一种血清淀粉样蛋白a的检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及免疫分析领域，尤其涉及一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及检测方法。本发明提供的试剂盒中，反应液与全血样品能够良好的配合，从而使得本发明的试剂盒能够直接对全血进行检测，从而使得在临床使用过程中，不必抽取静脉血分离血清，而仅以指尖血即可完成检测。与现有技术相比，本发明的试剂盒的线性范围更广(2.4～240mg/L)；检测限更低(2.39mg/L)，说明本发明提供的试剂盒具有良好的线性范围和灵敏度；检测样本平均回收率为101.87％，比例系统误差＜5％，说明本发明提供的试剂盒具有良好的准确度。分别对高值质控和低值质控检测10次，变异系数＜3％，说明本发明提供的试剂盒具有良好的精密度。
【专利说明】
一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及免疫分析领域，尤其涉及一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及检测 方法。
【背景技术】
[0002] 血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein，SAA)是一种急性时相反应蛋白，在 感染、外伤等急性炎症反应过程中SAA浓度上升极快，短时间经IL-1、IL-6和TNF刺激，由肝 脏中被激活的巨噬细胞和纤维母细胞大量合成，可升高到最初浓度的1000倍以上，这种特 性也使得SAA成为目前最敏感的急性炎症标志物之一。同时，在包括心血管疾病、肥胖、强直 性脊柱炎在内的各种慢性炎症病理状态下，人类的脂肪细胞、血管内皮细胞及单核-巨噬细 胞等肝外组织也能合成分泌SAA蛋白并导致血清SAA水平呈一定程度的升高。
[0003] 同SAA类似，C反应蛋白（CRP)的浓度也是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，细 菌感染时二者浓度升高相平行，病毒感染时，SAA在康复期消失更快。SAA在炎性反应大约8h 后开始升高，且超过参考范围上限时间早于CRP。在感染性疾病中，SAA的绝对上升要高于 CRP，因此SAA测定，尤其对微小急性相反应可提供更好的鉴别。通常约三分之二感冒患者 SAA升高，但少于一半的患者相同表现CRP升高。对于病毒感染、肾移植排斥反应的患者(特 别是进行免疫抑制治疗的患者）以及用肾上腺皮质激素治疗的囊性纤维化患者方面，SAA的 检测比CRP更确凿、快速。研究发现，在患炎性关节炎的案例中，SAA与疾病活动性的关系最 密切。对于SAA淀粉样变性患者，以将SAA水平回复至正常为宗旨的治疗，能改善病情。SAA生 理浓度大约是CRP的10倍，因此监测SAA升高就比CRP容易。
[0004] 作为感染性疾病的初筛，SAA检测已经在很多医院开展，市场上已出现不同方法检 测的试剂盒。在SAA的散射比浊法方面，现有技术中的试剂盒仅能实现对血清中SAA的检测， 尽管能够抵抗一定的血红蛋白的干扰，但血红蛋白含量高于4g/L，则无法进行检测。正常人 血液内血红蛋白的含量为11 〇g/L~160g/L，故而，现有技术中的试剂盒无法实现对全血的 检测。而静脉取血分离血清所需的血量大。若能实现对手指末梢的全血中SAA的直接定量则 能够缩短检测时间，减少检测成本，对人体损伤也较小。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂 盒及检测方法，本发明提供的试剂盒具有良好的灵敏度和精密度，可用于全血的检测，且检 测方法耗时较短。
[0006] 本发明提供的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒包括抗体混悬液和反应液；
[0007] 抗体混悬液包括:SAA抗体微球偶联物、缓冲液、稳定剂、防腐剂;pH值为6~9;
[0008] 反应液包括:缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂和促凝剂;pH值为6~9。
[0009] 本发明提供的试剂盒中，反应液与全血样品能够良好的配合，故而使本发明的试 剂盒在检测SAA时能够具有良好的灵敏性和精密性。更重要的是，本发明试剂盒中的反应液 配方经过优化，从而使得本发明的试剂盒能够直接对全血进行检测，从而使得在临床使用 过程中，不必抽取静脉血分离血清，而仅以指尖血即可完成检测。
[0010] 在一些实施例中，SAA抗体微球偶联物的质量分数为0.05%~1 % ;
[0011] SAA抗体微球偶联物由SAA抗体与乳胶微球偶联制得，所述乳胶微球为聚苯乙烯微 球，其表面官能团为羧基、氨基、醛基、酰肼、环氧基或氯甲基。
[0012] 作为优选，表面官能团为羧基。
