、10 μ g/mL胰岛素、50nmol/L氢化可的松、20nmol/LWNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL牛血清白蛋白、35ng/mL纤连蛋白、50ng/mL四型胶原蛋白。
[0042]培养基制备方法为:使用时按照规定量将所有成分混合均匀。
[0043]实施例2培养基的制备
[0044]培养液配方成分为:DMEM/F12、15 ymol/mL非必需氨基酸、20ng/mL表皮生长因子、5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、15 μ g/mL胰岛素、60nmol/L氢化可的松、10nmol/LWNT3a、50nmol/L Notchl、60 μ g/mL牛血清白蛋白、15ng/mL纤连蛋白、60ng/mL四型胶原蛋白。
[0045]培养基制备方法为:使用时按照规定量将所有成分混合均匀。
[0046]实施例3培养基的制备
[0047]培养液配方成分为:DMEM/F12、20 ymol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生长因子、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/mL胰岛素、40nmol/L氢化可的松、15nmol/LWNT3a、60nmol/L Notchl、40 μ g/mL牛血清白蛋白、25ng/mL纤连蛋白、70ng/mL四型胶原蛋白。
[0048]培养基制备方法为:使用时按照规定量将所有成分混合均匀。
[0049]实施例4本发明培养基培养神经细胞实例
[0050]出生I?4天的新生小鼠，脱颈处死后取新生小鼠大脑，剥去脑膜后用4°C PBS清洗2次，加入2mL神经干细胞培养液(试验组I采用实施例1培养基，试验组2采用实施例2培养基，试验组3采用实施例3培养基)，并用手术剪将大脑剪碎，接着用ImL手动移液器将碎片吹散成混悬液，然后调整细胞密度到5 X 104/mL。将混悬液加入6孔板，每孔2mL在5 % CO2、37 °C培养箱中放置2小时，2小时后吸取6孔板中的上清液，加入另一个6孔板中继续培养，原6孔板弃去不要。培养24小时后弃去6孔板中的上清液，每孔加入2mL神经干细胞培养液(试验组I采用实施例1培养基，试验组2采用实施例2培养基，试验组3采用实施例3培养基)，之后每2?3天换液一次。直到细胞融合度达到80%时倒去培养基并用含0.04v/v% EDTA的浓度为0.25v/v%的胰蛋白酶消化细胞I分钟，使其脱落，然后用各组所用培养基按照加入胰酶体积的5倍终止消化；离心后去除上清液，将沉淀细胞用各组所用培养基重悬，按照5 X 104/mL的密度加入培养瓶中，标记为Pl代细胞。重复传代至P6代。
[0051]将上述各组培养的神经干细胞进行流式检测，在P6代的标志物Nestin+、⑶133+的流式检测数据见图1?3。
[0052]各组培养的神经干细胞生长曲线见图4?6。
[0053]由图1?3可知，与传统培养基相比，本发明实施例1至3的培养基能够使P6代的神经干细胞的表面标志物Nestin+、⑶133+的比例能够达到33.3%,29.5%,24.3%，而传统培养基在P6代的Nestin+、CD133+的比例仅为9.8% (图7)。
[0054]一般增殖能力强的细胞，生长曲线会呈“S”型，可分为3个生长时期:第一阶段为适应期，细胞增殖较慢:第二阶段为对数生长期，细胞增殖速度变快，呈对数生长；第三阶段为平台期，细胞增殖减缓。根据神经干细胞P6代七天的细胞生长曲线图(图4?6)，可看到O?2天为适应期，3?6天为对数生长期，细胞增殖较快，第7天细胞增殖变慢，进入了平台期。细胞生长曲线图可知，该细胞的增殖能力较强。而采用传统培养基培养的神经干细胞的生长曲线显示细胞生长缓慢，无明显对数增殖(图8)。
[0055]可见，本发明提供的神经干细胞培养基能够大大增强神经干细胞的增殖能力。
[0056]同时本发明的培养基能够使得神经干细胞在不用明胶预铺板的情况下贴壁生长，免除了繁琐的操作步骤简化了生产流程。
[0057]对比例I传统培养基培养神经细胞实例
[0058]传统培养基是指GIBCO的Neurobasal培养基+1 % B27添加物。培养基配制方法为:将Neurobasal培养基和B27添加物混合，比例为500mL培养基+5mLB27添加物。
[0059]铺板:将0.1 % (质量体积分数)的明胶加入6孔板中，加入量为每孔ImL明胶，将明胶摇匀使之铺满培养瓶底部，将6孔板放入37°C培养箱中静置I小时备用。
[0060]细胞分离:出生1-4天的新生小鼠，脱颈处死后取新生小鼠大脑，剥去脑膜后用40C PBS清洗2次，加入2mL传统培养基并用手术剪将大脑剪碎，接着用ImL手动移液器将碎片吹散成混悬液，然后调整细胞密度到5 X 104/mL。将混悬液加入已经铺板的6孔板种，每孔2mL，在5% CO2、37°C培养箱中放置2小时，2小时后吸取6孔板中的上清液，加入另一个已经铺板的6孔板中继续培养，原6孔板弃去不要。培养24小时后弃去6孔板中的上清液，每孔加入2mL培养液A，之后每2?3天换液一次。
[0061]传代:直到细胞融合度达到80%时倒去培养基并用含0.04v/v% EDTA的浓度为
0.25v/v%的胰蛋白酶消化细胞I分钟，使其脱落，然后用培养基A按照加入胰酶体积的5倍终止消化；离心后去除上清液，将沉淀细胞用本发明培养基重悬，按照5X104/mL的密度加入培养瓶中，标记为Pl代细胞。重复传代至P6代。
