尿苷二磷酸糖基转移酶基因Ugt366的克隆及应用的制作方法

本发明属生物工程技术领域，涉及一种尿苷二磷酸糖基转移酶基因dna序列，同时采用实时荧光定量pcr(实时pcr，real-time-pcr，)的方法来研究该基因的表达，并使用大肠杆菌bl21菌株表达蛋白ugt366，及研究对气味物质的降解功能。

背景技术：

暗黑鳃金龟在我国大部分省(区)都有分布。成虫食性较杂，主要取食榆树、杨树、柳树、花生、大豆、玉米等植物叶片。幼虫称为蛴螬，是农区地下害虫的重要优势种之一，其在土中栖息，隐蔽为害，生活世代长，发生规律复杂，是国内外公认的难于防治的害虫。长期以来，我国对地下害虫蛴螬的控制主要依赖化学农药，因而造成农产品和环境污染的问题日趋严重。昆虫的嗅觉系统与其取食等各种行为息息相关，鉴于此，从研究嗅觉相关基因入手，对暗黑鳃金龟的气味降解酶基因进行挖掘和机制的探讨，可以为开拓防治地下害虫的新思路提供理论基础。

气味降解酶是一种选择性进化出来的酶类，主要功能是迅速降解气味分子，当气味分子完成对气味受体的刺激后，气味分子在降解酶的作用下被快速分解，进而嗅觉受体神经元反应终止，以避免对受体的持续刺激。在昆虫触角中发现几种表达量非常高的气味降解酶类，分别是羧酸酯酶(cces)、细胞色素p450氧化还原酶(p450s)、谷胱甘肽-s-转移酶(gsts)、醛氧化酶(aox)和尿苷二磷酸糖基转移酶(ugts)等。

尿苷二磷酸糖基转移酶(ugts)分布广泛，其催化的糖基化反应是生物体内非常重要的代谢途径。在昆虫中，它主要催化糖基基团从活化的udp-葡萄糖供体中转移到受体疏水小分子-糖苷配基上，从而使疏水分子形成更亲水的化合物，以利于高效降解排出，ugts是潜在的气味降解酶之一。

随着功能基因组的发展，生物信息学技术应用的日臻成熟，有关昆虫如何识别气味分子等方面均有了深入的研究，对于昆虫嗅觉系统的分子机制有了更深刻的认识。尽管如此，但仍然存在许多问题，例如触角中存在哪些ugts，ugts在气味降解中发挥作用的内在分子机制等。目前鲜有关于鞘翅目昆虫嗅觉感器中气味降解酶和气味降解机制的研究报道，特别是关于鳃金龟类害虫中尿苷二磷酸糖基转移酶在气味降解中的作用机理研究。

技术实现要素：

本发明通过生物信息学分析，在暗黑鳃金龟触角转录组数据中鉴定出一个尿苷二磷酸糖基转移酶基因ugt366，并结合构建系统发育进化树，发现其与同为鞘翅目的赤拟谷盗ugts亲缘性较近，且在不同物种间具有广泛的表达模式。利用实时荧光定量pcr技术，检测基因ugt366在触角、头、胸、腹、足、翅各组织中的表达模式，该基因在触角中高表达。本发明对基因ugt366进行了克隆，并利用大肠杆菌原核表达系统进行了目的蛋白的表达，经sds-page检测和质谱分析确认了表达的蛋白ugt366为尿苷二磷酸糖基转移酶。本发明采用液质联用系统进行蛋白ugt366体外活性实验，鉴定表达的蛋白是否具有酶活性以及能否降解气味分子。与传统hplc方法相比更直观精确，可以通过检测反应过程中底物的分子量变化，鉴定目的蛋白的活性及降解机制。本发明中，蛋白ugt366对气味分子邻苯二甲酸二丁酯有降解活性，起到了气味降解酶的作用。

本发明提供了暗黑鳃金龟中一种含尿苷二磷酸糖基转移酶功能域的与气味分子降解有关的蛋白及其编码基因序列，通过生物信息学对该基因进一步解析并利用体外的糖基化反应进行功能验证：

