专利名称：二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因及其所编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明公开了一个来自小麦(7W"c"历ase"K"/z L.)望水白的二磷酸尿核甘 葡萄糖基转移酶基因(7^-W^)及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域，该基因导 入易感赤霉病小麦品种，可能降低小麦籽粒中DON的含量。
二背景技术：
小麦赤霉病(冊B)是一种真菌性病害，现在已经变成了 一个世界范围的破坏性 疾病。它能对小麦，大麦等小未谷类以及玉米等作物产生病害而直接造成作物减产。 另一方面，收获的粮食由于被deoxynivalenol (DON)和其他一些trichothecene toxins的污染而影响了品质。这些毒素对人和动物都是非常有害的。在这类毒素中， DON是包括中国在内的许多国家的粮食中最普遍存在的一类毒素。为了保护消费者 的安全，目前很多国家都对小麦面粉中DON的含量做出了一定的限制。
人们最早将小麦对赤霉病的抗性分为抗侵染(Type I)和抗扩展(Type II) 两种类型。后来的研究发现抗病品种存在能够阻止毒素DON合成或促使其降解的因 素，于是又提出了第三类抗性(Type III)即抗毒素或降解毒素积累。自第三类抗 性(Type III)提出后，人们在这方面做了很多的工作，已经发现了一些和抗毒素 或降解毒素积累相关的基因，例如从抗病品种中分离出来的具有降解DON功能的镰 刀菌乙酰基转移酶基因；近来还从拟南芥中克隆出了二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶 基因家族中的A^77基因，对该基因的研究表明ZW77基因可将葡萄糖基添加到D0N 和15A-D0N的3-0H位置上，使有毒的DON变成低毒物质而降低其毒性，转基因实验结 果也显示汰^77基因确实能降低D0N对植物的伤害(Brigitte Po卯enberger W Detoxification of the尸i/5ar/咖Mycotoxin Deoxynivalenol by a UDP-glucosyltransferase froro ylraWob/wis "a7/a"aT冊JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 278, No. 48, Issue of November 28, pp. 47905 - 47914， 2003)。 但是在小麦中还没有发现有这类基因的报道。小麦望水白是到目前为止普遍公认的 对赤霉病抗性强，抗性稳定，籽粒中D0N含量低的一个品种，所以我们从小麦望水 白品种中克隆出的降解DON的二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因可以导入到其他易 感赤霉病小麦品种中，从而有望增强小麦对D0N的抗性，降低小麦籽粒中DON的含量。
三
发明内容
技术问题-
丰发明的目的在于公开一个来自小麦(7WWc"历a9e"w朋L.)望水白品种中 的二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(ra-W 7)及其所编码的蛋白质，可作为目的基 因导入别的小麦品种，从而降低小麦籽粒中的DON的含量，进行小麦品种改良。 技术方案-
本发明二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(7^-w;7)及其所编码的蛋白质，来自
小麦(rrit/c娜L.)望水白，命名为7a-M^基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO.l。该二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因及其所编码的蛋白质，命名为Ta-UGT 蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。 有益效果
1、 本发明公开了一个二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(ra-〃6"及其所编码的 蛋白质。二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因为小麦中首次报道，该基因来自小麦
(7>"/c"/z asetjV鹏Z. J望水白品种，试验结果如图4所示在20ppm浓度的 DON培养基中，转基因阳性植株的T2代幼苗的生长势明显要比非转基因对照要好， 由此可证明T^-[/Gr基因能提高拟南芥对DON的抗性。将该基因转化到易感赤霉 病小麦品种中，有望提高小麦对赤霉病的抗性，降低小麦籽粒中的DON的含量， 进行小麦品种改良。
2、 利用本发明7a-w;r基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启
动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子。为 了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变 化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类， 也可用无标记选择。
四
图1用M-2-F和M-2-R引物在DON诱导的小麦望水白穗部cDNA文库中对7a-W r基 因的筛选结果有281bp条带的为筛出的阳性单克隆； 图2植物表达载体pCAMBIA1301-220. 6的构建模式图
