一种用于微骨折手术的软骨诱导基质及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及软骨修复领域，尤其设及一种用于微骨折手术的软骨诱导基质及制备 方法。
【背景技术】
[0002] 关节软骨损伤，无论是外伤还是病理原因造成的损伤都不能自发修复，而且通常 都会导致软骨的退行性病变，进而造成骨性关节炎。目前，主要采用是外源性修复方法，如 骨软骨移植、微骨折等。近几年，软骨组织工程技术被认为是修复大面积软骨损伤的唯一方 法，但软骨组织工程的主要方法是在体外培养种子细胞构建组织工程软骨，往往需要进行 两次手术，第一次手术取种子细胞，第二次进行组织工程软骨移植，体外构建周期长达2-3 周，存在手术难度大，细胞体外培养失率高，且会给病人造成多次额外损伤（取病人健康软 骨、开放性手术等）的缺点，且价格昂贵，故组织工程软骨的应用相对局限。故而现在软骨 损伤首选的治疗手段任是微骨折术。微骨折是利用关节透镜将软骨受损部位移除，再在软 骨下骨上钻孔，使骨髓细胞与血液凝结，成为平滑且坚固的修复组织，从而修复软骨全损的 手术。其优点是一次手术、微创、简单、经济等；缺点是骨髓细胞易流失、无法修复大面积的 损伤、无法形成透明软骨等缺点。事实上，由微骨折手术修复的软骨缺损因综上原因，只能 在缺损部位形成纤维软骨，无法使缺损软骨恢复成正常形态和功能，对病人的生活质量有 严重的影响。
【发明内容】
[0003] 为解决W上技术问题，本发明提出了一种用于微骨折手术的软骨诱导基质及制备 方法，具体设及了一种能在关节镜下操作的，与微骨折手术结合使用的软骨诱导基质及其 制备方法。
[0004] 本发明为解决其技术问题，所提供的技术方案为：
[0005] -种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，其特征在于，凝胶为纤 维蛋白，胶原蛋白，透明质酸，凝血酶；添加剂在培养基中的终浓度为：维生素〇:233μΜ~ 287μΜ;亚油酸：3. 7μΜ~8. 9μΜ;胆固醇：9μΜ~17μΜ;地塞米松：6ηΜ~15ηΜ;乙酷半 脫氨酸：43μΜ~58μΜ;转铁蛋白：18μg/mL~32μg/血；亚砸酸钢：22ηΜ~52ηΜ;泛酸 钢：13μΜ~24μΜ;生物素：28μΜ~43μΜ;膜岛素样生长因子：7μg/mL~18μg/血康 皮生长因子：2ng/mL~化g/mL;成纤维生长因子：2ng/mL~化g/mL;血小板衍生生长因子： 2ng/mL~化g/mL;转化生长因子：3化g/ml~70ng/ml;膜岛素铁砸传递蛋白：1%。添加剂 能为骨髓细胞提供生长所需，并诱导其往透明软骨方向分化。
[0006] 进一步，纤维蛋白lOOmg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5%。
[0007] 本技术方案的有益效果是，该基质能覆盖着病人软骨缺损处，并在5分钟内形成 凝胶，从而固定住骨髓细胞并能促进骨髓细胞往透明软骨方向分化。该基质包括纤维蛋白、 胶原蛋白、透明质酸、凝血酶、维生素C、亚油酸、胆固醇、地塞米松、转铁蛋白、生物素等，在 治疗软骨缺损时，只需在微骨折手术中注射该基质，操作简单方便。该基质解决了微骨折手 术骨髓细胞易流失、无法修复大面积的损伤、无法形成透明软骨等缺点。
[0008] -种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白 lOOmg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5% ;凝血酶50U/ml;添加剂在培养基中的终浓度 为：维生素0:250μΜ;亚油酸：4. 5μΜ;胆固醇：13μΜ;地塞米松：10nM;乙酷半脫氨酸： 50μΜ;转铁蛋白：25yg/mL;亚砸酸钢：30nM;泛酸钢：17μΜ;生物素：33μΜ;膜岛素样生 长因子：1〇μg/mL;表皮生长因子：5ng/mL;成纤维生长因子：5ng/mL;血小板衍生生长因 子：5ng/mL;转化生长因子：5化g/ml;膜岛素铁砸传递蛋白：1%。本技术方案的有益效果 是，该基质能覆盖着病人软骨缺损处，并在5分钟内形成凝胶，从而固定住骨髓细胞并能促 进骨髓细胞往透明软骨方向分化。该基质包括纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、凝血酶、维生 素C、亚油酸、胆固醇、地塞米松、转铁蛋白、生物素等，在治疗软骨缺损时，只需在微骨折手 术中注射该基质，操作简单方便。该基质解决了微骨折手术骨髓细胞易流失、无法修复大面 积的损伤、无法形成透明软骨等缺点。
[0009] -种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0010] 步骤一：将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酷半脫氨酸，转铁蛋白，亚砸酸 钢，泛酸钢，生物素，膜岛素样生长因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长 因子，转化生长因子，膜岛素铁砸传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基 中的最终浓度为：
[0011] 维生素 0:233μΜ~287μΜ;亚油酸：3. 7μΜ~8. 9μΜ;胆固醇：9μΜ~17μΜ; 地塞米松：6ηΜ~15ηΜ;乙酷半脫氨酸：43μΜ~58μΜ;转铁蛋白：18μg/mL~32μg/血； 亚砸酸钢：22nM~52nM;泛酸钢：13μΜ~24μΜ;生物素：28μΜ~43μΜ;膜岛素样生长 因子：7μg/mL~18μg/mL;表皮生长因子：2ng/mL~化g/mL;成纤维生长因子：2ng/mL~ 9ng/mL;血小板衍生生长因子：2ng/mL~化g/mL;转化生长因子：30ng/ml~70ng/ml;膜岛 素铁砸传递蛋白：1 %。
[0012] 步骤二：用步骤一配置溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶；
