一种早期炎症反应的荧光定量联合检测卡的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型专利设及免疫学中免疫侧向层析技术领域，具体的说是一种运用免疫 层析技术和巧光标记技术相结合，实现快速联合检测血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A， SAA)/降巧素原（p;rocalcitonin，PCT)/C反应蛋白（C-reactive p;rotein,CRP)的检测，同时 配合巧光判读仪进行定量监测。
【背景技术】
[0002] 血清淀粉样蛋白A(se;rum amyloid A，SAA)是一种是多基因编码的多形态、由肝脏 产生的急性时相反应蛋白，为高密度脂蛋白中的一种载脂蛋白，相对分子量约12kD，主要存 在于HDL3中，在正常人血清中W恒量存在，约为2.33mg/L，在急性相反应中例如细菌或者病 毒感染，可在4她内升至正常值数百倍甚至千倍，但其半衰期只有50min左右，其敏感性高于 CRP，可为临床提供更好的参考值，SAA的血清含量是反应感染疾病早期炎症的敏感性指标。 通过监测SAA，有助于诊断非特异性炎症和评估炎症的程度、监控炎症活动和对其治疗的效 果进行追踪、观察。
[0003] 降巧素原(Procalcitionin，PCT)是一种糖蛋白，为降巧素 (；calcitionin)的前体， 由116个氨基酸组成，分子量是13KD，PCT的半衰期是25-3化，体内外稳定性很好，正常生理 状态下在甲状腺滤泡旁细内合成和分泌，正常值小于〇.5ng/ml，但是当细菌感染时机体组 织细胞包括肝、肺、肾脂肪及肌肉等均可合成和分泌PCT，导致PCT升高，而降巧素则无明显 变化。血中PCT的水平跟感染及损伤的严重程度呈正相关，在感染3-化内即可观察到PCT不 断上升达高峰，并持续2地。当PCT浓度大0.5ng/ml时非常可能存在细菌感染，临床上强烈推 荐用抗生素治疗。目前PCT成为全身性细菌感染的敏感性指标。
[0004] C反应蛋白（c-reactive p;rotein,CRP)是由肝细胞所合成。含5个多肤链亚单位， 非共价地结合为盘形多聚体。分子量为11. SKDdCRP在正常人血清中其含量为O-lOng/ml;在 组织受到损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时CRP可W在数小时内急剧上升，可增高数倍或数百 倍，2-3天达峰值，待病情改善时逐渐下降，恢复正常。CRP被广泛应用于临床疾病的早期诊 断及鉴别诊断。
[0005] 由于感染性疾病初筛的重要性，现在CRP检测已经在很多医院作为血常规一同检 测的指标之一，而同样作为敏感指标的急性相蛋白的SAA、PCT联合检测目前国内缺少可应 用于临床诊断的高敏感度的联合检测卡，国外进口同类项目检测试剂盒由于价格高需要使 用配套的全自动化仪器而难W在基层医院开展，而本检测卡通过免疫层析和巧光标记技术 相结合实现了 SAA、PCT和CRP的快速定量联合检测。具有简便、快捷、成本低和个性化检测的 特点，对于口诊、急诊实验室及各基层医院非常适合。 【实用新型内容】
[0006] 本实用新型的目的是设计开发出一种定量、联合检测的早期炎症反应标志物的检 测卡，能够同时快速联合检测血清淀粉样蛋白A(se;rum amyloid A，SAA)/降巧素原 (p;rocalcitonin，PCT)/C反应蛋白（C-reactive protein,CRP)，简化检测过程，使得检测更 简单、省时、高效、经济。
[0007] 本实用新型检测卡由卡壳和试纸条组成，其中卡壳分为卡底和卡盖，卡盖上有结 果显示窗和加样孔，加样孔下方是试纸条的上样垫，试纸条由PVC板、上样垫、巧光垫、硝酸 纤维素膜、吸样垫、保护膜组成。
[0008] 巧光垫是用分别标记的血清淀粉样蛋白A、降巧素原、C反应蛋白的单克隆抗体，冻 干到玻璃纤维素膜上制成的。硝酸纤维素膜上包被固相了浓度为1.5mg/ml的血清淀粉样 蛋白A的单克隆抗体、浓度为1.8mg/ml的降巧素原单克隆抗体、浓度为1.2mg/ml的C反应蛋 白单克隆抗体作为检测线和浓度为2mg/ml羊抗鼠多克隆抗体作为质控线。上样垫为用缓冲 液处理过的玻璃纤维素膜，保护膜为Icm宽透明胶带。每个卡壳中放1条试纸，同时检测SAA、 PCT、CRP实现S个项目的联合检测。
[0009] 为了方便使用，每份检测卡配有滴管，方便使用者吸取W及快速滴加样本。
[0010] 本实用新型的有益效果：
[0011 ] 1.检测效率高。一次点样即可同时完成3个项目的检测；
[0012] 2.检测时间短。其他检测方法相比，大大缩短检测时间，而且需要检测多个血清样 本时，无需样本处理，可连续检测多个样本，也无需与试剂盒中的其它试剂进行混匀等操 作，只需将待测样品直接点入加样孔计时IOmin即可用巧光判读仪进行定量结果读数判定；