图3拟南芥阳性转化株和非转基因对照株的Northern杂交结果A中CK为非转基 因对照，1 6为不同的阳性转基因拟南芥株；B为Northern杂交前的总RNA; 图4转基因拟南芥阳性植株幼苗与非转基因对照幼苗在含有一定浓度DON的MS培 养基上生长15天后情况CK为非转基因对照，5为转基因拟南芥5号阳性株后代 幼苗。
五具体实施例方式
1、利用芯片信息在经DON诱导的望水白穗部cDNA文库中进行候选基因的筛选小麦品种望水白(公知公用材料，裴自友贾高峰等普通小麦籽粒DON含量的 配合力分析作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2007 ，33 (5) :731 - 737)抽穗 期采用单花滴注法接种deoxynivalenol (DON) (Sigma)水溶液(100ppm)，用水接 种作为对照。接种后12、 24h取穗样，用TRIZOL (invitogen)按试剂说明书分别提 取总RM， D0N诱导的2份RNA等量混合作为实验组，水接种的2份RNA等量混合作为对 照组。实验组和对照组的RNA对Affymetrix wheat基因表达谱芯片(partnumber 900559) (Affymetrix)进行杂交，该实验在"上海国家生物芯片工程中心"完成， 实验步骤参照Affymetrix公司说明书"Expressed Analysis Technical Manual" (http://www-affymetyix.com/support/ technical/ manual/expression manual, affx)。以实验组信号与对照组信号比值大于2为标准筛选上调表达基因， 在上调表达的基因中发现增加倍数为2"倍的探针CA695961 (见网址 http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi7db^nucest&id二25417747)， 该基因推导的功能与已报道的拟南芥中降解D0N的基因汰^77为同一家族的葡萄糖 基转移酶基因家族。根据CA695961序列设计引物(引物序列分别为M-5， -GAGGCTACAGAGGAGTTG-3，和M-2-R : 5， -TGTATTCCCTTCATTTGG -3，)筛选DON 诱导的望水白小麦穗组织cDNA文库(由本实验室提供)，以该cDNA文库2W菌液为摸 板进行PCR反应10MM的5，引物和3'引物各O. 5W; 2. 5l4 10Xbuffer; 2. 2.5mM 的d鮮;L5Hl 25mM的mg2+; 0.(5胁l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25W。反应条件为94。C预变性3min; 94°C 45 s， 48°C 45 s， 72°C lmin， 33个循 环；72t延伸10min。 PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，筛选到的阳性单克隆提 取质粒测序，测序由上海英骏公司完成。对测序结果经BLAST比较分析发现这是一 个完整的cDNA序列SEQ IDNO.l，该基因全长1771bp，包含一个编码496个氨基酸的 完整的ORF框，该基因推测为二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(fa-M 7D。
2、植物表达载体的构建、农杆菌转化拟南芥及阳性拟南芥转化子的筛选和验证
植物表达载体pCAMBIA1301-220.6由pCAMBIA1301 (公知公用材料，薛仁镐基 因枪法转化大豆萌动种子影响因素的研究大豆科学第27巻第2期2008年4月)和 pBI220.6 (公知公用材料，Ya-Ping Chen "Plastidial Glut athione Reductase from他y朋Ws ta77osa is an Enhancer of Powdery Mildew Resistance in Wheat (7]ri"c咖aes".ra顶)Plant and Cell Physiology 2007 48(12) :1702-1712)组 合而成。
转基因载体pCAMBIA1301-220. 6-ra-M;7的构建过程如下根据Ta-W 7的全长序列SEQ ID NO. l设计能扩增出ORF的带有BamH I和Kpn I酶切位点的PCR引物
(Ta-UGT-B: 5， -ACTGGATCCCCAGCCTGACAGACTCCACT-3，和Ta-UGT-K: 5' -ACTGGTACCTCACCTGTGAGCCTGGTACA-3)，以含7a-W7堪因的质粒DNA作为模版进 行PCR扩增(PCR体系:20 ng质粒DNA; 10幽的5'引物3'引物各0.5Ml; 2. 5h1 10Xbuffer; 2. 2.5mM的dNTP; 1.25mM的Mg2、 0.25W (5U/W) Taq polymerase,加水至25W。 PCR程序:94。C预变性3min; 94。C 45 s， 58°C 45 s, 72°C 1.5min， 33个循环；72。C延伸10min)， PCR产物用BamH I和Kpn I酶切电泳并回收， 目的片段的回收和纯化按BiospinGel Extration kit试剂盒(BioFlux)说明书进行； pCAMBIA1301-220.6也用BamH I和Kpn I酶切电泳并回收；两种回收产物用T4连接酶 (Promega)连接形成重组质粒pCAMBIA1301-220.6-7k-〃(J7;转入农杆菌C58cl (公知 公用材料张彬等，农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究核农学报2007， 21 (2) : 124 127)。