[0013] 步骤Ξ:在微骨折手术中，将步骤二中配置的四种溶剂混合注射进病人软骨缺损 部位；纤维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原 的激活作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软 骨细胞在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在基质中。
[0014] 进一步，步骤二中，纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶终浓度为：纤维蛋白 lOOmg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5% ;凝血酶50U/ml。
[0015] 进一步，步骤一中，添加剂在基础培养基中的最终浓度为：
[001引 维生素C:250μΜ;亚油酸：4. 5μΜ;胆固醇：13μΜ;地塞米松：10nM;乙酷半脫氨 酸：50μΜ;转铁蛋白：25μg/血；亚砸酸钢：30nM;泛酸钢：17μΜ;生物素：33μΜ;膜岛素 样生长因子：10μg/mL;表皮生长因子：5ng/mL;成纤维生长因子：5ng/mL;血小板衍生生 长因子：5ng/mL;转化生长因子：5化g/ml;膜岛素铁砸传递蛋白：1%。
[0017] 本技术方案的有益效果是：通过实施例4中对12只新西兰兔分成Ξ组进行实验， 无论是通过肉眼观察还是光镜组织学检查，采用本方法后，基质快速覆盖着兔软骨缺损处， 并在5分钟内形成凝胶，从而固定住骨髓细胞并能促进骨髓细胞往透明软骨方向分化。原 软骨缺损位置表面光滑，呈白色，完全填平，富有弹性，与周围软骨组织相似，基本无界限， 缺损基本愈合，修复组织细胞密度显著降低，基质均匀，细胞形态和排列接近正常软骨，修 复软骨呈透明软骨样。本发明能够在微骨折手术中固定骨髓细胞、覆盖缺损面积、诱导骨髓 细胞往透明软骨方向发展，满足众多的患者的临床应用，使其关节功能得到长期维持。
【附图说明】
[0018] 图1 :实施例4中光镜组织学检查A组；
[001引 图2 :实施例4中光镜组织学检查B、C组；
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合图示与具体实施例，进一步阐述本发明。
[0021] 实施例1 :
[0022] 本实施例，提供一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，它能够在微骨折手术中固 定骨髓细胞、覆盖缺损面积、诱导骨髓细胞往透明软骨方向发展，满足众多的患者的临床应 用，使其关节功能得到长期维持。
[0023] 一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白 lOOmg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5%;凝血酶50U/ml;该凝胶能在5分钟内覆盖软骨 缺损位置并凝固，为骨髓细胞提供固定支架；添加剂在培养基中的成分W终浓度计，包括： 维生素C:233μΜ~287μΜ;亚油酸：3. 7μΜ~8. 9μΜ;胆固醇：9μΜ~17μΜ;地塞米松： 6ηΜ~15ηΜ;乙酷半脫氨酸：43μΜ~58μΜ;转铁蛋白：18μg/mL~32μg/mL;亚砸酸钢： 22nM~52nM;泛酸钢：13μΜ~24μΜ;生物素：28μΜ~43μΜ;膜岛素样生长因子：7μg/ 血~18μg/mL;表皮生长因子：2ng/mL~9ng/mL;成纤维生长因子：2ng/mL~9ng/mL;血 小板衍生生长因子：2ng/mL~化g/mL;转化生长因子：3化g/ml~70ng/ml;膜岛素铁砸传 递蛋白：1 %。
[0024] 添加剂能为骨髓细胞提供生长所需，并诱导其往透明软骨方向分化。
[00巧]膜岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成 纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成 软骨细胞。
[002引 实施例2 :
[0027] 本实施例，提供一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，它能够在微骨折手术中固 定骨髓细胞、覆盖缺损面积、诱导骨髓细胞往透明软骨方向发展，满足众多的患者的临床应 用，使其关节功能得到长期维持。
[0028] -种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白 lOOmg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5% ;凝血酶50U/ml;该凝胶能在5分钟内覆盖软 骨缺损位置并凝固，为骨髓细胞提供固定支架；添加剂在培养基中的成分W终浓度计，包 括：维生素0:250μΜ;亚油酸：4. 5μΜ;胆固醇：13μΜ;地塞米松：10nM;乙酷半脫氨酸： 50μΜ;转铁蛋白：25yg/mL;亚砸酸钢：30nM;泛酸钢：17μΜ;生物素：33μΜ;膜岛素样生 长因子：1〇μg/mL;表皮生长因子：5ng/mL;成纤维生长因子：5ng/mL;血小板衍生生长因 子：5ng/mL;转化生长因子：5化g/ml;膜岛素铁砸传递蛋白：1%。
[0029] 添加剂能为骨髓细胞提供生长所需，并诱导其往透明软骨方向分化。
[0030] 膜岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成 纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成 软骨细胞。
[003。 实施例3:
[0032] 一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，包括如下步骤：
[0033] 步骤1 :将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酷半脫氨酸，转铁蛋白，亚砸酸 钢，泛酸钢，生物素，膜岛素样生长