[0013] 作为优选，SAA抗体微球偶联物的质量分数为0.1 %~0.5%。
[0014] SAA抗体微球偶联物是将SAA抗体与乳胶微球或乳胶颗粒进行偶联后的产物，本发 明中，SAA抗体微球偶联物中的抗体可为单克隆抗体，也可为多克隆抗体。其获得方式可为 自制也可于市场购得。SAA抗体与乳胶偶联的步骤可为自行制备，也可通过商业途径获得， 本发明对此不作限定。本发明使用的单克隆抗体购自Meridian公司（货号：H86177M， H86178M)。与抗体偶联的乳胶微球为羧基聚苯乙烯微球。
[0015] SAA抗体微球偶联物的制备方法包括:羧基聚苯乙烯微球以MES缓冲液悬浮，以碳 二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化后，以MES缓冲液或HEPES缓冲液重悬，然后与SAA抗体 混合进行偶联反应，再在含BSA的缓冲液中封闭、清洗，最后用合适的储存液悬浮制成。 [0016]具体的，SAA抗体微球偶联物的制备方法为:将羧基聚苯乙烯微球，加10mM~100mM 的MES(pH6 ? 0)缓冲液清洗2-3次，然后用10mM~100mM MES(pH6 ? 0)缓冲液定容至0 ? 5%~ 2 % (质量体积比）浓度；向其中加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌15~ 40min进行活化后，以10mM~100mM HEPES或MES缓冲液清洗2次，用10mM~100mM HEPES或 MES缓冲液定容至0.2%~1 % (质量体积比）浓度;将活化清洗后的微球悬液加入等体积的 0.01 %~0.2 %的SAA抗体溶液中，室温搅拌2~6h，加0.1 %~1 % (质量体积比）BSA室温搅 拌1~6h，再用含0.1 %~1 % (质量体积比)BSA的10mM~100mM的HEPES或Tris盐酸缓冲液清 洗2次，并最终分散在合适的储存液中，制得SAA抗体微球偶联物。
[0017] 在本发明的实施例中，抗体混悬液中，
[0018] 缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tri s盐 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或Good ' s缓冲液。
[0019] 优选的，缓冲液选自HEPES缓冲液或Tris盐酸缓冲液；
[0020] 稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖或聚乙烯吡咯烷酮。
[0021] 优选的，稳定剂为牛血清白蛋白或鹿糖。
[0022]防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、大环内酯类抗生素、对羟基苯甲酸或ProClin系列。 [0023]优选的，防腐剂为叠氮钠或Pr〇Clin300。
[0024] 在本发明的实施例中，抗体混悬液中，
[0025] 缓冲液的浓度为10mmol/L~500mmol/L。
[0026]优选的，缓冲液的浓度为20~50mmol/L。
[0027]稳定剂的质量分数为0.01 %~5%。
[0028]优选的，稳定剂的质量分数为0.1 %~3%。
[0029]防腐剂的质量分数为0 ? 05%~1 %。
[0030]优选的，防腐剂的质量分数为0 ? 05%~0 ? 1 %。
[0031]作为优选，抗体混悬液中，
[0032] 缓冲液为HEPES缓冲液或Tris盐酸缓冲液;其浓度为20mmol/L~50mmol/L;
[0033] 稳定剂为牛血清白蛋白或蔗糖;其质量分数为0.1 %~3% ;
[0034]防腐剂为叠氮钠或ProClin300;其质量分数为0.05%~0.1 %。
[0035]在一些实施例中，抗体混悬液中包括：SAA抗体微球偶联物、HEPES缓冲液、BSA、叠 氮钠;pH值为7.5。
[0036] 在此实施例中，抗体混悬液中各组分的浓度为： SAA抗体微球偶联物 0.12 wt%; HEPES 20nii-nol/L;
[0037] 牛血清白蛋白 1 vvt %; 叠氮钠 （h09wt%。
[0038] 在一些实施例中，抗体混悬液中包括:SAA抗体微球偶联物、Tris盐酸缓冲液、BSA、 蔗糖、ProCl in300; pH 值为8 ? 0。
[0039] 在此实施例中，抗体混悬液中各组分的浓度为： SAA抗体微球偶联物 0.4 Wt%； Tris盐酸缓冲液 20mmol/L;
[0040] 牛血清白蛋白 0.2 wt %; 蔗糖 3 wt% PxoClinBOQ 0.1 wt %。
[0041]在本发明的实施例中，反应液中，
[0042]缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tri s盐 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或Good ' s缓冲液。
