性差，这些过程都会造成损失，使回 收率降低；而且这种传统样品处理方法包括提取、分离、浓縮、净化等烦琐、冗长的操作步 骤，需耗用大量溶剂，限制了分析效率的提高。发明内容本发明针对上述HPLC方法中的缺陷，提出了一种动物源性食品中磺胺类药物残留的基 质固相分散-高效液相色谱测定方法，该方法采用稳定的化合物磷酸二氢钠配制HPLC的流动 相，由于磷酸二氢钠溶液是缓冲溶液，具有一定的pH缓冲能力，使pH不易变化，从而保证 了 HPLC流动相pH的稳定性，保证了分析结果的重复性和重现性，同时简化了经典样品处 理方法中提取、分离、浓縮、净化过程，操作简单、消除乳化现象，具有理想的准确度和灵 敏度，采用毒性较小的有机溶剂洗脱分析物会使MSPD方法更环保。一种动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法，包括基质 固相分散和高效液相色谱检测步骤，其特征在于所述高效液相色谱测定方法中所用流动相 为50mmol/L磷酸二氢钠-乙腈，磷酸二氢钠与乙腈的体积比为70:30。所述高效液相色谱测定方法中所用色谱柱为ODS-C18柱，规格为4.6 mmx250 mm ><5 pm。所述基质固相分散包括研磨、装柱、除脂肪、洗脱药物和制备上样溶液步骤，所述洗脱 药物采用乙酸乙酯溶剂。所述制备上样溶液是在35。C水浴，洗脱液中加入0.1 mL乙二醇后，旋转蒸发至0.2 mL-0.3mL，氮气吹至O.lmL，加入0.9 mL流动相定容1.0 mL,涡旋混合10 s，过0.22 微孔滤膜即可。本发明建立了以磷酸二氢钠-乙腈为流动相的HPLC的方法，其中以磷酸二氢钠代替磷酸、 甲酸、乙酸等酸性组分，使流动相的配制更加方便和准确，使溶液的pH值更容易控制和稳 定，而且本方法具有较好的重复性和重现性。在洗脱药物提取磺胺类化合物时采用乙酸乙酯溶剂，减少了有毒试剂的应用，在制备上 样溶液时，在低温水浴下，利用乙二醇作保护剂，防止旋转蒸发时高温蒸干对磺胺类化合物 的影响。本发明的HPLC测定方法中色谱柱ODS-ds柱(4.6mmx250mmx5nm)，柱温为室温； 流动相50mmol/L磷酸二氢钠-乙腈(色谱纯)(F7PO =70:30;恒流模式；检测器紫外检 测器，检测波长为270nm。检测的磺胺类药物包括磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺 甲噁唑、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺喹噁啉。八种磺胺类药物在0.010 mg/kg-1.000吗/mL范围内，线性相关系数均为0.9999以上；回收率为76.0 %~115.0 %;仪器 检测限均为0.010吗/mL;方法检测限为0.020 pg/g。本发明建立了以磷酸二氢钠-乙腈为流动相的HPLC的方法，使流动相的配制更加方便和 准确，使溶液的pH值更容易控制，具有较好的重复性和重现性。同时采用环保型溶剂取代 有毒溶剂，使本发明方法更环保。
图l 8种药物标准色谱图(0.100pg/mL)图2鱼肉样品添加浓度0.200 mg/Kg的色谱3猪肉样品添加浓度0.200 mg/Kg的色谱图具体实施方式
下面通过实例对本发明作进一步的详细说明。 实施例l:鱼肉样品检测1、主要仪器设备、药品仪器1) 玻璃研钵；2) 玻璃注射器5mL3) SPE固相萃取装置4) 具恒温水浴锅的氮吹仪5) 移液管1 mL、 0.5 mL6) 容量瓶10 mL7) 电子天平(分度值0.001 g)8) 计时器9) 旋涡混合器10) 液相色谱仪药品1) 标准物质(纯度》98.5%):磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)、磺胺 二甲基嘧啶(sulfamethazine)、磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine)、磺胺邻二甲氧嘧啶 (sulfadoxine)、磺胺甲噁哇(sulfamethoxazole)、磺胺喹噁啉(sulfaquinoxzline)、磺胺间二甲氧 嘧啶(sulfadimethoxine)标准溶液。