因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长 因子，转化生长因子，膜岛素铁砸传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基 中的最终浓度为：
[0034] 维生素 0:233μΜ~287μΜ;亚油酸：3. 7μΜ~8. 9μΜ;胆固醇：9μΜ~17μΜ; 地塞米松：6ηΜ~15ηΜ;乙酷半脫氨酸：43μΜ~58μΜ;转铁蛋白：18μg/mL~32μg/mL; 亚砸酸钢：22nM~52nM;泛酸钢：13μΜ~24μΜ;生物素：28μΜ~43μΜ;膜岛素样生长 因子：7μg/mL~18μg/mL;表皮生长因子：2ng/mL~化g/mL;成纤维生长因子：2ng/mL~ 9ng/mL;血小板衍生生长因子：2ng/mL~化g/mL;转化生长因子：30ng/ml~70ng/ml;膜岛 素铁砸传递蛋白：1 %。
[0035] 膜岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成 纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成 软骨细胞。
[0036] 步骤2 :用步骤1配置溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶；使其 终浓度为：纤维蛋白lOOmg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5% ;凝血酶50U/ml;
[0037] 步骤3 :在微骨折手术中，将步骤2中配置的四种溶剂混合注射进病人软骨缺损部 位，该基质中的凝胶能在5分钟内覆盖软骨缺损位置并凝固，为骨髓细胞提供固定支架。纤 维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原的激活 作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软骨细胞 在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在基质中。
[003引 实施例4 :
[0039] 一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法：
[0040] 具体操作过程如下：
[0041] 步骤1 :将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酷半脫氨酸，转铁蛋白，亚砸酸 钢，泛酸钢，生物素，膜岛素样生长因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长 因子，转化生长因子，膜岛素铁砸传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基 中的最终浓度为：
[004引 维生素C:250μΜ;亚油酸：4. 5μΜ;胆固醇：13μΜ;地塞米松：10nM;乙酷半脫氨 酸：50μΜ;转铁蛋白：25μg/血；亚砸酸钢：30nM;泛酸钢：17μΜ;生物素：33μΜ;膜岛素 样生长因子：10μg/mL;表皮生长因子：5ng/mL;成纤维生长因子：5ng/mL;血小板衍生生 长因子：5ng/mL;转化生长因子：5化g/ml;膜岛素铁砸传递蛋白：1%。
[0043] 膜岛素样生长因子，表皮生长因子促进细胞生长并促进软骨细胞分泌蛋白的，成 纤维生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子用于诱导微骨折释放的干细胞诱导成 软骨细胞。
[0044] 步骤2 :用步骤1配置溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶；使其 终浓度为：纤维蛋白lOOmg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5% ;凝血酶50U/ml;
[0045] 步骤3 兔为实验对象，将12只新西兰兔分为A、B、CS组，用3%戊己比妥钢溶 液按照1.Oml/kg耳缘静脉注射麻醉，术区脱毛，舰伏消毒，取双膝内侧入路，显露骸股关节 面，用直径4mm空屯、平头钻在股骨裸间窝正中上方造成全层关节软骨缺损区，深及软骨下 骨W均匀出血为止，将Ξ组兔做成股骨裸软骨损伤模型。
[0046] A组在缺损部位进行微骨折手术并注射软骨诱导基质，该基质能在5分钟内覆盖 软骨缺损位置并凝固，为骨髓细胞提供固定支架；
[0047] B组在缺损部位不进行微骨折手术只注射软骨诱导基质；
[0048] C组在缺损部位只进行微骨折手术。
[0049] 12周后处死动物、取材，观察指标：
[0050] a肉眼观察：观察膝关节囊有无李缩、粘连和新生物形成，W及关节活动度、修复 组织的光滑性及其与周边组织的结合情况。
[0051] A组原软骨缺损位置表面光滑，呈白色，完全填平，富有弹性，与周围软骨组织相 似，基本无界限；
[0052] B、C组外观相似，缺损部位有纤维状填充，质软，没有弹性，与周围健康软骨有明显 界限，但也说明了只使用软骨诱导基质也对软骨缺损修复也有一定疗效。
[0053] b光镜组织学检查：将标本置于lOOg/L甲醒溶液中固定，脱巧，梯度乙醇脱水，石 蜡包埋后，切片行苏木素一伊红染色（肥）和甲苯胺蓝（TB)染色。光镜下对修复组织的性 质、表面特性和与正常软骨连接等进行组织学观察。采用Wakitanic制定的评分标准（见 表1)，双盲法对各标本进行组织学评分。实验结果见图1和图2。
[0054] 表1 :各组的Wnkitanic评分
[00巧]
[0056]
[0057] 由图1可知，A组缺损基本愈合，修复组织细胞密度显著降低，基质均匀，细胞形态 和排列接近正常软骨，修复软骨呈透明软骨样；
[005引 由图2可知，B、C对照组缺损表面不光滑，软骨细胞排列不规则，细胞密度小于正 常，缺损处为纤维结缔组织，界限清晰；