[0043]优选的，缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris盐酸缓冲液；
[0044] 电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁或硫酸镁。
[0045] 优选的，电解质为氯化钠。
[0046] 表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、吐温-20或曲拉通X-100。
[0047] 优选的，表面活性剂为十二烷基硫酸钠或吐温-20。
[0048]防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、大环内酯类抗生素、对羟基苯甲酸或ProClin系列。 [0049] 优选的，防腐剂为叠氮钠或ProClin300。
[0050] 促凝剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖。
[0051 ] 优选的，促凝剂为聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。
[0052]在本发明的实施例中，反应液中，
[0053] 缓冲液的浓度为10mmol/L~500mmol/L。
[0054]优选的，缓冲液的浓度为20~100mm〇l/L。
[0055]电解质的浓度为 50mmol/L ~1000mmol/L。
[0056] 优选的，电解质的浓度为100~300mmol/L。
[0057]表面活性剂的质量分数为0.01 %~1 %。
[0058]优选的，表面活性剂的质量分数为0.01 %~0.1 %。
[0059]防腐剂的质量分数为0.05%~1 %。
[0060]优选的，防腐剂的质量分数为0 ? 05%~0 ? 1 %。
[0061 ]促凝剂的质量分数为0 ? 1 %~10 %。
[0062]优选的，促凝剂的质量分数为1 %~5%。
[0063]在本发明的实施例中，反应液中，
[0064] 缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris盐酸缓冲液;其浓度为20mmol/L~100mmol/L;
[0065] 电解质为氯化钠;其浓度为100mmol/L~300mmol/L;
[0066]表面活性剂为十二烷基硫酸钠和吐温-20;其质量分数为0.01 %~0.1 % ;
[0067]防腐剂为叠氮钠或ProClin300;其质量分数为0.05%~0.1 % ;
[0068] 促凝剂为聚乙二醇6000或聚乙二醇8000;其质量分数为1~5%。
[0069] 在一些实施例中，反应液中包括:磷酸盐缓冲液、氯化钠、十二烷基硫酸钠、吐温-20、叠氮钠、聚乙二醇6000，pH值为7.4。
[0070] 在此实施例中，反应液中各组分的浓度为： 磷酸盐缓冲液 20mmol/L; 氯化钠 ：300 mn.iol/L; 十二烷基硫酸钠 0.02 wt%;
[0071] 吐温-20 0.1% 叠氮钠 0.09wt%; 聚乙二醇6000 〗wr%。
[0072] 在一些实施例中，反应液中包括:Tris盐酸缓冲液、氯化钠、十二烷基硫酸钠、吐 温-20、ProCl in300、聚乙二醇8000，pH 值为7 ? 6。
[0073] 在此实施例中，反应液中各组分的浓度为： Tris盐酸缓冲液 50mmol,/L; 氯化钠 l_0:0_mmol/L.:;: 十二烷基硫酸钠 0.05 wt%;
[0074] 吐温-20 0,05% ProClin300 0,1 wt%; 聚乙二醇 8000 1,5 wt%。
[0075] 本发明提供的试剂盒中还包括校准品溶液，其中包括SAA抗原、缓冲液、电解质、稳 定剂和防腐剂。
[0076] 在本发明实施例中，校准品溶液中，
[0077] 校准品的主要成分为SAA抗原;所述的SAA抗原可以是重组抗原或天然抗原；
[0078]缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tri s盐 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或Good ' s缓冲液。
[0079]优选的，缓冲液为磷酸盐缓冲液。
[0080]电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁或硫酸镁。
[0081 ]优选的，电解质为氯化钠。
[0082] 稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖或海藻糖。
[0083] 优选的，稳定剂为牛血清白蛋白；
[0084]防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、大环内酯类抗生素、对羟基苯甲酸或ProClin系列。 [0085]优选的，防腐剂为叠氮钠。
