一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程和遗传工程领域，公开了一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体，其是在去除了自身信号肽的亮白曲霉和米曲霉的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列的基础上，通过双位点的定点饱和突变所获得的，在低聚糖生成量保持不变的情况下，该突变体的转糖苷反应速率比野生型提高100％以上。同时，本发明还公开了编码上述组合突变体的DNA分子、含有上述DNA分子的重组表达载体以及表达上述DNA分子的宿主细胞。此外，本发明还提供了采用上述重组表达载体制备具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶的方法以及上述组合突变体、DNA分子、重组表达载体和宿主细胞在制备β-半乳糖苷酶中的应用。
【专利说明】一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体及其 制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体涉及一种具有高转糖苷活性的β_半 乳糖苷酶组合突变体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 低聚半乳糖（GOS)是一类在人体胃肠道内不能被消化吸收而直接进入大肠被各 种双歧杆菌良好利用的具有特殊生物学功能的低聚糖。它能够改善人体内微生态环境，有 利于双歧杆菌和其它有益菌的增殖，提高人体免疫功能。同时，GOS经代谢产生有机酸使 肠内PH值降低，抑制肠内沙门氏菌和腐败菌的生长，减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产 生，调节胃肠功能，减轻了肝脏分解毒素的负担。由于低聚半乳糖有着比其他功能性低聚糖 更优良的性质，从而使低聚半乳糖作为添加剂大规模应用更方便易行，能够适应更多的食 品种类和更广的消费群体，有巨大的应用价值和市场潜力。
[0003] GOS制备方法通常有五种：从天然原料中提取、天然多糖的酸水解、化学法合成、 发酵法及酶法合成。由于GOS在自然界中含量低，无色不带电荷故难以提取分离；天然多糖 转化产品得率低，产物成分复杂，难以纯化；化学法毒性大易残留，对环境污染重；发酵法 生产GOS的研究很少，仍处于实验室规模，无法进行大量生产。目前低聚半乳糖的工业化生 产是通过β -半乳糖苷酶完成的。β-半乳糖苷酶（β-D-galactoside galatohydrolase， EC 3. 2. 1. 23)又称乳糖酶（Lactase)，具有水解和转糖苷的双重作用。早先对于β -半乳糖 苷酶的研究主要集中在利用其水解功能生产低乳糖乳制品，来解除乳糖不耐受患者因食用 乳制品而引起的腹泻、腹胀等多种不良反应。随着低聚半乳糖特殊的保健功能的确定，利用 β-半乳糖苷酶的转糖苷作用生产低聚半乳糖成为研究热点。主要集中在以下三个方面：
[0004] 1、筛选高转糖苷活性的β -半乳糖苷酶产生菌
[0005] 酵母、芽孢杆菌、曲霉、青霉、双歧杆菌等多种微生物中都有具转糖苷酶活性的 β-半乳糖苷酶。研究表明，不同来源的β-半乳糖苷酶因其酶学性质各异，合成低聚半乳 糖时的反应条件大不相同。β-半乳糖苷酶根据最适PH可分为酸性和中性两种。通常霉菌 来源的β-半乳糖苷酶为酸性酶，其作用最适pH在pH2. 5?5. 5,最适反应温度较高（50? 60°C);酵母和细菌所产的β-半乳糖苷酶为中性酶，其最适pH介于pH 6?7. 5,最适反应 温度较低（30?40°C)。不同来源的β-半乳糖苷酶作用的底物类型也不尽相同，由此生 成的低聚半乳糖中寡糖的种类和比例也千差万别，这就使低聚半乳糖家族的新成员层出不 穷。尽管如此，筛选到的天然β-半乳糖苷酶的转糖苷活性普遍较低，低聚半乳糖的最高产 率通常只有5?30%，无法满足工业化生产的要求。
[0006] 2、优化反应条件、改进生产工艺
