8. 3溶解待偶联的杂交瘤细胞9205分泌的 抗双氟沙星单克隆抗体和抗磺胺类药物单克隆抗体，抗体浓度为8. 5mg/mL，溶解的抗体置 于冰浴中暂存。在一个带盖的可完全密封的容器中加入上述含有抗体的偶联缓冲液。迅速 将CNBr活化的S印harose (即经步骤1处理的）转移到抗体溶液中。室温条件（20-25°C ) 下米用end-over-end的方式充分混勾上述的混和物2_4h。
[0051] b偶联率的计算：离心，2, 000RMPX lmin，将s印harose离心至管底，将上清液转移 至新的离心管中，测定上清液的蛋白质含量值。计算偶联率为98.8% (说明偶联很成功）。 取离心至管底的sepharose，使用偶联缓冲液进行洗涤，除去多余的配体。
[0052] c封闭：封闭所有残留的活性基团。转移基质至0. lmol/L Tris-HCl缓冲液中。室 温条件下静置2-4h。
[0053] d为除去偶联后未偶联上的多余的配体，依次用低、高两种pH的缓冲液对基质进 行洗涤，至少洗涤3个循环，每种缓冲液的使用量至少5倍基质体积。每个洗涤循环步骤： 先用0. lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液洗涤，接着再用0. lmol/LTris-HCl缓冲液进行洗涤。
[0054] e用5倍琼脂糖凝胶体积的0. 01 % NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 % NaN3-PBS保存。
[0055] 3.装柱
[0056] 使用结合缓冲液制备浆液，以75 %沉降基质和25 %缓冲液的比例进行混合。以连 续性的操作向柱内倾入浆液。使用一个斜靠在柱内壁上的玻璃棒进行填柱操作，将有助于 减少气泡的产生。填柱后，关闭亲和柱下端的开口，并取下亲和柱的顶端部件。仔细操作， 使用缓冲液加入充填亲和柱的余下部分，以在亲和柱的顶端形成一个向上的弯液面。将顶 端筛板以一定的角度插入到亲和柱中，确保在筛板的下方没有空气。将筛板锁定在基质表 面适当的位置上，打开亲和柱下方的开口，用5倍柱床体积的无菌过滤的0. 01% NaN3-PBS 过柱，并使用〇. 01 % NaN3-PBS保存，至此双氟沙星和磺胺类药物亲和柱已装填并平衡完毕， 可直接供使用。
[0057] 实施例3
[0058] 本实施例用于水产品中双氟沙星和磺胺类药物的检测。
[0059] 1、样品前处理
[0060] 准确称取勾衆后的样品5. Og于50mL离心管中，准确加入20.0 mL 80%乙醇水溶 液，高速匀质2min后，摇床震荡提取30min，然后3000RPM离心5min。准确移取吸取上清液 5. OmL，用45. OmL纯水稀释并定容至50mL，然后用玻璃微纤维滤纸过滤，收集滤液于干净烧 杯中，备用。
[0061] 将免疫亲和柱连接于20.0 mL玻璃注射器下。准确移取上述滤液20.0 mL，以1滴/ 秒的流速全部通过免疫亲和柱，直至空气流经亲和柱，随后用10.0 mL纯水以1-2滴/秒的 流速淋洗亲和柱，直至空气流经亲和柱。将玻璃小管置于亲和柱下，用2. OmL甲醇以1滴/ 秒的流速淋洗亲和柱，将所有样品淋洗液收集于玻璃小试管中，50°C下氮气下吹干，然后用 流动相定容至500 μ L，共HPLC或LC-MS分析。
[0062] 2、添加回收试验
[0063] 分别在空白水产品样品中添加质量浓度为5、10、20 μ g/L 3个梯度，每个实验做5 组平行试验。
[0064] 3、液相色谱条件
[0065] 双氟沙星
[0066] a 流动相：乙腈：四丁基溴化按（0· 030mol/L pH = 3. 1) = 5 :95
[0067] b检测器：紫外检测器，波长270nm
[0068] c 色谱柱：Cloversil_C18,4. 6X 150mm(5um)
[0069] d 流速：1. 5mL/min
[0070] 磺胺类药物
[0071] a流动相：甲醇和L 1 %乙酸-0· Olmol PBS溶液梯度洗脱
[0072] b检测器：紫外检测器，波长270nm
[0073] c 色谱柱：Cloversil_C18,4. 6X250mm(5um)
[0074] d 流速：1. OmT ,/mi η
[0075] 表1梯度洗脱表
[0076]
【主权项】
1. 净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱，其特征在于，由如下方法制备： a基质制备 每Ig琼脂糖凝胶基质粉末溶于lmmol/LHCl中，然后使用lmmol/LHCl洗绦15min;b抗体偶联 使用偶联缓冲液〇. 2mol/LNaHC03pH8. 3溶解待偶联的抗双氟沙星单克隆抗体和磺胺 类药物单克隆抗体，得到抗体溶液，迅速将步骤a活化后的琼脂糖凝胶基质转移到抗体溶 液中；室温条件下，充分混匀上述的混和物2-4h; c配体封闭 将步骤b处理后的基质转移至0.lmol/LTris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h;d除去偶联后未偶联上的多余的配体 依次用〇?lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0?lmol/LTris-HCl缓冲液对经步骤c处理 后的基质进行洗涤，至少洗涤3个循环； e装柱 用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0. 01 %NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 %NaN3-PBS保存，然 后装柱。
