净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种净化双氟沙星和磺胺类复合免疫亲和柱的制备与应用，更确切的 说是双氟沙星和磺胺类免疫亲和柱的制备方法，免疫亲和柱净化-液相色谱法检测双氟沙 星和磺胺类检测方法的建立。
【背景技术】
[0002] 随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴 趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分复杂，待 测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的 要求。免疫亲和色谱（Immunoaffinity Chromatography, IAC)是一种将免疫反应与色谱分 析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使分析过程简化。在兽药残留 分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化测定技术（如HPLC，GC)的样品净化 手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得 到互补，并避免了免疫分析法（如ELISA，RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在 抗体、激素、多肽、酶、重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。
[0003] 双氟沙星（difloxacin，DIF)是美国Abbot公司1984年合成的第三代氟喹诺酮类 抗菌药物。双氟沙星具有广谱抗菌作用，对多种革兰氏阴性、革兰氏阳性菌、球菌及支原体 等均有较强的活性，加之其在体内分布广泛、与其他抗菌药物无交叉耐药性，已被广泛应用 于细菌性疾病的防治。然而由于抗菌药物的滥用会引起药物残留在食品动物体中，从而导 致食用此类动物后，引起人类病原菌对抗菌药物产生耐药性，而其产生的毒副作用还会对 人体产生直接的危害，如过敏、溢血、肾衰等不良反应。
[0004] 磺胺类药物（Sulfonamides，SAs)是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总 称，一般为白色或微黄色结晶性粉末，无臭，味微苦。磺胺类药物是一类用于预防和治疗细 菌感染性疾病的化学治疗药物，种类可达数千种，其中应用较广并具有一定疗效的就有几 十种。SAs作为一类广谱抗菌药，临床上主要用于预防和治疗感染性疾病，由于其性质稳定， 制造不需粮食做原料、产量大、品种多、价格低、使用简便、供应充足等优点，兽医临床和畜 牧养殖业中作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物广泛应用。但是磺胺类药物会影响人的泌 尿系统功能，引起过敏性反应，甚至可能致癌。近年来，磺胺类药物的不合理使用，使其在动 物性食品中的残留所引起的对生态环境污染和人类健康危害构成的潜在威胁已备受关注， 成为人类亟待解决的问题之一。
[0005] 目前检测双氟沙星的方法主要有毛细管电泳法、酶联免疫法、分光光度法、液相色 谱法、薄层色谱法等；检测磺胺类药物的方法主要有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法、 薄层色谱法等。这些方法的前处理常利用液-液分配，常规的SPE柱精华和分离，都在不同 程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时间长等缺点。
[0006] 免疫亲和技术是上世纪90年代在分析领域得到应用的新技术，免疫亲和层析方 法的关键在于选择一种高效特异的抗体，但是，利用现有技术中的液液提取、固相萃取、加 热蒸发浓缩等方法的添加回收率均较低，对后续的检测步骤造成很强的基质效应，并且现 有技术中没有能够同时纯化待处理基质中16种磺胺类药物的免疫吸附介质，也没有能够 同时纯化待处理基质中双氟沙星和16种磺胺类药物的免疫吸附介质，更无商品化的IAC柱 出售，能够同时纯化分析多种抗菌药物显然能够提高检测的效率。
【发明内容】
[0007] 鉴于以上现有技术中的不足，本发明提供了一种可同时净化双氟沙星和磺胺类药 物的免疫亲和色谱柱以及其制备方法，利用该方法制备出性能稳定、特异性强的免疫吸附 剂，并建立一种经济、快捷、精确、安全，并且能同时纯化双氟沙星和16种磺胺类药物的方 法。
[0008] 本发明采用的技术方案是：净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱，由如下 方法制备：
[0009] a基质制备
[0010] 每Ig琼脂糖凝胶基质粉末溶于lmmol/L HCl中，然后使用lmmol/L HCl洗涤 15min ；
[0011] b抗体偶联
[0012] 使用偶联缓冲液0. 2mol/L NaHC03pH8. 3溶解待偶联的抗双氟沙星单克隆抗体和 磺胺类药物单克隆抗体，得到抗体溶液，迅速将步骤a活化后的琼脂糖凝胶基质转移到抗 体溶液中；室温条件下，充分混匀上述的混和物2_4h ;