[0007] 有学者试图通过优化低聚半乳糖的生产条件和工艺来弥补其转糖苷活性低的缺 陷，提高低聚半乳糖的得率，已取得了一定的效果。主要的方法有：增加起始乳糖的浓度、 用有机溶剂控制水活度以及采用固定化技术。由于β_半乳糖苷酶的水解和转糖苷反应是 可逆的。当底物浓度较低时，水解产物半乳糖浓度较低，其对水解反应的抑制作用较小，此 时酶表现出水解活力较高，而转糖苷活力较低，因此产物中单糖含量较高。当乳糖浓度较高 时，水解产物半乳糖浓度较高，当其达到一定值就对水解酶活产生抑制作用。半乳糖是转糖 苷的底物，浓度高有利于半乳糖寡糖的合成，因此底物浓度较高时，产物中寡糖含量较高。 使用有机溶剂有利于低聚糖的合成是因为有机溶剂能降低反应体系中水的活度以影响酶 的活性位点和反应机制，引导水解酶催化逆向的转半乳糖苷反应，使反应平衡由水解偏移 向低聚糖合成。利用固定化技术则可大大增加游离酶的PH和热稳定性并可反复利用，降低 生产成本。Mozaffar将β-半乳糖苷酶吸附于酚醛树脂并用戊二醛交联后，低聚糖的产率 提高了 20% ;但也有研究发现，固定化酶作用于较高浓度的乳糖溶液时，产生的低聚糖比用 游离酶还少。由此可见单纯依靠优化条件始终无法从根本上解决问题。
[0008] 3、利用基因工程手段提高β -半乳糖苷酶的表达和性质改良
[0009] 自然界中野生的半乳糖苷酶GOS产量一般都维持在20?45%之间，产量较 低，难以满足生产需求，因此通过分子改造筛选转糖苷性质优良的突变酶成为研究热点。 Hansen 0· (2001)等发现来源于双歧杆菌中的β-半乳糖苷酶BIF3,缺失掉C末端580个 氨基酸后将酶蛋白变为一个高效的转糖苷酶，能够利用几乎90%乳糖生成G0S，而水解成 分占10 %，而且在10 %至40 %的乳糖浓度下始终能够保持9:1比率的转糖苷活力和水解活 力；Placier G.于2009年对来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌KVE39的β-半乳糖苷酶进行定 向进化，将转糖苷活力提高则水解活力降低作为筛选依据，成功筛选到三株突变体R109W， R109V，R109K，在18% (w/v)乳糖中低聚糖产量分别为23%，11. 5%，21%，而野生酶只有 2% Y. (2013)等对硫化叶菌来源的β-半乳糖苷酶进行分子改造，研究其最适GOS生 成条件，在各自最适条件下突变体F441Y GOS产量为61. 7 %，F359Q为58. 3 %，而野生酶为 50. 9%。
[0010] 继而，有学者提出一种迭代组合突变的方法（Ji J，Fan Κ. et al，2012)，即将每一 轮筛选结果里最高活力的突变体作为模板进行下一轮组合突变，直至生成的突变体活力均 无法超越出发模板时，迭代组合结束。通过该方法从四轮组合突变共24株突变体中筛选到 11株活力提高的突变体，最终活力最高突变体（C155Y Y184H V275I C281Y)比原始野生酶 提高1874%，但该组合突变的方法尚未有报道应用于β-半乳糖苷酶的分子改造中。
[0011] 到目前为止，无论是天然酶的筛选分离、工艺优化还是通过基因工程手段提高 β -半乳糖苷酶的表达和性质改良，都没有改变β -半乳糖苷酶转糖苷活性低和产量低的 现状，从而也就造成低聚半乳糖合成产率低，反应时间长，生产成本太高，这严重制约了低 聚半乳糖的廉价生产和推广应用。
[0012] 因此，创制高转糖苷活性的新型β -半乳糖苷酶，并使其廉价生产是目前研究和 生产中亟需解决的主要问题之一。
【发明内容】
[0013] 针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种具有高转糖苷活性的 β -半乳糖苷酶组合突变体，其是在亮白曲霉或米曲霉β -半乳糖苷酶的基础上，通过双位 点的定点饱和突变而获得的，优选是在序列2或序列4所示的氨基酸序列的基础上，通过双 位点的定点饱和突变所获得的，所述突变体在低聚糖生成量保持不变的情况下，转糖苷反 应速率比野生型提高100%以上，优选提高150%以上，更加优选提高200%以上。
[0014] 在本发明优选的实施方案中，突变位点分别为第219位和第785位的氨基酸。
[0015] 在本发明进一步优选的实施方案中，双位点的定点饱和突变分别为用甘氨酸残基 取代第219位的丝氨酸残基（S219G)和用缬氨酸残基取代第785位的谷氨酸残基（E785V)、 用丙氨酸残基取代第219位的丝氨酸残基（S219A)和用缬氨酸残基取代第785位的谷氨酸 残基（E785V)、用天冬酰胺残基取代第219位的丝氨酸残基（S219N)和用缬氨酸残基取代第 785位的谷氨酸残基（E785V)、或用缬氨酸残基取代第219位的丝氨酸残基（S219V)和用缬 氨酸残基取代第785位的谷氨酸残基（E785V)。