本发明提供的尿苷二磷酸糖基转移酶基因，名称为ugt366，其核苷酸序列如seqidno：1所示。通过暗黑鳃金龟触角转录组库中得到基因ugt366。该基因共由1711个碱基组成，完整的开放阅读框含有1569bp，同时还含有5’非翻译区和3’非翻译区序列，开放阅读框的起始密码子为atg，终止密码子为tag。

本发明所提供的尿苷二磷酸糖基转移酶蛋白ugt366，来源于暗黑鳃金龟，具有降解气味分子的能力，其氨基酸序列如seqidno:2所示。

所述尿苷二磷酸糖基转移酶蛋白ugt366的编码基因ugt366，其编码基因ugt366的编码序列为编码序列表中seqidno:1的核苷酸分子。

一种重组表达载体，含有尿苷二磷酸糖基转移酶蛋白ugt366的编码基因ugt366。

一种重组菌，含有尿苷二磷酸糖基转移酶蛋白ugt366的编码基因ugt366。

序列表中的序列2根据dnaman分析，蛋白由525个氨基酸组成，等电点8.40，蛋白总量59.71kda。蛋白亲水性平均系数(gravy)为0.082，具有弱疏水性，根据netnglyc1.0分析含有4个n-糖基化位bi点，signalp4.1和tmhmm2.0网站预测蛋白具有信号肽及跨膜区。

本发明涉及的原核表达载体pet-28a(+)与基因ugt366重组为pet28a-ugt366，该原核表达载体除了含有基因ugt366的编码dna序列外，还携带有蛋白纯化的6xhistag等外源基因蛋白高效表达所需的各种调控元件，且该重组原核表达载体转化的宿主感受态细胞为大肠杆菌bl21，该重组菌含有尿苷二磷酸糖基转移酶的编码基因ugt366，可以表达蛋白ugt366。

本发明通过实时荧光定量pcr方法检测了该基因在暗黑鳃金龟头、胸、腹、足、翅、触角六个组织中的相对表达量且在触角中高表达，进一步推测该基因与嗅觉机制有关，参与气味物质的降解。

本发明在通过表达的蛋白ugt366与气味物质体外的糖基化反应研究后，基因ugt366表达的蛋白ugt366可以与气味分子发生糖基化反应，具有气味降解酶的能力。

附图说明

图1暗黑鳃金龟触角总rna提取图片

图2为基因ugt366在ncbi中功能域比对分析结果

图3为基因ugt366与其它物种的系统进化分析

图4为基因ugt366在暗黑鳃金龟头、胸、腹、足、翅、触角中的相对表达量

图5为基因ugt366克隆pcr扩增凝胶电泳图

图6为pet28a-ugt366重组质粒pcr扩增凝胶电泳图

图7为蛋白ugt366在bl21中的蛋白表达检测

图8为蛋白ugt366与气味物质邻苯二甲酸二丁酯糖基化反应前后的质谱图

具体实施方式

实施例一：基因ugt366的生物信息学分析

通过对暗黑鳃金龟触角进行转录组测序，获得了尿苷二磷酸糖基转移酶基因ugt366的核苷酸序列及尿苷二磷酸糖基转移酶蛋白ugt366的氨基酸序列，通过ncbi分析，尿苷二磷酸糖基转移酶基因ugt366具有完整的orf及结构域(udpgt)，并且通过预测显示蛋白ugt366为糖基转移酶(gt)家族中的gt-b超家族类型(图2)。expasy-computepi/mw分析蛋白质的分子量为59.71，等电点为8.40。

由mega6.0构建的进化树(图3)，包括暗黑鳃金龟(holotrichiaparallela)的20个ugts、赤拟谷盗(triboliumcastaneum)的42个ugts、埃及伊蚊(aedesaegypti)的30个ugts以及意大利蜜蜂(apismellifera)的10个ugts。系统发育进化树显示，基因ugt366与赤拟谷盗tcas008192323节点处自展值为97％，与埃及伊蚊aaeg001650803和意大利蜜蜂amel394772自展值为100％，推测这四种ugts可能为同一类或同一家族基因，且在不同物种间广泛存在。