[0086] 在本发明的实施例中，校准品溶液中，
[0087] 缓冲液的浓度为10mmol/L~500mmol/L。
[0088] 优选的，缓冲液的浓度为10mmol/L~50mmol/L;
[0089]电解质的质量分数为0.01 %~5%。
[0090] 优选的，电解质的质量分数为0.9%。
[0091] 稳定剂的质量分数为0.01 %~5%。
[0092]优选的，稳定剂的质量分数为1%~5%。
[0093]防腐剂的质量分数为0.05%~1 %。
[0094]优选的，防腐剂的质量分数为0.05%~0.1 %。
[0095]作为优选，校准品溶液中，
[0096]缓冲液为磷酸盐缓冲液;其浓度为20mmol/L;
[0097]电解质为氯化钠;其质量分数为0.9% ;
[0098]稳定剂为牛血清白蛋白；其质量分数为5% ;
[0099]防腐剂为叠氮钠;其质量分数为0.09%。
[0100] 本发明提供的试剂盒通过定时散射比浊测试法对SAA进行检测。其使用方法为：
[0101] 将待测样品与反应液混合后，测定光电值记为S1;再与混悬液混合，然后测定光电 值记为S2;根据S2-S1值，以标准曲线法计算待测样品中SAA的含量;所述的待测样品为手指 末梢全血、抗凝静脉全血、血浆或血清，优选手指末梢全血。
[0102] 具体的，首先用生理盐水将校准品梯度稀释5个浓度，获得6个浓度校准品溶液，分 别取少量与反应液混合，再加入SAA抗体混悬液，此时仪器读取的散射光电值记为S1，待反 应一段时间后，散射光电值记为S2，以校准品浓度为横坐标，S2-S1散射光电值差值为纵坐 标拟合方程建立标准曲线。其次，可将待测样品与反应液混合，再与SAA抗体混悬液混合，将 S2-S1散射光电值差值带入标准曲线中，即可计算待测样品中SAA的含量。
[0103] 所述的检测方法为定时散射比浊法;所述的检测仪器为特定蛋白分析仪;所述反 应时间为90~150秒，优选120秒。
[0104] 本发明提供的试剂盒中，反应液与全血样品能够良好的配合，从而使得本发明的 试剂盒能够直接对全血进行检测，从而使得在临床使用过程中，不必抽取静脉血分离血清， 而仅以指尖血即可完成检测。与现有技术相比，本发明的试剂盒的线性范围更广（2.4~ 240mg/L);检测限更低(2.39mg/L)，说明本发明提供的试剂盒具有良好的线性范围和灵敏 度;检测样本平均回收率为101.87%，比例系统误差<5%，说明本发明提供的试剂盒具有 良好的准确度。分别对高值质控和低值质控检测10次，变异系数<3%，说明本发明提供的 试剂盒具有良好的精密度。
【附图说明】
[0105] 图1示实施例1本发明试剂盒的标准曲线；
[0106] 图2示实施例1本发明试剂盒与同类试剂盒的相关性比较；
[0107] 图3示实施例1本发明试剂盒的线性范围。
【具体实施方式】
[0108] 本发明提供了一种血清淀粉样蛋白A的检测试剂盒及检测方法，本领域技术人员 可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已 经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本 文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0109] 本发明采用的试剂、样品、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0110] 本发明SAA单克隆抗体购自Meridian公司（货号：H86177M，H86178M);羧基聚苯乙 烯微球购自Thermo Fisher公司（货号:C37479);BSA、碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺均 购自Aladdin公司（BSA货号:A104912-25g，碳二亚胺货号:E106172-5g，N-羟基硫代琥珀酰 亚胺货号:H109337-5g);其他化学试剂为分析纯。
[0111] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0112] 实施例1本发明提供的试剂盒
[0113] 反应液组分： 组分 浓度 磷酸盐缓冲液 mmol/L 氯化纳 300mmol/L 十二烷基硫酸钠0.02wt%
[0114] 吐温20 CU% (体?积筲分>匕） 叠氮钠 0.09wt% 聚乙二醇6000 lwt% pH 值 7,4
[0115] SAA抗体混悬液组分： 组分 浓度 SAA抗体微球偶联物0.12% HEPES 缓冲液 20mnuWL
[0116] 牛血清白蛋白 lwt% 叠氮钠 0.09wt% pH 值 1.5
[0117]校准品溶液组分： 组分 浓度 SAA 抗原 200mg/L 嶙酸盐缓冲液20mmol/L:
[0118] 氯化納 0.9 wt% 牛血清白蛋白5 wt% 叠氮钠 0.09wt% pH 值 7,4