[0016] 本发明的另一方面提供了编码上述组合突变体的DNA分子。
[0017] 本发明的再一方面提供了含有上述DNA分子的重组表达载体，优选为重组酵母表 达载体。
[0018] 本发明的再一方面提供了表达上述DNA分子的宿主细胞，优选糖酵母属、克鲁维 氏酵母属、裂殖糖酵母属和甲基营养型酵母菌株，甲基营养型酵母菌株更加优选为毕赤氏 酵母属菌株。
[0019] 本发明的再一方面提供了一种制备具有高转糖苷活性的β -半乳糖苷酶的方法， 包括以下步骤：
[0020] 1、用上述的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
[0021] 2、培养上述重组菌株，诱导重组β -半乳糖苷酶的表达；
[0022] 3、回收并纯化所表达的高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶。
[0023] 本发明的最后一方面提供了本发明所述的组合突变体、DNA分子、重组表达载体以 及宿主细胞在制备半乳糖苷酶中的应用。
[0024] 本发明采用双位点的定点饱和突变技术对去除自身信号肽的亮白曲霉的β -半 乳糖苷酶基因 Iacb'和去除自身信号肽的米曲霉的β-半乳糖苷酶基因 Iaco'进行了定 点饱和突变，获得了具有高转糖苷活性的β -半乳糖苷酶组合突变体，从而使其转糖苷反 应速率比野生型提高了 100%以上，甚至提高了 200%以上，使制备高效率且高转糖苷活性 的β-半乳糖苷酶成为现实，为β-半乳糖苷酶的应用奠定了良好的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1 :亮白曲霉和米曲霉的β -半乳糖苷酶与底物的分子对接过程。
[0026] 图2:亮白曲霉和米曲霉的β_半乳糖苷酶中突变位点与乳糖分子空间位置关 系。
[0027] 图3 :含突变体β -半乳糖苷酶基因的重组表达载体的构建过程。
[0028] 图4 :S219位点典型突变体低聚半乳糖生成量。
[0029] 图5 :F245位点突变体库低聚半乳糖生成量趋势。
[0030] 图6 :F245位点典型突变体低聚半乳糖生成量。
[0031] 图7 :E785位点突变体库低聚半乳糖生成量趋势。
[0032] 图8 :S219/E785双位点突变体低聚半乳糖生成量。
【具体实施方式】
[0033] 下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本 发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发 明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
[0034] 实施例1 : β -半乳糖苷酶三级结构及突变位点的预测
[0035] 去除自身信号肽的β -半乳糖苷酶基因 Iacb '，为本实验室从亮白曲霉 (Aspergillus candidus)中克隆得到的，去除自身信号肽序列的基因由2958个核苷酸组 成，具体序列如序列1所示，该基因编码的蛋白质由986个氨基酸组成，具体序列如序列2 所示。
[0036] 去除自身信号肽的β -半乳糖苷酶基因 Iaco、为本实验室从米曲霉 (Aspergillus oryze)中克隆得到的，其也由2958个核苷酸组成，具体序列如序列3所 不，该基因编码的蛋白质也由986个氣基酸组成，具体序列如序列4所不。其氣基酸序 列与Iacb y基因编码的蛋白质仅有三个氨基酸的差异：分别在第231位：lacb y (Gly)， Iaco ' (Ser);第 401 位：lacb ' (Met)，Iaco ' (lie);第 970 位：lacb ' (Asp)， Iaco (Asn)〇
