一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法。
【背景技术】
[0002]神经系统损伤性疾病包括缺血性脑病、出血性脑病、运动神经元疾病等，是一种严重威胁人类健康的疾病，提高这类疾病的生存率，降低致残率，最大限度地提高患者的生活质量，是防治此类疾病的首要任务。由于神经干细胞的发现使得神经系统损伤性疾病的治疗有了新的研宄方向，神经干细胞也成为了生物医学工程以及体外模型研宄中所必须的种子细胞。
[0003]神经干细胞(neural stem cells, NSCs)是具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群，是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞，包括神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。1992年神经干细胞自成年动物脑纹状体内第一次被发现，从而打破了认为神经细胞不能再生的传统理论。根据分化潜能及产生子细胞种类神经干细胞可分为如下几类:
[0004](I)神经管上皮细胞:分裂能力最强，只存在胚胎时期，可以产生放射状胶质神经元和神经母细胞。
[0005](2)放射状胶质神经元:可以分裂产生本身并同时产生神经元前体细胞或是胶质细胞，主要作用是幼年时期神经发育过程中产生投射神经元完成大脑中皮质及神经核等的基本神经组织细胞。
[0006](2)神经母细胞:成年人体中主要存在的神经干细胞，分裂能力可以产生神经前体细胞和神经元和各类神经胶质细胞。
[0007](4)神经前体细胞:各类神经细胞的前体细胞，比如小胶质细胞是由神经胶质细胞前体产生的。
[0008]神经干细胞作为生物医学工程以及体外模型研宄中的种子细胞，需要将其在体外进行扩大培养，而如何在体外大规模培养神经干细胞便成为了医学研宄的重点。现有的培养神经干细胞的常用培养基为GIBCO的含1% B27的Neurobasal培养基，使用明胶预处理过的培养瓶进行贴壁培养。但经过该培养基培养的神经干细胞增殖能力较弱。因此急需提供一种可增强神经干细胞增殖能力的培养基。
【发明内容】
[0009]有鉴于此，本发明提供了一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法。该神经干细胞培养基能够大大增强神经干细胞的增殖能力，同时能够使得神经干细胞在不用明胶预铺板的情况下贴壁生长，免除了繁琐的操作步骤简化了生产流程。
[0010]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0011]本发明提供了一种神经干细胞培养基，包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notchl和牛血清白蛋白。
[0012]作为优选，神经干细胞培养基中含有10?20 ymol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生长因子、5?15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10?20 μ g/mL胰岛素、40?60nmol/L 氛化可的松、10 ?20nmol/L WNT3a、40 ?60nmol/L Notchl、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0013]在本发明提供的一些实施例中，神经干细胞培养基中含有ΙΟμπιοΙ/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生长因子、15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/mL胰岛素、50nmol/L 氛化可的松、20nmol/L WNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0014]在本发明提供的另一些实施例中，神经干细胞培养基中含有15ymol/mL非必需氨基酸、20ng/mL表皮生长因子、5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、15 μ g/mL胰岛素、60nmol/L 氛化可的松、10nmol/L WNT3a、50nmol/L Notchl、60 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0015]在本发明提供的另一些实施例中，神经干细胞培养基中含有20ymol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生长因子、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/mL胰岛素、40nmol/L 氛化可的松、15nmol/L WNT3a、60nmol/L Notchl、40 μ g/mL 牛血清白蛋白。
[0016]作为优选，神经干细胞培养基还包括纤连蛋白和四型胶原蛋白。
[0017]作为优选，神经干细胞培养基中含有10?20 ymol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生长因子、5?15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10?20 μ g/mL胰岛素、40?60nmol/L 氛化可的松、10 ?20nmol/L WNT3a、40 ?60nmol/L Notchl、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白、15?35ng/mL纤连蛋白、50?70ng/mL四型胶原蛋白。
[0018]在本发明提供的一些实施例中，神经干细胞培养基中含有10 ymol/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生长因子、15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/mL胰岛素、50nmol/L 氛化可的松、20nmol/L WNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL 牛血清白蛋白、35ng/mL纤连蛋白、50ng/mL四型胶原蛋白。
[0019]在本发明提供的另一些实施例中，神经干细胞培养基中含有15 ymol/mL非必需氨基酸、20ng/mL表皮生长因子、5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、15 μ g/mL胰岛素、60nmol/L 氛化可的松、10nmol/L WNT3a、50nmol/L Notch 1、60 μ g/mL 牛血清白蛋白、15ng/mL纤连蛋白、60ng/mL四型胶原蛋白。
[0020]在本发明提供的另一些实施例中，神经干细胞培养基中含有20 ymol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生长因子、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/mL胰岛素、40nmol/L 氛化可的松、15nmol/L WNT3a、60nmol/L Notch 1、40 μ g/mL 牛血清白蛋白、25ng/mL纤连蛋白、70ng/mL四型胶原蛋白。
[0021]作为优选，非必需氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、丝氨酸或酪氨酸中的一种或两者以上的混合物。
[0022]在本发明提供的一些实施例中，非必需氨基酸购买于Gibco公司。
[0023]本发明还提供了一种贴壁培养神经干细胞的培养方法，采用本发明提供的神经干细胞培养基培养神经干细胞；
[0024]在本发明提供的一些实施例中，培养的条件为5% CO2,370C ο
[0025]在本发明提供的一些实施例中，培养的细胞密度为5 X 14?lX105/mL。
[0026]本发明提供了一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法。该神经干细胞培养基包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notchl和牛血清白蛋白。本发明至少具有如下优势之一:
[0027]本发明提供的神经干细胞培养基能够大大增强神经干细胞的增殖能力。流式检测结果显示，本发明培养基能够使P6代的神经干细胞的表面标志物Nestin+CD133+的比例能够达到33.3%，而传统培养基在P6代的Nestin+CD133+的比例仅为9.8%;本发明培养基培养的神经干细胞在3?6天时具有明显的对数生长期，细胞增殖较快，而采用传统培养基培养的神经干细胞的生长曲线显示细胞生长缓慢，无明显对数增殖；
[0028]本发明培养基添加纤连蛋白和四型胶原蛋白，能够使得神经干细胞在不用明胶预铺板的情况下贴壁生长，免除了繁琐的操作步骤简化了生产流程。
【附图说明】
[0029]图1示试验组I培养的神经干细胞在P6代的标志物Nestin+、⑶133+的流式检测结果；
[0030]图2示试验组2培养的神经干细胞在P6代的标志物Nestin+、⑶133+的流式检测结果；
[0031]图3示试验组3培养的神经干细胞在P6代的标志物Nestin+、⑶133+的流式检测结果；
[0032]图4示试验组I培养的神经干细胞生长曲线；
[0033]图5示试验组2培养的神经干细胞生长曲线；
[0034]图6示试验组3培养的神经干细胞生长曲线；
[0035]图7示对比例I中传统培养基培养的神经干细胞在P6代的标志物Nestin+、⑶133+的流式检测结果；
[0036]图8示对比例I中传统培养基培养的神经干细胞生长曲线。
【具体实施方式】
[0037]本发明公开了一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0038]本发明提供的神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法中所用试剂、仪器、试验动物等均可由市场购得。其中，WNT3a购自上海华雅思创，Notchl购自武汉福来生物；非必需氨基酸购自 Gibco，货号为 11140，MEM Non-Essentia Amino Acids Solut1n1mM(10X) ο
[0039]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0040]实施例1培养基的制备
[0041]培养液配方成分为:DMEM/F12、10 ymol/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生长因子、15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子