[0119] 其中，反应液配制为将各组分混合后，0.22微米滤膜过滤，分装，-20°C保存。
[0120] 抗体混悬液的配制为：
[0121] 取10mg羧基聚苯乙烯微球，加适量50mM MES pH6.0缓冲液清洗2-3次，最后用50mM MES pH6.0缓冲液定容至0.5 % (质量体积比）浓度。向活化的聚苯乙烯微球中加入碳二亚胺 和N-羟基硫代琥珀酰亚胺适量，室温搅拌20min，20mM HEPES pH7.5缓冲液清洗2次，用20mM HEPES pH7.5缓冲液定容至1 % (质量体积比）浓度。将活化清洗后的微球等体积加入0.1 % 浓度的SAA抗体溶液中，室温搅拌2h，加1 % (质量体积比）BSA室温搅拌lh，再用含1 % (质量 体积比)BSA的20mM HEPES pH7.5缓冲液清洗2次，最后将SAA抗体微球偶联物按0.12%浓度 分散至含1% (质量体积比)BSA的20mM HEPES pH7.5缓冲液中，其中添加叠氮钠质量分数为 0.09%，制成SAA抗体混悬液。
[0122] 校准品溶液的配制为：
[0123] 将一定浓度的SAA抗原添加于含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，使其终浓度 为200mg/L，其中添加0.9 %氯化钠和0.09 %叠氮钠，0.22微米滤膜过滤，分装，-20 °C保存。 经溯源赋值后可作为校准品使用。
[0124] 实施例2本发明提供的试剂盒
[0125] 反应液组分： 组分 浓度 嶙酸盐缓冲液 50mmol/L 氯化納 200mmol/L 十二烷基硫酸钠0.03wt%
[0126] 吐温-20 0.05% (体积百分比） 叠氮钠 0.09wt% 聚乙二醇6000 2wt% pH 值 7.4
[0127] SAA抗体混悬液组分： 组分 浓度 SAA抗体微球偶联物0.2wt% HEPES 缓冲液 50mmol/L
[0128] 牛血清白蛋白 0.5wt% 蔗糖 2wi:% 叠氮钠 0.09wt% pH 值 7.5
[0129] 校准品溶液组分： 组分 浓度 SAA 抗原 220mg/L 磷酸盐缓冲液20mmo.l/L
[0130] 氯化钠 0.9wt% 牛血清白蛋白5 wt% 叠氮納 0.09wt% pH 值 7.4
[0131]其中，反应液配制为将各组分混合后，0.22微米滤膜过滤，分装，-20°C保存。
[0132] 抗体混悬液的配制为：
[0133] 取10mg羧基聚苯乙烯微球，加适量25mM MES pH6.0缓冲液清洗2-3次，最后用25mM MES pH6.0缓冲液定容至1 % (质量体积比）浓度。向活化的聚苯乙烯微球中加入碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺适量，室温搅拌20min，50mM HEPES pH7.5缓冲液清洗2次，用20mM HETOS pH7.5缓冲液定容至0.5 % (质量体积比）浓度。将活化清洗后的微球等体积加入 0.08 %浓度的SAA抗体溶液中，室温搅拌3h，加0.5 % (质量体积比）BSA室温搅拌lh，再用含 0.5 % (质量体积比)BSA的50mM HEPES pH7.5缓冲液清洗2次，最后将SAA抗体微球偶联物按 0.2 %浓度分散至含0.5 % (质量体积比）BSA和2 % (质量体积比）蔗糖的50mM HEPES pH7.5 缓冲液中，添加叠氮钠值质量分数为0.09%，制成SAA抗体混悬液。
[0134] 校准品溶液的配制为：
[0135] 将一定浓度的SAA抗原添加于含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，使其终浓度 为220mg/L，其中添加0.9 %氯化钠和0.09 %叠氮钠，0.22微米滤膜过滤，分装，-20 °C保存。 经溯源赋值后可作为校准品使用。
[0136] 实施例3本发明提供的试剂盒
[0137] 反应液组分： 组分 浓度 Tris盐酸缓冲液 lOOmmol/L 氯化納 150mmol/L 十二坑基硫酸納〇,〇 1 wt%
[0138] 吐温-20 0.1% (体积百分比) ProClin300 0.1 wt% 聚乙二醇8000 5wt% pH 值 7 8
[0139] SAA抗体混悬液组分： 组分 浓度
[0140] SAA抗体微球偶联物0.3wt% Tris-HCI 缓冲液 20mmol/L 牛血清白蛋白 1 wt%
[0141] ProClinBOO 0.1 wt% pH 值 8_0
[0142] 校准品溶液组分： 组分 浓度 SAA 抗原 250mg/L 磷酸盐缓冲液20mmol/L
[0143] 氯化纳 0.9wt% 牛血清白蛋白：5wt% 叠氮钠 0.09% pH 7.4
[0144] 其中，反应液配制为将各组分混合后，0.22微米滤膜过滤，分装，-20°C保存。
[0145] 抗体混悬液的配制为：