2) 乙腈、乙酸乙酯、甲醇(色谱纯)3) 正己烷、磷酸二氢钠(分析纯)4) 无水硫酸钠(分析纯)，使用前在45(TC烘干4h，干燥器中放置备用。5) Cw填料，使用前用双倍体积的正己烷、乙酸乙酯、甲醇(色谱纯)预洗ds，最后抽干。6) 流动相将50 mmol/L磷酸二氢钠缓冲水溶液与色谱纯的乙腈按体积比70:30 (F/F)混 合而获得。2、 标准溶液配制标准储备液精确称取适量的磺胺类药物，分别用甲醇配成lmg/mL的标准储备液，储 于-2(TC冰箱中。有效期一年。标准工作液将储备液用流动相稀释为0.01 pg/mL~1.0|Lig/mL，存放在2 8'C冰箱中备 用。有效期6个月。混合标准工作液准确量取磺胺类药物标准储备液各0.5 mL，用甲醇定容10mL，配制 成50 pg/mL的磺胺类药物混合标准储备液，再用流动相稀释成0.01 pg/mL 1.0 ng/mL的混 合标准工作液，存放在2 8'C冰箱中备用。有效期6个月。3、 鱼肉样品的制备将2kg鱼肉样品用组织绞碎机匀浆处理，称取500g样品，实验室备用，4'C储存。4、 MSPD方法称取2g预处理的ds填料，放于玻璃研钵中，准确称取0.50g匀桨处理好的鱼肉样品于 研钵，研磨30s，混合均匀。将研碎的肉样装入5mL的玻璃注射器中(预先在底部装入滤纸 片，并装有O.l mL柱体积的无水硫酸钠)，上面再装入一片滤纸，压紧到柱体积为4.2 mL。 用8mL正己烷淋洗小柱，以进一步去掉脂肪，流速为l滴/s，真空抽干，除去正己垸，弃去 淋洗液。再用15 mL乙酸乙酯洗脱小柱，控制流速为1滴/s，真空抽干，收集洗脱液于试管 中。5、 浓縮洗脱液中加入0.1mL乙二醇，在35 。C水浴中旋转蒸发0.2mL左右，氮气吹至0.1mL，加入0.9mL流动相定容1.0mL，涡旋混合10s，过0.22 pm微孔滤膜，待测。6、 C18填料空白实验在研钵中不加鱼肉样品，按照上述相同的MSPD和浓縮方法做d8填料空白实验。7、 样品空白实验在研钵中加入经验证不含有磺胺药物的鱼肉样品，按照上述相同的MSPD和浓縮方法做 鱼肉样品空白实验。8、 样品添加实验在研钵中加入经验证不含有磺胺药物的鱼肉样品，然后添加一定量的磺胺药物的混合标 准溶液，按照上述相同的MSPD和浓縮方法做鱼肉样品添加实验。9、 实际样品测定实验在研钵中加入实际鱼肉样品，按照上述相同的MSPD和浓縮方法做鱼肉实际样品测定实验。10、 HPLC测定将上述处理制得的样品试液50pL注入色谱系统，室温下，以50mmol/L磷酸二氢钠-乙 腈(色谱纯)(,=70:30为流动相，流速为0.7mL/min，在Ci8 (4.6 mmx250 mm x5 ,) 色谱柱上分离，紫外检测器，波长为270nm。(见图1、图2)11、 实验结果1)方法的标准曲线浓度范围在0.010~1.000 pg/mL时的标准曲线方程和相关系数见表1。表l 8种药物的标准曲线方程和相关系数药物名称 线性方程 相关系数~"磺胺嘧啶(sulfadiazine) A=338.69c-0.033 0.9999磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine) A=333.74c - 0.133 0.9999磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine) A=297.78c — 0.106 0.9999磺胺间甲氧嘧啶A=263.21c-0.010 0.9999(sulfamonomethoxine)磺胺邻二甲氧嘧啶(sulfadoxine) A=273.47c - 0.178 1.0000磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole) A=299.76c - 0.016 1.0000磺胺喹噁啉(sulfaquinoxzline) A=260.00c - 0.138 0.9999磺胺间二甲氧嘧啶A=276.03c - 0.506 1.0000(sulfadimethoxine )A-色谱峰面积；C-浓度2)回收率添加浓度为0.200 pg/g和0.100 pg/g时的鱼肉样品的回收率见表2。