实施例二：基因ugt366在暗黑鳃金龟各组织中的表达

实时荧光定量pcr使用的试剂为takara公司的荧光定量试剂premixextaq^tmii，仪器为abi-7500荧光定量pcr仪，选取gapdh为内参基因，检测基因ugt366在雌雄暗黑鳃金龟各组织中的转录水平，反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，55℃退火延伸10秒，进行40个循环；95℃变性15秒，60℃退火延伸1分钟，95℃变性15秒；60℃延伸15秒。根据实时荧光定量pcr说明书，利用primerpremier5.0软件设计合适引物，并由华大基因公司合成，ugt366-f：ggaaagacatcccgcactcg，ugt366-r：ataaacccgttctcgccgc。计算靶标基因的相对表达量采用2^-δδct法，显著性分析采用graphpadinstat3软件，结果显示该基因在触角中高表达(图4)。

实施例三：基因ugt366的克隆

选取暗黑鳃金龟雄虫为实验样本进行触角分离，提取触角rna(图1)，并反转录成cdna，以暗黑鳃金龟雄虫触角cdna为模板，利用设计合成的引物进行pcr反应，得到目的基因完整的orf(图5)。

1.rna的提取：

(1)取组织材料于液氮中备用，将1mlrna提取剂rnaisoplus加入到匀浆器后，将材料置于匀浆器中充分研磨，转移至ep管中，全程在冰上操作；

(2)在含有组织材料的ep管中加入充分冷却的氯仿200μl，上下颠倒充分混匀后，放置冰上5min，然后4℃，12000g条件离心15min；

(3)离心结束后，吸取上层无色透明水相转移至新的无rna酶ep管中，加入等体积的充分冷却的异丙醇，轻轻混匀，然后置于-20℃冰箱中10min，静置后4℃，12000g条件离心10min，在ep管的底部有沉淀；

(4)小心倾倒上清，然后将1ml无水乙醇充分预冷后沿管壁缓慢加入，用振荡仪剧烈振荡几秒，然后4℃，12000g条件离心5min；

(5)尽量倾倒全部乙醇，室温条件下挥发2-5min，加入40μl预冷的depc水充分溶解rna，得到最终的rna溶液，取2μl用来测浓度，2μl用来琼脂糖凝胶电泳检测rna质量。

2.基因的克隆：

pcr反应体系(25μl)：buffer2.5μl、上下游引物各1μl、tag酶0.3μl、dntp2μl、模板1μl、ddh2o17.2μl。pcr反应的条件：在94℃预变性5分钟；94℃变性30秒；迅速冷却至57℃退火30秒；72℃延伸2分钟，40个循环；72℃延伸10分钟；4℃冷却保存。pcr反应结束后，在1700bp左右处得到目的条带(图5)。产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，条件为120v，30min。切下目的条带，利用eastep^tm凝胶回收试剂盒进行回收，具体步骤如下：