[0013] 3.检测工具简单。无需配备其他移液工具，使用指定滴管直接滴加样本=滴即可， 无需使用特殊定量移液工具。
【附图说明】
[0014] 图1为本实用新型试纸条结构示意图 [0015]附图符号说明：
[0016] 1:上样垫;2:巧光垫;3:硝酸纤维素膜;4:吸样垫
[0017] 5:检测线Tl;6:检测线T2;7:检测线T3 8、质控(C)线;9:PVC板；
[0018] 图2为本实用新型检测卡示意图
[0019] 图3本实用新型检测用滴管示意图。
【具体实施方式】
[0020] -、联合检测卡的制备
[0021] 1.巧光垫的制备
[0022] 分别取150nm的巧光微球IOOul用PH值8的憐酸盐缓冲液洗后离屯、15min然后复溶 至500ml，在复溶液里分别加链接生物素，然后分别按照表1加入相应的单克隆抗体，混匀， 振荡化;离屯、10 min，弃上清用憐酸盐缓冲液复溶;加入lOOulBSA进行封闭，振荡化，加入 薦糖使其终浓度为10%，制成标记浓缩液，将=种浓缩液稀释到30%，置于真空冷冻干燥机中 3小时，冻干到玻璃纤维素膜上。
[0023] 表1 SAA、PCTXRP单巧陈杭体标巧量
[0024] 2.硝酸纤维素膜包被
[0025] 用1XPBS(PH7.4)将羊抗鼠多克隆抗体稀释至lj2mg/mL,将SAA包被单抗、PCT包被单 抗、CRP包被单抗分别稀释到1.5mg/mL、1.8mg/ml、1.2mg/ml，用划膜机将上述抗体包被于硝 酸纤维素膜上，分别作为C线(质控线)和T线(检测线），包被参数为0.12化/mm。将硝酸纤维 素膜置于37°C干燥3小时。
[0026] 3.上样垫制备
[0027] 配制上样垫处理液:0.5%BSA的0.05mol/L棚酸盐缓冲液(P册.0)，用上样垫处理 液铺玻璃纤维素膜，制成上样垫。37°C干燥3小时。
[002引 4、试纸条的组装
[0029] 将上样垫、巧光垫、硝酸纤维素膜和吸样垫按图1所示粘贴在PVC板上，上样垫压 巧光垫1mm，巧光垫压硝酸纤维素膜1mm，吸样垫压硝酸纤维素膜1mm，保护膜压在上样垫上 端和硝酸纤维素膜下端，覆盖巧光垫。组装完成后，用切条机切成4mm宽的条。
[0030] 5.将试纸条装入图2所示的卡壳。
[0031] 二、检测结果判读
[0032] 检测卡平放用图3所示滴管吸取样本3滴(约SOiiL),然后将样品加到检测卡的加样 孔中，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留。室 溫静置IOmin后，用巧光判读仪对检测结果将进行定量读数判定，根据读数结果辅助医生正 确判定病情变化。
【主权项】
1. 一种针对早期炎症反应的荧光定量联合检测卡，其特征在于包括试纸条、卡壳和滴 管，试纸条由PVC板、上样垫、焚光垫、硝酸纤维素膜、吸样垫、保护膜组成，试纸条放入一个 卡壳中，卡壳上有一个加样孔进行加样，可同时检测SAA、PCT、CRP三种炎症反应的标志物。2. 根据权利要求1所述的一种针对早期炎症反应的荧光定量联合检测卡，其特征在于 荧光垫是荧光微球标记固相了血清淀粉样蛋白A、降钙素原、C反应蛋白三种单克隆抗体的 玻璃纤维素膜。3. 根据权利要求1所述的一种针对早期炎症反应的荧光定量联合检测卡，其特征在于 制作荧光垫所用的荧光微球颗粒大小为150nm。4. 根据权利要求1所述的一种针对早期炎症反应的荧光定量联合检测卡，其特征在于 硝酸纤维素膜上包被固相了浓度为1.5mg/ml的血清淀粉样蛋白A的单克隆抗体、浓度为 1.8mg/ml的降|丐素原单克隆抗体、浓度为1.2mg/ml的C反应蛋白单克隆抗体和浓度为2mg/ ml羊抗鼠多克隆抗体。
【专利摘要】本实用新型提供一种早期炎症反应的荧光定量联合检测卡，检测卡由试纸条和卡壳组成，试纸条由PVC板、上样垫、荧光垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、保护膜组成。用150nm荧光微球分别标记血清淀粉样蛋白A、降钙素原、C反应蛋白的单克隆抗体1，冻干到玻璃纤维素膜上制成荧光垫，硝酸纤维素膜上分别包被血清淀粉样蛋白A、降钙素原、C反应蛋白的单克隆抗体2，作为检测线（T1、T2、T3线），包被羊抗鼠作为质控线（C线）。将试纸条放入一个卡壳中，卡壳上有一个加样孔进行加样，同时检测三种早期炎症反应的标志物，然后进行检测用荧光判读仪定量判读。本检测卡具有高效、省时、操作简单、灵敏度高、特异性好等特点。
【IPC分类】G01N33/58, G01N33/558, G01N33/68
【公开号】CN205374467
【申请号】CN201521063805
【发明人】司英杰, 李梅, 刘琳, 殷娟娟, 向荣, 王昊, 张贤刚, 张贤强, 朱正宇, 李亚峰
【申请人】德康润生物科技（天津）有限公司
【公开日】2016年7月6日
【申请日】2015年12月21日