[0146] 取10mg羧基聚苯乙烯微球，加适量25mM MES pH6.0缓冲液清洗2-3次，最后用25mM MES pH6.0缓冲液定容至0.5 % (质量体积比）浓度。向活化的聚苯乙烯微球中加入碳二亚胺 和N-羟基硫代琥珀酰亚胺适量，室温搅拌20min，25mM MES pH6.0缓冲液清洗2次，用25mM MES pH6.0缓冲液定容至0.5 % (质量体积比）浓度。将活化清洗后的微球等体积加入0.05 % 浓度的SAA抗体溶液中，室温搅拌3h，加1 % (质量体积比）BSA室温搅拌lh，再用含2% (质量 体积比)BSA的20mM Tris-HCI pH8.0缓冲液清洗2次，最后将SAA抗体微球偶联物按0.3%浓 度分散至含1% (质量体积比）BSA的20mM Tris-HCI pH8.0缓冲液中，添加 ProClin300质量 分数为〇. 1 %，制成SAA抗体混悬液。
[0147] 校准品溶液的配制为：
[0148] 将一定浓度的SAA抗原添加于含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，使其终浓度 为250mg/L，其中添加0.9 %氯化钠和0.09 %叠氮钠，0.22微米滤膜过滤，分装，-20 °C保存。 经溯源赋值后可作为校准品使用。
[0149] 实施例4本发明提供的试剂盒 [0150] 反应液组分： 组分 浓度 Tri s-HC 丨缓冲液 50iTimol/L 氯化纳 100mmol/L 十二炫基硫酸纳0.05wt%
[0151] 吐温20 0.05% (体积百分比） ProClm300 0? 1% (体积百分比） 聚乙二醇 8000 1,5wt% pH 值 7'6
[0152] SAA抗体混悬液组分： 组分 浓度 SAA抗体微球偶联物0.4wt% Tris-HC 丨缓冲液 20mmol/L
[0153] 牛血清白蛋白 0.2wt% 蔗糖 3% ProClin300 0?丨％ (体积百分比） pH 值 ：8.0
[0154] 标准品溶液组分： 组分 浓度 SAA 抗原 l80mg，L 嶙酸盐缓冲液20mmol/L
[0155] .氯化納 ().9wt/0 牛jk清白蛋白5 wt% 叠氮钠 0.09% pH 7.4
[0156]其中，反应液配制为将各组分混合后，0.22微米滤膜过滤，分装，-20°C保存。
[0157] 抗体混悬液的配制为：
[0158] 取10mg羧基聚苯乙烯微球，加适量20mM MES pH6.0缓冲液清洗2-3次，最后用20mM MES pH6.0缓冲液定容至0.5 % (质量体积比）浓度。向活化的聚苯乙烯微球中加入碳二亚胺 和N-羟基硫代琥珀酰亚胺适量，室温搅拌20min，20mM MES pH6.0缓冲液清洗2次，用20mM MES pH6.0缓冲液定容至0.5 % (质量体积比）浓度。将活化清洗后的微球等体积加入0.02 % 浓度的SAA抗体溶液中，室温搅拌4h，加1 % (质量体积比）BSA室温搅拌lh，再用含1 % (质量 体积比)BSA的20mM Tris-HCl pH8.0缓冲液清洗2次，最后将SAA抗体微球偶联物按0.4%浓 度分散至含〇. 2 % (质量体积比）BSA和3 %蔗糖（质量体积比）的20mM Tris-HCl pH8.0缓冲 液中，添加 Pr〇Clin300质量分数为0.1%，制成SAA抗体混悬液。
[0159] 校准品溶液的配制为：
[0160] 将一定浓度的SAA抗原添加于含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，使其终浓度 为180mg/L，其中添加0.9 %氯化钠和0.09 %叠氮钠，0.22微米滤膜过滤，分装，-20 °C保存。 经溯源赋值后可作为校准品使用。
[0161 ]实施例5本发明提供试剂盒的使用方法
[0162] 以实施例1制备的试剂盒为实验对象，以国赛特定蛋白分析仪为例，采用定时散射 比浊法测试：
[0163] a.建立标准曲线（如图1所示）：将SAA校准品梯度稀释至6个浓度，分别取2iiL校准 品加至500此反应液中混匀，再加40yLSAA抗体混悬液混匀，此时仪器读取一个散射光电值 S1，120秒后，仪器再读取一个散射光电值S2，以浓度为横坐标，S2-S1散射光电值差值为纵 坐标拟合曲线，即为标准曲线。所得标准曲线的拟合公式为y = -〇. 000x3+0.07 lx2+28.58x-58.54；R2 = 0.999〇
[0164] b.全血样品的检测：取待测人全血样品2yL加至500yL的反应液中混匀，再加40y LSAA抗体混悬液混匀，将所得的S2-S1散射光电值差值为2127,带入标准曲线，计算出待测 样品中SAA的含量为65 ? 74mg/L。
[0165] 实施例6本发明提供试剂盒的检测限
[0166] 实验方法：