(1)切下目的条带放入灭菌的1.5mlep管中，去皮称量胶块重量，按照10mg:10μl的比例加入膜结合液，在59℃的水浴锅中孵育10min使胶块完全溶解；

(2)取出ep管用移液枪轻轻混匀，冷却至室温；

(3)在收集管中插入微量纯化柱，然后将冷却至室温的样品倒入微量纯化柱中，室温条件下孵育1min；

(4)16000g，室温条件离心1min，离心结束后倒掉滤液；

(5)将700μl膜清洗液加入微量纯化柱中，16000g，室温条件离心1min，倒掉滤液；

(6)将500μl膜清洗液加入微量纯化柱中，16000g，室温条件离心1min，倒掉滤液；

(7)16000g，室温条件离心1min，离心后37℃条件干燥10min；

(8)将微量纯化柱插到经灭菌处理的1.5mlep管中，加入40μl的无核酸酶水，室温条件静置2min，16000g，室温条件离心1min；

(9)将得到的dna溶液存于-20℃冰箱中备用。

实施例四：pet28a-ugt366重组质粒的构建及蛋白在重组菌中的表达

利用t4dnaligase将回收的基因ugt366分别与线性化的pet-28a空载相连，16℃过夜，目的基因回收片段6μl，线性化的pet-28a2μl，10×buffer1μl，t4dnaligase1μl。将连接产物转化到dh5α感受态细胞中，然后涂布在含有卡那霉素的固体培养基上，37℃过夜培养，对于长出的单克隆进行菌落pcr验证，然后送公司测序，对测序结果正确的单克隆进行质粒提取得到重组质粒(图6)。

分别取2μl重组质粒pet28a-ugt366转化到bl21感受态细胞中，然后涂布在含有硫酸卡那霉素的lb固体培养基上，37℃过夜培养后进行蛋白的诱导表达，经sds-page检测表达结果，基因ugt366在iptg诱导表达后，与对照组未加iptg诱导的pet28a-ugt366和加iptg诱导的空载体pet28a相比，在60kda左右处有一条明显增粗的条带(图7)。

(1)在过夜培养的固体培养基上长出一些单菌落，挑选一个长势良好的单菌落，用灭菌处理过的10μl枪头接种到10ml含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，180r/min条件震荡培养12h；

(2)将培养好的菌液按照菌种与培养基1:100的比例接到300ml含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，180r/min条件震荡培养，直到od600＝0.55-0.6；

(3)加入1mol/l的iptg储存液，使其终浓度为1mmol/l，并设不加iptg的菌液为对照组；

(4)37℃，180r/min条件震荡培养4h；

(5)分别取1ml对照组和处理组的菌液，4℃，12000rpm的条件离心5min，倒掉上清液，重复离心1次。

(6)将沉淀用100μlddh2o溶解，加100μl2×loadingbuffer混匀后，95℃金属浴10min，离心后取上清进行sds-page检测。

实施例五：蛋白ugt366对气味分子降解能力的测定

利用酶和底物相互作用的关系进行体外糖基化反应实验，检测表达的蛋白是否有活性以及能否降解气味分子，先将缓冲液、蛋白及udp-葡萄糖依次加到ep管中，温浴后加入底物开始反应，反应过程中用液质联用系统实时监测，所用仪器为agilent1290-microtof-qiimassspectrometer(超高效液相色谱/四极杆飞行时间串联质谱仪)。

(1)色谱条件：色谱柱：waterssymmetryc18(2.1x100mm，3.5μm)；流动相：0.1％甲酸，乙腈；梯度洗脱程序：0-5min，5-15％乙腈；5-25min，15-40％乙腈；25-30min，40-90％乙腈；30-32min，90-95％乙腈；流速：0.3ml/min；柱温：35℃；进样量：5μl。

(2)质谱条件：ajsesi离子源，正离子检测模式；干燥气流速：16l/min；干燥气温度：200℃；雾化气流速：50psi；鞘气流速：12l/min；鞘气温度：350℃；毛细管电压：3.5kv；喷嘴电压：0.5kv。

在蛋白ugt366与气味物质邻苯二甲酸二丁酯发生反应后，质谱峰上显示物质的分子量为638.4，这说明在蛋白ugt366的作用下，邻苯二甲酸二丁酯成功被转移上两个葡萄糖基，分子量由279.2变为638.4(图8)，结果表明蛋白ugt366具有糖基转移酶的活性，可以催化气味物质邻苯二甲酸二丁酯与udp-葡萄糖发生糖基化反应，对底物有降解作用，据此推测，注意可能在暗黑鳃金龟触角中作为气味降解酶发挥作用。

