一种刺激软骨细胞外基质分泌的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及软骨细胞培养领域，尤其涉及一种刺激软骨细胞外基质分泌的培养 基。
【背景技术】
[0002] 关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，主要依靠关节的运 动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，临床研宄对患者组织取材 有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，去分化是指分 化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。所以改善与维持软骨细胞 表型在软骨细胞的临床应用中起着举足轻重的作用。
[0003] 目前，为了延迟软骨细胞的去分化，维持软骨细胞表型，研宄人员通过改善软骨细 胞培养环境来改善与维持所述软骨细胞表型，在现有技术中，一是通过改变培养基成分来 改善细胞培养环境，以改善或维持软骨细胞表型，二是模拟体内培养模式，将软骨细胞接种 于三维支架材料中对所述软骨细胞进行培养，使得软骨细胞回复初始的软骨细胞表型，但 是，随着软骨细胞的增殖都会出现明显的去分化趋势，在体外培养与临床应用上受到了限 制。
【发明内容】
[0004] 本发明的主要目的在于，提供一种刺激软骨细胞外基质分泌的培养基，能够在提 高软骨细胞增殖能力的同时改善与维持软骨细胞表型，提高软骨细胞体内应用的稳定性与 安全性。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明实施例提供一种刺激软骨细胞外基质分泌的培养基，其特征在于，用于刺 激软骨细胞分泌软骨细胞外基质，包括：基础培养基、骨形成蛋白BMP-2或者其类似物、多 西环素和地塞米松。
[0007] 优选的，所述骨形成蛋白BMP-2在所述培养基中的浓度为2-10ng/ml，所述多西 环素在所述培养基中的浓度为〇. 1-5 μ mol/ml，所述地塞米松在所述培养基中的浓度为 0.2~2 μ g/ml〇
[0008] 可选的，所述培养基还包括：化学成份确定的脂，所述化学成分确定的脂能够参与 细胞膜的合成，促进细胞增殖。
[0009] 优选的，所述化学成分确定的脂选自胆固醇、维生素 E、亚油酸与油酸中的至少一 种。
[0010] 进一步优选的，所述化学成份确定的脂占所述培养基总体积的1-5%。
[0011] 可选的，所述培养基还包括50-100 μ g/ml的维生素 C。
[0012] 进一步可选的，所述培养基还包含3-20ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF和 3-15ng/ml的转化生长因子TGF-β。
[0013] 优选的，所述培养基还包含2-8 μ g/ml的胰岛素或者浓度为5-20ng/ml的胰岛素 生长因子IGF-I。
[0014] 可选的，所述培养基还包含占所述培养基总体积5-20%的血清。
[0015] 优选的，所述血清为胎牛血清或者自体血清。
[0016] 本发明实施例提供的一种刺激软骨细胞外基质分泌的培养基，用于刺激软骨细胞 分泌软骨细胞外基质，包括：基础培养基、骨形成蛋白BMP-2或者其类似物、多西环素和地 塞米松。该培养基在培养软骨细胞时，能够刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软 骨细胞外基质包裹所述软骨细胞，使得软骨细胞模拟在体内的生存方式，在提高软骨细胞 增殖能力的同时改善与维持软骨细胞表型，提高软骨细胞体内应用的稳定性与安全性。
【附图说明】
[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述 中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些 实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附 图获得其它的附图。
[0018] 图1为光学显微镜拍摄的软骨细胞材料A-G中的软骨细胞生长状态的光学显微照 片；
[0019] 图2为对软骨细胞材料A-G切片后进行甲苯胺蓝染色的光学显微照片；
[0020] 图3为对软骨细胞材料A-G切片后进行II型胶原免疫组化分析的光学显微照片。
【具体实施方式】
[0021] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每 一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对 本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部 分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。