[0037] 以壳白曲霉和米曲霉的β _半乳糖昔酶为研究材料。以获得晶体结构的青霉属 β-半乳糖苷酶（PDB登录号：1TG7)，米曲霉β-半乳糖苷酶（PDB登录号：4IUG)及里氏 木霉β_半乳糖苷酶（PDB登录号：30G2)的蛋白质晶体结构为同源模型，对β-半乳糖 苷酶的3D结构及与底物结合的区域进行预测。预测的结构与文献报道的预测结果高度 相似（参见 The crystal structure of acidic β-galactosidase from Aspergillus oryzae, Mirko M. Maksimainen, International Journal of Biological Macromolecules, 2013, 109-115)。酶蛋白由5个结构域组成：结构域1(1?394氨基酸）靠近N端，是该酶的 活性中心所在，活性中心是TIM桶型结构；结构域2(395?573氨基酸）由16个反向平行的 β-折叠片和1个α-螺旋组成，包含了 一个类似免疫球蛋白的亚结构域；结构域3 (574? 661氨基酸）由8个反向平行的β -折叠片组成一个"希腊钥匙"的β -夹层和1个α -螺 旋组成；结构域4 (662?857氨基酸）和结构域5 (858?1005氨基酸）主要由"春卷"型 的拓扑结构组成。对活性中心重点分析发现，位于TM桶活性中心第4和第7条β -折叠 片上的Glul60、Glu258可能是参与催化反应必不可少的氨基酸，而AsnHO和Tyr96可能用 来固定乳糖分子。
[0038] 根据得到的β -半乳糖苷酶的三维结构，通过Discovery Studio软件进行酶与底 物的分子对接模拟（参见附图1)，根据对接结果解析，可获知与底物存在相互作用的氨基 酸（参见附图2)。使用计算生物学软件逐个评估这些氨基酸的进化熵，最终筛选确定了六 个进化熵变化较大的氨基酸位点S219, D239, S240, Y241，F245和E785 (参见表1)用于定 点饱和突变。
[0039] 表1 β -半乳糖苷酶典型氨基酸的进化熵
[0040]
【权利要求】
1. 一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶组合突变体，其是在亮白曲霉或米曲霉 β -半乳糖苷酶的基础上，通过双位点的定点饱和突变而获得的，优选是在序列2或序列 4所示的氨基酸序列的基础上，通过双位点的定点饱和突变所获得的，所述突变体在低聚 糖生成量保持不变的情况下，转糖苷反应速率比野生型提高100%以上，优选提高150%以 上，更加优选提高200%以上。
2. 根据权利要求1所述的组合突变体，其中突变位点分别为第219位和第785位的氨 基酸。
3. 根据权利要求2所述的组合突变体，其中双位点的定点饱和突变分别为用甘氨酸 残基取代第219位的丝氨酸残基（S219G)和用缬氨酸残基取代第785位的谷氨酸残基 (E785V)、用丙氨酸残基取代第219位的丝氨酸残基（S219A)和用缬氨酸残基取代第785 位的谷氨酸残基（E785V)、用天冬酰胺残基取代第219位的丝氨酸残基（S219N)和用缬氨 酸残基取代第785位的谷氨酸残基（E785V)、或用缬氨酸残基取代第219位的丝氨酸残基 (S219V)和用缬氨酸残基取代第785位的谷氨酸残基（E785V)。
4. 编码权利要求1-3中任一项所述组合突变体的DNA分子。
5. 含有权利要求4所述DNA分子的重组表达载体。
6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其为重组酵母表达载体。
7. 表达权利要求4所述DNA分子的宿主细胞。
8. 根据权利要求7所述的宿主细胞，选自糖酵母属、克鲁维氏酵母属、裂殖糖酵母属和 甲基营养型酵母菌株，其中甲基营养型酵母菌株优选为毕赤氏酵母属菌株。
9. 一种制备具有高转糖苷活性的β_半乳糖苷酶的方法，包括以下步骤： 1) 用权利要求5所述的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株； 2) 培养上述重组菌株，诱导重组β_半乳糖苷酶的表达； 3) 回收并纯化所表达的高转糖苷活性的β_半乳糖苷酶。
10. 权利要求1-3中任一项所述的组合突变体、权利要求4所述的DNA分子、权利要求 5或6所述的重组表达载体、权利要求7或8所述的宿主细胞在制备β -半乳糖苷酶中的应 用。
【文档编号】C12N15/81GK104263710SQ201410514519
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】张伟, 张宇宏, 刘波, 孙宁, 张佳琳 申请人:中国农业科学院生物技术研究所