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　序列表

seqidno.1的序列

（i）序列特征：（a）长度：1711bp；（b）类型：核苷酸；（c）链性：单链；（d）1-57:5’-utr（e）1629-1711：3’-utr。

　　　（ii）分子类型：核苷酸

　　　（iii）序列描述：seqidno.1

1gtactgataagtatccactgatttgatacaaatttgaaaaaaaaaaattaaagcgacatg

61acatcttcaggacatgtcatcatcctggcagttttggccgccttgaacgtatgcaactgc

121gccaacgtcctgatgataacgatgggcggcaccaagtctcataagattcccttttgggaa

181ttggcgaggggactcatccctcgtggacataacataacgttcatcaacgcctttcctcaa

241gattttatcacggacggccttgaagaaatcacgcctgccggcttggtattttacgtcaag

301aactttacgaattgggacctgttgggtgcaaggatgcgtggagaggaacccgtacatcca

361ctagatatgatgaggtacccgtacgaggcatgtgatattctatactcggacggcgaaatg

421aaggacttcctccattctggtcagacttttgacttgatcatcatggatggagcttttcca

481gagtgcgccttaggtctagtctattacttcaagattccatttatgtacattaataccgtg

541ggattctacactggttcgttgtcggtggcgggcaatccgacgccgtattccataacaccg

601ttcctagcgagacccttcacggacaacatgaacttgttggaaagaaccgtgaacagtttc

661tggcacatctgcgctaacttgatgcactccgtcatggtaaaagtgttcttgcacaacgtg

721ctgaagaagcatttcgggaaagacatcccgcactcgtacgagctgtccaaaaatgtcagt

781tttattcttcaaaatggttatacaaccgtgacttatgccagaccatacttacctaatgtt

841gcggaaatagcatgtatacactgcaaggatccaaaacctctgccgccgaatttcgaggaa

901tttatcaggggaagcggcgagaacgggtttatatacttcagcatgggctcgtctgtgaaa

961gctgccaatatgcccgaatatttgcgtcgtatgctgctgtgcgtcttcaaacaattacca

1021caaagggttttgtggaagtgggaagctgatgatatgccagatcttccgccaaatgtcaaa

1081ctcagtcgatggcttccccagcaagatttactaggtcatcctaaaatacgtgccttcgtg

1141acccacggcggtttgctaagcatgttcgaaacagtataccatggagttccaatagtcacc

1201ataccagtcttctgtgaccatgattccaatgctgccaaggcacaattagacggctacgct

1261atccaattagacttggcaacgttaacagctgacagtttgcttcgagccatcagaggcgtt

1321atacacaatccgaaatacaagagcgacgttaaaaggatgcaacgtctgttgaaagatcaa

1381aaagaaactccactagagagggccatttattggaccgaatacgttttaaggcacaaaggt

1441gccgaacatttgctctctccatcgagaaacctcaacgttatagaatactatttaattgat

1501gtgatgtttgtgttcctcattttagcgatagcgttgcaatatattttaagactgttaatc

1561aaaattatatataagtatttgagtagcagtgtaggtttcagcatagtcaggaaaaacatt

1621aaagtggagtagatatctgtacatagtatataaataggtttgttgttgctaatgttaaag

1681tgtgttgtgttttcagattgtttcttttttt

seqidno.2的序列

　　　（i）序列特征：（a）长度：524个氨基酸；(b)类型：氨基酸；（c）链性：单链。

　　　（ii）分子类型：多肽

　　　（iii）序列描述：seqidno.2

1mtssghviilavlaalnvcncanvlmitmggtkshkipfwelargliprghnitfinafp

61qdfitdgleeitpaglvfyvknftnwdllgarmrgeepvhpldmmrypyeacdilysdge

121mkdflhsgqtfdliimdgafpecalglvyyfkipfmyintvgfytgslsvagnptpysit

181pflarpftdnmnllertvnsfwhicanlmhsvmvkvflhnvlkkhfgkdiphsyelsknv

241sfilqngyttvtyarpylpnvaeiacihckdpkplppnfeefirgsgengfiyfsmgssv

301kaanmpeylrrmllcvfkqlpqrvlwkweaddmpdlppnvklsrwlpqqdllghpkiraf

361vthggllsmfetvyhgvpivtipvfcdhdsnaakaqldgyaiqldlatltadsllrairg

421vihnpkyksdvkrmqrllkdqketpleraiywteyvlrhkgaehllspsrnlnvieyyli

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