表2 8种药物的回收率(n=6)药物名称回收率(％)0.200吗/g0.100吗/g磺胺嘧啶(sulfadiazine)115.00±3.584.67±5.7磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine)99.00±4.690.67±4.6磺胺二甲基嘧啶(sulfamethazine)84.33±8.687.33±4.4磺胺间甲氧嘧啶 (sulfamonomethoxine)98.00±6.1105.30±3.1磺胺邻二甲氧嘧啶(sulfadoxine)81.67±6.886.00±2.0磺胺甲B惡挫(sulfamethoxazole)82.00±2.680.00±5.6磺胺喹噁啉(sulfaquinoxzline)76.00±3.677.00±1.4磺胺间二甲氧嘧啶 (sulfadimethoxine )94.67±5.289.00±4.23)方法的检出限根据仪器响应值与噪音的比值为3来计算方法的检出限，则仪器检测限均为0.010 pg/mL; 方法检测限为0.020 pg/g。从上述结果可知本实验建立的鱼肉中磺胺类药物多残留分析的MSPD/HPLC方法，采用 MSPD技术进行样品处理，提取、净化一步完成，简化了经典样品处理方法中提取、分离、 浓縮、净化等烦琐步骤，操作简单、方法稳定，具有理想的准确度和灵敏度；同时采用低毒 溶剂乙酸乙酯代替二氯甲烷，减少了实验过程中有机溶剂对操作者和环境的污染。同时采用 50mmol/LNaH2PO4-乙腈(V/V: 70:30)为流动相，在恒流模式下进行，简化色谱操作，选用磷酸二氢钠调节流动相的pH时，由于磷酸二氢钠溶液是缓冲溶液，具有一定的pH缓冲能力， pH不易变化，是测定的重现性好。同时分离检测8种磺胺类药物，不仅能够满足水产品磺胺类残留量的常规的检测，也可用于其他样品中的磺胺类药物的测定。实施例2猪肉样品检测操作步骤同上，猪肉样品HPLC检测结果见图3.在本发明所建立的分析条件下，得到猪肉样品和鱼肉样品及8种磺胺药物标准品的色谱 图(图3、图2和图1)，从这些色谱图分离效果可见，没有基质干扰影响药物的测定，分离 效果非常好。
权利要求
1、一种动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法，包括基质固相分散和高效液相色谱检测步骤，其特征在于所述高效液相色谱测定方法中所用流动相为50mmol/L磷酸二氢钠-乙腈，磷酸二氢钠与乙腈的体积比为70∶30。
2、 根据权利要求1所述的测定方法，所述高效液相色谱测定方法中所用色谱柱为ODS-C18 柱，规格为4.6 mmx250 mm x5 pm。
3、 根据权利要求1所述的测定方法，所述基质固相分散包括研磨、装柱、除脂肪、洗脱药 物和制备上样溶液步骤，所述洗脱药物采用乙酸乙酯溶剂。
4、 根据权利要求3所述的测定方法，所述制备上样溶液是在35'C水浴，洗脱液中加入0.1 mL乙二醇后，旋转蒸发0.2mL-0.3mL，氮气吹至O.lmL，加入0.9 mL流动相定容1.0 mL， 涡旋混合10 s，过0.22 nm微孔滤膜即可。
全文摘要
本发明涉及“动物源性食品中磺胺类药物残留的基质固相分散-高效液相色谱测定方法”属于食品安全-兽药残留领域。该测定方法包括基质固相分散和高效液相色谱检测步骤，其特征在于所述高效液相色谱测定方法中所用流动相为50mmol/L磷酸二氢钠-乙腈，磷酸二氢钠与乙腈的体积比为70∶30，由于磷酸二氢钠溶液是缓冲溶液，具有一定的pH缓冲能力，使pH不易变化，从而保证了HPLC流动相pH的稳定性，保证了分析结果的重复性和重现性，同时简化了经典样品处理方法中提取、分离、浓缩、净化过程，操作简单、消除乳化现象，具有理想的准确度和灵敏度，采用毒性较小的有机溶剂洗脱分析物使本发明方法更环保。
文档编号G01N30/02GK101241114SQ20081010212
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月18日 优先权日2008年3月18日
发明者赵孟彬, 赵海香, 维 邓 申请人:北京锦绣大地农业股份有限公司