[0062]将上述培养的神经干细胞进行流式检测，在P6代的标志物Nestin、⑶133+的流式检测数据见图7。培养的神经干细胞生长曲线见图8。
[0063]由图7可知，传统培养基在P6代的Nestin+、⑶133+的比例仅为9.8%。采用传统培养基培养的神经干细胞的生长曲线显示细胞生长缓慢，无明显对数增殖(图8)。可见，本发明提供的神经干细胞培养基能够大大增强神经干细胞的增殖能力。
[0064]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种神经干细胞培养基，其特征在于，包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notchl和牛血清白蛋白。2.根据权利要求1所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基中含有10?20 μmol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生长因子、5?15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10?20 μ g/mL胰岛素、40?60nmol/L氢化可的松、10?20nmol/LWNT3a、40 ?60nmol/L Notchl、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白。3.根据权利要求2所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基中含有10 μ mol/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生长因子、15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/mL 膜岛素、50nmol/L 氛化可的松、20nmol/L WNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL牛血清白蛋白。4.根据权利要求2所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基中含有15 4!1101/1111^非必需氨基酸、201^/1111^表皮生长因子、51^/111]^碱性成纤维细胞生长因子、15 μ g/mL 膜岛素、60nmol/L 氛化可的松、10nmol/L WNT3a、50nmol/L Notch 1、60 μ g/mL 牛血清白蛋白。5.根据权利要求2所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基中含有20 μ mol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生长因子、10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、20 μ g/mL 膜岛素、40nmol/L 氛化可的松、15nmol/L WNT3a、60nmol/L Notchl、40 μ g/mL牛血清白蛋白。6.根据权利要求1至5中任一项所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基还包括纤连蛋白和四型胶原蛋白。7.根据权利要求6所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基中含有10?20 μ mol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生长因子、5?15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10?20 μ g/mL胰岛素、40?60nmol/L氢化可的松、10?20nmol/LWNT3a、40 ?60nmol/L Notch 1、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白、15 ?35ng/mL 纤连蛋白、50 ?.70ng/mL四型胶原蛋白。8.—种神经干细胞贴壁培养方法，其特征在于，采用如权利要求1至7中任一项所述的神经干细胞培养基培养神经干细胞。9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述培养的条件为5%CO 2、37°C。10.根据权利要求8或9所述的培养方法，其特征在于，所述培养的细胞密度为.5 X 14?IXlOVmL0
【专利摘要】本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法。该神经干细胞培养基包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、WNT3a、Notch1和牛血清白蛋白。本发明提供的神经干细胞培养基能够大大增强神经干细胞的增殖能力，同时能够使得神经干细胞在不用明胶预铺板的情况下贴壁生长，免除了繁琐的操作步骤简化了生产流程。
【IPC分类】C12N5/0797
【公开号】CN104928247
【申请号】CN201510390313
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 万桦, 王小燕, 李平
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年7月2日