[0023] -方面，本发明实施例提供一种刺激软骨细胞外基质分泌的培养基，用于刺激软 骨细胞分泌软骨细胞外基质，包括：基础培养基、骨形成蛋白BMP-2或者其类似物、多西环 素和地塞米松。
[0024] 其中，所述骨形成蛋白BMP-2或者其类似物能够促进软骨细胞成熟和分化，和其 他因子有协同作用，促进软骨细胞增殖；其中，BMP-2的类似物可以为BMP-4 ;所述多西环素 经试验证明具有抗菌作用，是一种基质金属蛋白酶抑剂，能够抑制基质金属蛋白酶对细胞 外基质的降解，延缓细胞外基质被降解；所述地塞米松可以抑制软骨细胞过度增殖，能够促 进细胞分泌蛋白多糖，延缓细胞外基质被降解；添加这几种因子组合得到的软骨细胞培养 基能够刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，改善与维持软骨细胞表型，提高软骨细胞 增殖能力。
[0025] 其中，所述细胞外基质是由软骨细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞 之间的大分子，主要包含II型胶原和糖胺聚糖等。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连 接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。在这些细胞外基质中，胶原在细胞外基质 中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迀移和发育中起作用，是构成 细胞外基质的骨架。而胶原种类非常多，其中I型、III型主要存在于皮肤血管等结缔组织 中；II型主要由软骨细胞产生，多存在于骨骼、关节、肌腱等组织中，不同类型的胶原蛋白所 起到的作用也不同，I、111型可直接到达皮肤真皮层修复，美容养颜效果更快速。II型比I、 III型含有更丰富的羟脯氨酸，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网 状结构，产生一定的机械强度，更适合对骨骼肌腱组织的修复。
[0026] 软骨细胞分泌的软骨细胞外基质可影响细胞分化、增殖、黏附、形态发生和表型表 达等生物学过程，所述培养基刺激软骨细胞分泌所述软骨细胞外基质，其中，软骨细胞外基 质包括II型胶原与糖胺聚糖，所述II型胶原与糖胺聚糖包裹所述软骨细胞，使得软骨细胞 模拟体内生长模式，促进软骨细胞增殖，改善与维持软骨细胞表型，同时，软骨细胞自身分 泌软骨细胞外基质，提高所述软骨细胞体内应用的安全性与稳定性。
[0027] 本发明实施例提供的刺激软骨细胞外基质分泌的培养基，该培养基在培养软骨细 胞时，能够刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细 胞，使得软骨细胞模拟在体内生存方式，在提高软骨细胞增殖能力的同时改善与维持软骨 细胞表型，提高软骨细胞体外应用的稳定性与安全性。
[0028] 其中，所述基础培养基可以为通过商业途径获得的基础培养基，例如，可以为DMEM 或者DF12, DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，DF12为F12培养基和DMEM以1 : 1比例混合形成的一种培养基，F12含有较丰富的成分，这两种培养基能够为软骨细胞生长 提供多种营养成分。
[0029] 该基础培养基可以为各种形态，例如，可以为液体形态或者干粉形态，针对不同形 式形态的基础培养基可以采用不同的处理方法配置获取软骨细胞培养基。
[0030] 例如，当基础培养基为干粉形态时，配置获取软骨细胞培养基的方法可以为：先将 干粉形态的基础培养基加入无菌超纯水充分溶解，定容；再用0. 22微米滤膜过滤得到无菌 的澄清溶液；然后根据软骨细胞培养基的配方添加其他组分，最终采用酸碱调节试剂调节 pH值至7. 0-7. 5即可。
[0031] 再例如，当基础培养基为液体形态时，配置获取软骨细胞培养基的方法可以为：取 适量液体形态的基础培养基；根据软骨细胞培养基的配方添加其他组分，再采用酸碱调节 试剂调节PH值符合配方要求至7. 0-7. 5即可。
[0032] 其中，在此对所选择的酸碱调节试剂不做限制。优选的，可以为10% NaOH或者 10% HClo
[0033] 其中，对所述骨形成蛋白BMP-2、多西环素和地塞米松的含量不做限定，只要能够 实现刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质即