[0167] 用零浓度校准品或样品稀释液作为空白样品进行检测，重复测定20次，得出20次 结果的散射光电值，计算其平均值(Xm)和标准差(SD)，得出X m+2SD，将Xm+2SD值带入标准曲 线方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限。
[0168] 实验结果：
[0169] 20次测试的散射光电值经计算入表1所示，将Xm+2SD值带入标准曲线方程，得到最 低检测限为2.39mg/L。
[0170] 表1本发明试剂盒检测限
[0172] 实施例7本发明提供试剂盒的精密度
[0173] 实验方法：
[0174] 配制特定浓度的SAA高值质控(靶值为99mg/L)和低值质控(靶值为22mg/L)各一 份，以本发明实施例1提供的试剂盒对每份质控物各进行10次检测，分别计算检测结果的平 均值(xm)、标准差(SD)和变异系数(CV% )，CV% = SD/XmX 100%。
[0175] 实验结果：
[0176] 高值质控的变异系数为1.38%，低值质控的变异系数为2.34%，均小于10%，说明 本发明试剂盒的精密度良好。本发明其他实施例提供的试剂盒的检测结果与此相似。结果 见表2。
[0177] 表2本发明试剂盒精密度
[0179] 实施例8本发明提供试剂盒的准确度
[0180] 实验方法：
[0181 ]取一定浓度的常规检测样本(静脉全血），分三份，每份lmL，向其中一份加入浓度 为100mg/L的SAA溶液O.lmL，制成分析样本1;向其中一份加入浓度为500mg/L的SAA溶液 0. lmL，制成分析样本2;另一份加入生理盐水0. lmL，制成基础样本。分别对基础样本和分析 样本1，2进行测试，每个样本测试三次计算均值，并计算回收率和比例系统误差。
[0182] 回收率=(分析样本测试均值-基础样本测试均值)/加入浓度X 100%
[0183] 平均回收率=(回收率1+回收率2)/2X100%
[0184] 比例系统误差=1100%-平均回收率
[0185] 实验结果：
[0186] 如表3所示，平均回收率为101.87%，比例系统误差为1.87%小于5%，说明本发明 的试剂盒检测结果准确度较高。本发明其他实施例提供的试剂盒的检测结果与此相似。
[0187] 表3本发明试剂盒准确度
[0189] 实施例9本发明提供试剂盒的线性范围
[0190] 实验方法：
[0191] 配制240mg/LSAA高浓度样本，将其用生理盐水稀释100倍至2.4mg/L，再将二者进 行倍比稀释，得到5个浓度的样本，记为理论值(T)。用本发明实施例1提供的试剂盒分别对 每个浓度的样本平行测定3次，计算平均值(X m)，以稀释浓度理论值为X轴，以检测浓度平均 值为Y轴用EXCEL软件绘制散点图，用最小二乘法进行直线拟合，软件自动计算出相关系数 R2,并计算线性偏差B，B= (T-Xm)/TX 100%。
[0192] 实验结果：
[0193] 线性回归方程为Y = 0.982X+2.365，相关系数R2 = 0.997，并且线性偏差在± 10 % 以内，说明本发明试剂盒在2.4~240mg/L内线性回归良好。本发明其他实施例提供的试剂 盒的检测结果与此相似。如图3所示。具体数据见表4。
[0194] 表4本发明试剂盒线性范围
[0196]以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，包括抗体混悬液、反应液； 所述抗体混悬液包括:SAA抗体微球偶联物、缓冲液、稳定剂、防腐剂;pH值为6~9; 所述反应液包括:缓冲液、电解质、表面活性剂、防腐剂和促凝剂;PH值为6~9。2. 根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，其中，所述SAA抗 体微球偶联物的质量分数为0.05%~1 % ; 所述SAA抗体微球偶联物由SAA抗体与乳胶微球偶联制得，所述乳胶微球为聚苯乙烯微 球，其表面官能团为羧基、氨基、醛基、酰肼、环氧基或氯甲基。3. 根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，所述抗体混悬液 中， 所述缓冲液的浓度为10mm〇l/L~500mmol/L; 所述稳定剂的质量分数为0.01 %~5% ; 所述防腐剂的质量分数为〇. 05 %~1 % ; 所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tr i s盐 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或Good ' s缓冲液； 所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖或聚乙烯吡咯烷酮； 所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、大环内酯类抗生素、对羟基苯甲酸或ProClin系列。4. 