一种纤维母细胞清洗液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞清洗液技术领域，具体设及一种纤维母细胞清洗液及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 纤维母细胞，也称为成纤维细胞，是疏松结缔组织的主要细胞成分，属于终末分化 细胞，由胚胎时期的间充质干细胞分化而来。纤维母细胞基本不具有分化功能但分裂功能 旺盛，在体外培养条件下能保持良好的分裂繁殖能力。皮肤内纤维母细胞的主要功能是分 泌胶原蛋白、弹力纤维、透明质酸等细胞外基质，运种来源于自身的胶原蛋白修复体系一旦 形成，它的生命旺盛期为10-15年。纤维母细胞是皮肤真皮中的主体细胞成分，它与自身分 泌的胶原纤维、弹性纤维及基质成分一同构成了真皮的主体。纤维母细胞的主要功能是：合 成和分泌胶原纤维、弹性纤维、基质大分子物质和某些生长因子，对维持皮肤的弹性和初性 具有重要作用，纤维母细胞的减少也是引起皱纹产生的重要原因。
[0003] 随着人们生活水平的提高，对自身的面容要求越来越高，更加注重容光焕发，目 前，在美容性整形中，非手术性治疗增长迅速，占据的比例已经超过了 70%。皮肤填充剂有 很多种类，由于纤维母细胞有合成胶原蛋白的功能，其运用也就迅速发展，所W自体纤维母 细胞注射除皱成为一种新兴的治疗方法。
[0004] 纤维母细胞是由人体皮肤组织中分离出来，由于表皮是暴露于空气中，寄生了多 种的微生物，要从皮肤组织中分离培养纤维母细胞，需要整个分离培养过程保持绝对无菌， 所W处理皮肤组织块过程中清除微生物是至关重要的步骤。 阳〇化]现有技术中，皮肤组织块处理过程中很多时候没办法把细菌等微生物消除掉，导 致培养中细胞被细菌污染，培养失败；为了防止培养的细胞被细菌污染，通常在培养液中加 入大量的抗生素，W抑制细菌生长，采用运种方式虽然在培养过程中没有出现大量细菌生 长，可细胞一旦到临床运用，被抑制的细菌就是埋下的重大隐患，对使用者的身体健康造成 影响，安全性不能满足人们的要求。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种纤维母细胞清洗液，其不会对消化 酶的活性造成影响，酶解活力好、消化时间短，获得的纤维母细胞数量充足，活率高，在大大 减少抗生素使用的同时，对细菌和真菌具有很强的抑制作用，对细胞起到良好的保护作用。
[0007] 本发明还提供一种纤维母细胞清洗液的制备方法。
[0008] 本发明通过W下技术方案实现该目的：
[0009] 一种纤维母细胞清洗液，所述清洗液的原料包括D-Hank'S液、两性霉素B、庆大霉 素，所述清洗液中两性霉素B的终浓度为0. 2-10ug/mU庆大霉素的终浓度为10-200U/mL。
[0010] 作为优选的方案，所述清洗液中两性霉素B的终浓度为0. 3-加g/mU庆大霉素的 终浓度为15-lOOU/mL。
[0011] 作为进一步优选的方案，其特征在于，所述清洗液中两性霉素B的终浓度为 0. 5ug/mU庆大霉素的终浓度为20U/mL。 阳012] 作为优选的，所述两性霉素B的浓度为0. 2%，所述庆大霉素的浓度为0. 3%。
[0013] 一种纤维母细胞清洗液的制备方法，包括W下步骤：
[0014] 分别将浓度为0. 2%的两性霉素B、浓度为0. 3%的庆大霉素加入到D-Hank'S液 中，使得两性霉素B的终浓度为0. 2-10ug/mU庆大霉素的终浓度为10-200U/mU混合均匀， 制得纤维母细胞清洗液。
[0015] 其中，所述D-Hank'S液事先于4°C的条件下储存。
[0016] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的纤维母细胞清洗液包括 D-Hank's液、两性霉素B、庆大霉素，所述清洗液中两性霉素B的终浓度为0. 2-lOug/mL，庆 大霉素的终浓度为10-200U/m，WD-Hank'S液为基础液体，不含Ca2+和Mg2%不会对消化酶 的活性造成影响，酶解活力好，消化时间短，获得的纤维母细胞数量充足，活率高，D-Hank'S 液中含有的葡萄糖能够在组织块清洗过程中能提供组织营养，保持更好的细胞活力到培养 阶段，有利于细胞生长，两性霉素B能有效抑制真菌生长，庆大霉素对细菌的生长有很强的 抑制作用，清洗液中抗生素用量总体减少，在大大减少抗生素使用的同时，对细菌和真菌具 有很强的抑制作用，对细胞起到良好的保护作用。
【附图说明】
[0017] 图1为对照组的细胞生长状态图。
[0018] 图2为实验组的细胞生长状态图。
【具体实施方式】
[0019] W下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。
[0020] 实施例1、
[0021] 本实施例提供一种纤维母细胞清洗液的制备方法，包括W下步骤：
[0022] 分别将浓度为0. 2 %的两性霉素B、浓度为0. 3 %的庆大霉素加入到D-Hank'S液 中，使得两性霉素B的终浓度为0. 2-lOug/mL，庆大霉素的终浓度为10-200U/mU混合均匀， 制得纤维母细胞清洗液。
[0023] 其中，所述D-Hank'S液事先于4°C的条件下储存。
[0024] 实施例2。 阳0巧]本实施例的纤维母细胞清洗液的原料包括D-Hank'S液、两性霉素B、庆大霉素，所 述清洗液中两性霉素B的终浓度为0.化g/mU庆大霉素的终浓度为lOU/mL。