2. 根据权利要求1所述净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱，其特征在于：制 备所述抗双氟沙星单克隆抗体的抗双氟沙星单克隆抗体细胞保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO. 9205。
3. -种净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤： a基质制备 每Ig琼脂糖凝胶基质粉末溶于lmmol/LHCl中，然后使用lmmol/LHCl洗绦15min;b抗体偶联 使用偶联缓冲液〇. 2mol/LNaHC03pH8. 3溶解待偶联的抗双氟沙星单克隆抗体和磺胺 类药物单克隆抗体，得到抗体溶液，迅速将步骤a活化后的琼脂糖凝胶基质转移到抗体溶 液中；室温条件下，充分混匀上述的混和物2-4h; c配体封闭 将步骤b处理后的基质转移至0.lmol/LTris-HCl缓冲液中，室温条件下静置2-4h;d除去偶联后未偶联上的多余的配体 依次用〇?lmol/L醋酸/醋酸钠缓冲液和0?lmol/LTris-HCl缓冲液对经步骤c处理 后的基质进行洗涤，至少洗涤3个循环； e装柱 用5倍所述琼脂糖凝胶体积的0. 01 %NaN3-PBS洗涤，并使用0. 01 %NaN3-PBS保存，然 后装柱。
4. 根据权利要求3所述净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱的制备方法，其特 征在于：制备所述抗双氟沙星单克隆抗体的抗双氟沙星单克隆抗体细胞保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0. 9205。
5. 利用权利要求1所述复合免疫亲和柱进行双氟沙星和磺胺类药物检测的检测方法， 包括如下步骤： 用所述复合免疫亲和柱净化待测样液，然后用色谱级甲醇洗脱亲和柱，流速为1滴/ 秒，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供HPLC或LC-MS分析； 高效液相色谱条件如下： 双氟沙星 流动相：乙腈：四丁基溴化按（〇? 030mol/LpH = 3. 1) = 5 :95 检测器：紫外检测器，波长270nm 色谱柱：Cloversil_C18,4.6X150mm 流速：1. 5mL/min 磺胺类药物 流动相：甲醇和I. 1 %乙酸-〇. Olmol PBS溶液梯度洗脱 检测器：紫外检测器，波长270nm 色谱柱：Cloversil_C18,4. 6 X 250mm 流速：1. OmL/min ; 定量 用进样器吸取50 y L标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶 液的响应值，分别得到标准溶液高效液相色谱图。
【专利摘要】本发明涉及一种净化双氟沙星和磺胺类药物复合免疫亲和柱及其制备方法与应用。本方法应用双氟沙星抗原，免疫小鼠，筛选出分泌双氟沙星抗体的杂交瘤细胞9205，制备出单克隆抗体。采用4％的柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与抗双氟沙星单克隆抗体和市场上购买的抗磺胺类药物抗体偶联形成免疫吸附剂，装柱制成免疫亲和柱(IAC)。当含有双氟沙星和磺胺类药物的样品通过IAC时，免疫吸附剂就会特异性的吸附双氟沙星和磺胺类药物，其他的杂质则流出IAC柱，然后用甲醇将双氟沙星和磺胺类从柱子中洗脱下来，样品得到了很好的净化。建立免疫亲和柱净化-液相色谱法检测双氟沙星和磺胺类药物。CGMCC NO. 920520140505
【IPC分类】G01N33-577, G01N30-88, G01N33-531
【公开号】CN104777296
【申请号】CN201510200621
【发明人】郗存显, 王国民, 曹淑瑞, 李蓉, 张雷, 王勇, 果旗, 姚佳, 王江, 王雄, 余洋, 李贤良
【申请人】重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 中国检验检疫科学研究院, 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 北京中检维康生物技术有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月24日