根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，所述抗体混悬液 中， 所述缓冲液为HEPES缓冲液或Tris盐酸缓冲液;其浓度为20mmol/L~50mmol/L; 所述稳定剂为牛血清白蛋白或蔗糖;其质量分数为〇. 1 %~3 % ; 所述防腐剂为叠氮钠或ProClin300;其质量分数为0.05 %~0.1 %。5. 根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，所述反应液中， 所述缓冲液的浓度为10mm〇l/L~500mmol/L; 所述电解质的浓度为50mmol/L~1000mmol/L; 所述表面活性剂的质量分数为0.01 %~1 % ; 所述防腐剂的质量分数为〇. 05 %~1 % ; 所述促凝剂的质量分数为〇. 1 %~10 % ; 所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tr i s盐 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或Good ' s缓冲液； 所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁或硫酸镁； 所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、吐温-20或曲拉通X-100; 所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、大环内酯类抗生素、对羟基苯甲酸或ProClin系列； 所述促凝剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖。6. 根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，所述反应液中， 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris盐酸缓冲液;其浓度为20mmol/L~lOOmmol/L; 所述电解质为氯化钠;其浓度为100mm〇l/L~300mmol/L; 所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠和吐温-20;其质量分数为0.01 %~0.1 % ; 所述防腐剂为叠氮钠或ProClin300;其质量分数为0.05 %~0.1 % ; 所述促凝剂为聚乙二醇6000或聚乙二醇8000;其质量分数为1 %~5 %。7. 根据权利要求1所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，还包括校准品溶 液，其中包括SAA抗原、缓冲液、电解质、稳定剂和防腐剂。8. 根据权利要求7所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，所述校准品中， 所述校准品的主要成分为SAA抗原； 所述缓冲液的浓度为10mm〇l/L~500mmol/L; 所述电解质的质量分数为〇. 〇 1 %~5 % ; 所述稳定剂的质量分数为0.01 %~5% ; 所述防腐剂的质量分数为〇. 05 %~1 % ; 所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tr i s盐 酸缓冲液、甘氨酸缓冲液或Good ' s缓冲液； 所述电解质选自氯化钠、氯化钾、氯化镁或硫酸镁； 所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖或海藻糖； 所述防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、大环内酯类抗生素、对羟基苯甲酸或ProClin系列。9. 根据权利要求7所述的血清淀粉样蛋白A检测试剂盒，其特征在于，所述校准品溶液 中， 所述SAA抗原的浓度为150~250mg/L; 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液;其浓度为20mmol/L; 所述电解质为氯化钠;其质量分数为0.9% ; 所述稳定剂为牛血清白蛋白；其质量分数为5 % ; 所述防腐剂为叠氮钠;其质量分数为〇. 09 %。10. 权利要求1~9任一项所述血清淀粉样蛋白A检测试剂盒的使用方法，其特征在于， 将待测样品与反应液混合后，测定光电值记为SI;再与混悬液混合，然后测定光电值记为 S2;根据S2-S1值，以标准曲线法计算待测样品中SAA的含量;所述的待测样品为手指末梢全 血、抗凝静脉全血、血浆或血清。
【文档编号】G01N33/96GK105929173SQ201610270124
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月27日
【发明人】张宁, 陈明峰
【申请人】深圳市国赛生物技术有限公司