[0059] 可见A组的修复效果最好，其次是C组和B组。
[0060]W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，运些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
【主权项】
1. 一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，其特征在于，凝胶为纤 维蛋白，胶原蛋白，透明质酸，凝血酶；添加剂在培养基中的终浓度为：维生素C :233 μΜ~ 287 μΜ;亚油酸：3·7μΜ~8·9μΜ;胆固醇：9μΜ~17μΜ;地塞米松：6ηΜ~15ηΜ;乙酰半 胱氨酸：43 μΜ~58 μΜ ;转铁蛋白：18 μ g/mL~32 μ g/mL ;亚硒酸钠：22ηΜ~52ηΜ ;泛酸 钠：13μΜ~24μΜ ;生物素：28μΜ~43μΜ ;胰岛素样生长因子：7yg/mL~18yg/mL ;表 皮生长因子：2ng/mL~9ng/mL ;成纤维生长因子：2ng/mL~9ng/mL ;血小板衍生生长因子： 2ng/mL~9ng/mL ;转化生长因子：30ng/ml~70ng/ml ;胰岛素铁硒传递蛋白：1%。2. 根据权利要求1所述的一种用于微骨折手术的软骨诱导基质，其特征在于，纤维蛋 白100mg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5%。3. -种用于微骨折手术的软骨诱导基质，包括凝胶和添加剂，其特征在于，凝胶为纤维 蛋白100mg/ml;胶原蛋白25mg/ml;透明质酸5% ;凝血酶50U/ml;添加剂在培养基中的终 浓度为：维生素C:250yM;亚油酸：4. 5μΜ;胆固醇：13μΜ;地塞米松：10nM;乙酰半胱氨 酸：50μΜ;转铁蛋白：25yg/mL;亚硒酸钠：30nM;泛酸钠：17μΜ;生物素：33μΜ;胰岛素 样生长因子：10μg/mL;表皮生长因子：5ng/mL;成纤维生长因子：5ng/mL;血小板衍生生 长因子：5ng/mL;转化生长因子：50ng/ml;胰岛素铁硒传递蛋白：1%。4. 一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一：将维生素C，亚油酸，胆固醇，地塞米松，乙酰半胱氨酸，转铁蛋白，亚硒酸钠， 泛酸钠，生物素，胰岛素样生长因子，表皮生长因子，成纤维生长因子，血小板衍生生长因 子，转化生长因子，胰岛素铁硒传递蛋白添加到基础培养基中，使得添加剂在基础培养基中 的最终浓度为： 维生素C:233μΜ~287μΜ;亚油酸：3· 7μΜ~8. 9μΜ;胆固醇：9μΜ~17μΜ;地塞 米松：6ηΜ~15ηΜ;乙酰半胱氨酸：43μΜ~58μΜ;转铁蛋白：18μg/mL~32μg/mL;亚硒 酸钠：22nM~52nM;泛酸钠：13μΜ~24μΜ;生物素：28μΜ~43μΜ;胰岛素样生长因子： 7μg/mL~18μg/mL;表皮生长因子：2ng/mL~9ng/mL;成纤维生长因子：2ng/mL~9ng/ mL;血小板衍生生长因子：2ng/mL~9ng/mL;转化生长因子：30ng/ml~70ng/ml;胰岛素铁 砸传递蛋白：1 %。 步骤二：用步骤一配置溶剂分别溶解纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶； 步骤三：在微骨折手术中，将步骤二中配置的四种溶剂混合注射进病人软骨缺损部位； 纤维蛋白和凝血酶混合时，模拟凝血链级反应的最后一步，通过凝血酶对纤维蛋白原的激 活作用，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白固化物；胶原蛋白的作用是模拟软骨细 胞在体内的生长环境；透明质酸的作用是固定添加剂，使添加剂能有效存在基质中。5. 根据权利要求4所述的一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，其特征在 于，步骤二中，纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸和凝血酶终浓度为：纤维蛋白l〇〇mg/ml;胶原 蛋白25mg/ml;透明质酸5% ;凝血酶50U/ml。6. 根据权利要求4所述的一种用于微骨折手术的软骨诱导基质的制备方法，其特征在 于，步骤一中，添加剂在基础培养基中的最终浓度为： 维生素C:250yM;亚油酸：4. 5μΜ;胆固醇：13μΜ;地塞米松：10nM;乙酰半胱氨酸： 50μΜ;转铁蛋白：25yg/mL;亚硒酸钠：30nM;泛酸钠：17μΜ;生物素：33μΜ;胰岛素样生 长因子：1〇μg/mL;表皮生长因子：5ng/mL;成纤维生长因子：5ng/mL;血小板衍生生长因
【专利摘要】本发明提供了一种用于微骨折手术的软骨诱导基质及其制备方法，软骨诱导基质包括凝胶和添加剂，凝胶为纤维蛋白，胶原蛋白，透明质酸，凝血酶；添加剂在培养基中的终浓度为：维生素C：233μM～287μM；亚油酸：3.7μM～8.9μM；胆固醇：9μM～17μM；地塞米松：6nM～15nM；乙酰半胱氨酸：43μM～58μM；转铁蛋白：18μg/mL～32μg/mL；亚硒酸钠：22nM～52nM；泛酸钠：13μM～24μM；生物素：28μM～43μM；胰岛素样生长因子：7μg/mL～18μg/mL；表皮生长因子：2ng/mL～9ng/mL；成纤维生长因子：2ng/mL～9ng/mL；血小板衍生生长因子：2ng/mL～9ng/mL；转化生长因子：30ng/ml～70ng/ml；胰岛素铁硒传递蛋白：1％。
【IPC分类】C12N5/071, A61L27/50
【公开号】CN105255814
【申请号】CN201510706433
【发明人】柴勋, 吴国祥, 李文琳, 袁彩艳, 韩武梅, 张易
【申请人】上海科医联创生物科技有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月27日