[0013] c配体封闭
[0014] 将步骤b处理后的基质转移至0. lmol/L Tris-HCl缓冲液中，室温条件下静置 2-4h ；
[0015] d除去偶联后未偶联上的多余的配体
[0016] 依次用0. lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0. lmol/L Tris-HCl缓冲液对经步骤c 处理后的基质进行洗涤，至少洗涤3个循环；
[0017] e 装柱
[0018] 用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0. 01 % NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 % NaN3-PBS保 存，然后装柱。
[0019] 制备所述抗双氟沙星单克隆抗体的抗双氟沙星单克隆抗体细胞保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 9205。
[0020] 利用上述复合免疫亲和柱进行双氟沙星和磺胺类药物检测的检测方法，包括如下 步骤：
[0021] 用所述复合免疫亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为1 滴/秒，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供HPLC或LC-MS分析；
[0022] 高效液相色谱条件如下：
[0023] 双氟沙星
[0024] 流动相：乙腈：四丁基溴化按（0· 030mol/L pH = 3. 1) = 5 :95
[0025] 检测器：紫外检测器，波长270nm
[0026] 色谱柱：Cloversil-C18,4. 6X150mm
[0027] 流速：1.5mL/min
[0028] 磺胺类药物
[0029] 流动相：甲醇和I. I %乙酸-0.0 lmol PBS溶液梯度洗脱
[0030] 检测器：紫外检测器，波长270nm
[0031] 色谱柱：Cloversil_C18,4. 6X250mm
[0032] 流速：1. OmT ,/mi η ；
[0033] 定量
[0034] 用进样器吸取50 μ L标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标 准溶液的响应值，分别得到标准溶液高效液相色谱图。
[0035] 本发明制备的复合免疫亲和柱性能稳定、特异性强，能同时纯化双氟沙星和16种 磺胺类药物。可以有效地利用到双氟沙星和磺胺类药物的液相色谱检测中，使检测快捷，精 确，安全。
【附图说明】
[0036] 图1为双氟沙星标准品的液相色谱图；
[0037] 图2为16种磺胺类药物标准品的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不用来限制本发明的范围。
[0039] 本发明的免疫亲和色谱柱是以免疫亲和吸附剂为填料装柱而成的；所述免疫亲和 吸附剂是由固相载体和与其偶联的抗双氟沙星和磺胺类药物单克隆抗体组成；抗双氟沙星 单克隆抗体是以双氟沙星半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的，抗磺胺类药物单克 隆抗体为市售产品。
[0040] 实施例1
[0041] 本实施例用于制备抗双氟沙星单克隆抗体
[0042] (1)动物免疫：免疫动物为6-8周龄左右，雌性BALB/c小鼠。免疫原：DIF-BSA免 疫5只小鼠。取适量免疫原（IOOyg/只）加等量弗氏完全佐剂，制成乳化剂进行免疫，之 后佐剂改为不完全佐剂，共免疫6次，每次间隔2周。除第一次为颈背部皮下多点注射外， 其余均为腹腔注射。
[0043] (2)细胞融合：上述被免疫小鼠的脾细胞和杂交瘤细胞按照10:1的比例进行细胞 融合试验。
[0044] (3)杂交瘤细胞克隆化：采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直到筛选出分泌抗双 氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞9205,制备出单克隆抗体。抗双氟沙星单克隆抗体细胞已 于2014年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO. 9205。
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例用于制备双氟沙星和磺胺类药物免疫亲和色谱柱
[0047] 1.基质制备
[0048] 称取所需Ig的琼脂糖凝胶（Sepharose)基质粉末（每克冻干基质粉末可形成 3.5ml终体积的溶胀基质），溶于lmmol/L HCl中。基质将会立即溶胀，然后置于烧结玻璃 过滤器中使用lmm〇l/L HCl洗绦15min。
[0049] 2.配体（抗体）偶联
[0050] a使用偶联缓冲液0. 2mol/L NaHC03pH