[0026] 实施例3。
[0027] 本实施例的纤维母细胞清洗液的原料包括D-Hank'S液、两性霉素B、庆大霉素，所 述清洗液中两性霉素B的终浓度为0. 3ug/mU庆大霉素的终浓度为15U/mL。 阳0測 实施例4。
[0029] 本实施例的纤维母细胞清洗液的原料包括D-Hank'S液、两性霉素B、庆大霉素，所 述清洗液中两性霉素B的终浓度为加g/mU庆大霉素的终浓度为lOOU/mL。
[0030] 实施例5。
[0031] 本实施例的纤维母细胞清洗液的原料包括D-Hank's液、两性霉素B、庆大霉素，所 述清洗液中两性霉素B的终浓度为lOug/mU庆大霉素的终浓度为200U/mL。 阳0巧实施例6。
[0033] 本实施例的纤维母细胞清洗液的原料包括D-Hank'S液、两性霉素B、庆大霉素，所 述清洗液中两性霉素B的终浓度为0.加g/mU庆大霉素的终浓度为20U/mL。
[0034] 对比例1。
[0035] 本实施例配制常规细胞清洗液，所述常规细胞清洗液包括PBS、浓度为0. 2 %的青 霉素和浓度为0. 3 %的链霉素。
[0036] 实施例7、纤维母细胞清洗液的清洗试验
[0037] 1)选取雌雄小白鼠各5只（购买于广东省医学实验动物中屯、），体重均在20g左 右，正常条件饲养一周，随时观察小鼠皮肤状况，W防有皮肤病小鼠；
[0038] 2)用断颈法处死小鼠，选择小鼠较平坦的部位用脱毛膏去除绒毛；每只小鼠分别 用灭菌手术剪刀剪下1X1cm3皮肤组织块6块，随机分成两组，一组为对照组，一组为实验 组，置于50血离屯、管；
[0039] 3)实验组W实施例6配制而成的纤维母细胞清洗液离屯、清洗2遍，用眼科剪刀剪 成l-2mm2小块，再加纤维母细胞清洗液清洗3遍；对照组W对比例1配制而成的常规细胞 清洗液，同实验组处理方法处理组织块；
[0040] 4)用I型胶原酶置4°C消化化，转移置37°C消化完全，转移细胞到六孔板培养两 天，抽取培养上清，用注射器注射到梅里埃微生物培养仪检测瓶，培养3天，检测培养上清 是否有细菌，两组实验结果如表1所示：
[0041] 表1细菌检测实验结果
[0042]
[0043] 注：▲:为无细菌生长★:为有细菌生长
[0044] 由表1可知：实验组的清洗液清洗皮肤组织块没有细菌生长，细菌等微生物污染 率为0% ;而对照组在不同天数中四组都有细菌生长，细菌污染率为80%，说明实验组清洗 液对细菌和真菌具有很强的抑制作用，去除细菌较对照组效果显著。
[0045] 5)细胞形态观察实验
[0046] 废弃已经有细菌生长的对照组培养皿，选取没有细菌生长的培养皿换液继续培养 到第5天，实验组同样继续换液培养到第5天，观察两组细胞状态，实验结果分别如图1、2 所示，由图1、2可看出，培养到第五天时，实验组细胞生长良好，汇合度达到60%左右；对照 组细胞状态一般，数量稀少，说明本发明的纤维母细胞清洗液能够对细胞起到良好的保护 作用。
[0047] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种纤维母细胞清洗液，其特征在于，所述清洗液的原料包括D-Hank'S液、两性霉 素B、庆大霉素，所述清洗液中两性霉素B的终浓度为0. 2-10ug/mL，庆大霉素的终浓度为 10-200U/mL〇2. 根据权利要求1所述的纤维母细胞清洗液，其特征在于，所述清洗液中两性霉素B的 终浓度为〇. 3-5ug/mL，庆大霉素的终浓度为15-100U/mL。3. 根据权利要求2所述的纤维母细胞清洗液，其特征在于，所述清洗液中两性霉素B的 终浓度为〇. 5ug/mL，庆大霉素的终浓度为20U/mL。4. 根据权利要求1~3任意一项所述的纤维母细胞清洗液，其特征在于，所述两性霉素 B的浓度为0. 2 %，所述庆大霉素的浓度为0. 3 %。5. -种纤维母细胞清洗液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 分别将浓度为〇. 2%的两性霉素B、浓度为0. 3%的庆大霉素加入到D-Hank's液中，使 得两性霉素B的终浓度为0. 2-10ug/mL，庆大霉素的终浓度为10-200U/mL，混合均匀，制得 纤维母细胞清洗液。6.根据权利要求5所述的纤维母细胞清洗液的制备方法，其特征在于，所述D-Hank' s 液事先于4°C的条件下储存。
【专利摘要】本发明涉及细胞清洗液技术领域，具体涉及一种纤维母细胞清洗液及其制备方法，本发明的细胞清洗液以D-Hank’s液为基础液体，不含Ca2+和Mg2+，不会对消化酶的活性造成影响，酶解活力好，消化时间短，获得的纤维母细胞数量充足，活率高，D-Hank’s液中含有的葡萄糖能够在组织块清洗过程中能提供组织营养，保持更好的细胞活力到培养阶段，有利于细胞生长，两性霉素B能有效抑制真菌生长，庆大霉素对细菌的生长有很强的抑制作用，清洗液中抗生素用量总体减少，在大大减少抗生素使用的同时，对细菌和真菌具有很强的抑制作用，对细胞起到良好的保护作用。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105255815
【申请号】CN201510726086
【发明人】葛啸虎, 陈海佳, 王一飞, 黎娟妹
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月29日