转基因程序将含有pCAMBIA1301-220. 6-W7顺农杆菌株接种于YEB液体培 养基(含gOmg/L利福平，50mg/L卡那霉素)中扩大培养至菌液OD 600为0.6~0.8， 离心收集菌体沉淀，将菌体再重悬于同体积的转化渗透液(1/2MS+20免蔗糖+0.2W Silvet77)中备用。野生型拟南芥哥伦比亚生态型(ColO)种子(公知公用材料， 戴富明等农杆菌介导木霉几丁质酶基因转化拟南芥及其T,代对油菜菌核病抗性提 高上海交通大学学报农业科学版第23巻第1期2005年3月)浮于O. W的琼脂中4。C 条件下春化处理48h后，播种到基质(腐质营养土蛭石=1: 1)中，22°C 25flC， 16h光照/8h黑暗条件下生长。等生长至拟南芥初花期花瓣没有完全展开时，用备用 的农杆菌的转化液对拟南芥小花进行喷雾接种转化。转化后保湿48h后再进行第2次 接种，再保湿48h,以后在正常条件下生长，直到收获种子。
将农杆菌转化后收获的L代种子经0. 1%的升汞消毒15min，无菌水清洗2遍后 置于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，4flC黑暗条件下春化处理48h后，转到 22°C 25°C， 16h光照/8h黑暗条件下生长大概7 10天后选取在1/2MS培养基上能 正常生长的幼苗，移植到基质中在相同环境条件下继续生长。 3、阳性拟南芥转化植株Northern杂交
取经潮霉素筛选得到的阳性拟南芥转化植株及非转基因CK对照植株的叶片， 用TRIZOL (invitogen)按试剂说明书提取总RNA，以Ta-f/Gr为探针进行Northern 杂交。Northern杂交操作中的探针的标记、杂交、显色等程序按照DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter Kit I试剂盒(Roche)说明书进行。Northern杂交 结果如图3所示7ii-f/Gr在所有转基因拟南芥阳性植株中都有表达，不同阳性植株的表达量有差异；在非转基因对照植株未检测到该基因的表达。 4、阳性转基因拟南芥抗DON的功能验证
取经Northern杂交分析后的转基因拟南芥阳性植株的丁2代种子和非转基因拟 南芥种子，经0.1%的升汞消毒15min，无菌水清洗2遍后置于含50mg/L潮霉素的 1/2MS培养基上，同时将非转基因拟南芥种子置于不含潮霉素的1/2MS培养基上， 4Gc黑暗条件下春化处理48h后，转到22^ 250C， 16h光照/8h黑暗条件下生长大 概1 2周，选取在两种不同培养基上的转基因阳性株和非转基因对照株的株高、 大小、叶片数量、生长势基本一致的幼苗同时移植到DON浓度为20ppm的MS培 养基上，继续在相同环境下生长大概2 3周后，观察分析转基因阳性苗和非转基 因CK对照苗在DON环境中的生长情况。结果如图4所示在20ppm浓度的DON
培养基中，转基因阳性植株的T2代幼苗的生长势明显要比非转基因对照要好，由此
可证明T^"Gr基因能提高拟南芥对DON的抗性。将该基因转化到易感赤霉病小 麦品种中，有望提高小麦对赤霉病的抗性，降低小麦籽粒中的DON的含量。<110> <120〉 <130> 〈140> <141> <160> <170〉 <210〉 <211〉 〈212> <213> <220> <221> <222> <223〉 <400> 1 ggccattacg gcctgac3ga tggcc卿gc taccatcccc ceitcaccacg gggcctggtg tgggtgcgag atgtgccgcg tagctgcatc catcccgagg ttttcacaac gttccctaca tatggagcaa c犯tagcttc g犯ggtctgg 朋g3ggaaac gccaggctca tgttgaactg aggagctaag agacagaggt cgttggEigga tgtgcccatg gg3tgtgctg a肪ccaggag tgaaggggag gagggctttc gggaaacaag aacatgaagt acaggtgatt
序列表
南京农业大学
二"酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因及其所编码的蛋白质 说明书
00
2008-07-03 4
Patentln version 3. 1
1
1771 DNA
小麦(Triticura asetiv咖
Ta-UGT基因cDNA全长序列 (l).. (1771)
gccggggga3cacactacggttgccattgcaccgcttccaagccctccca60
ctccactagcacttcagccg3tcagcc8tgaccttcgccggcagcggtga120
ggctctgcgagggcgcacttcgtgctggtacccatgatggctcaaggccg180
atgaccgacatggcgtgcctgctggcagagcatggcgcgcaggtcagctt240
ccggtcaacgccgctaggttgg肌ggcttcgccgctaaggtggaggcggc300
gttcagctcgtggagctccacttcccgagtgt卿gttcggcctaccaga360
aacctcgscatgatccaatcaaagaatttgttctttaacttcatgaaggc420
ctgcatgagccgctcatggcgtacctccgtgagcagcagcgctcccctcc■
atatctgacatggcgcactggtggaccggtgEtcatcgC3agggagctegg540
ctcacctttagtggcttUgtggcttctcgtcccttgtcaggtacatcgt600
犯tgt3ttggagaatgtcacagatgacaatgagetcatcacgatcccggg660
ccgctagagttgacgaaggctaagttgcctggaaccctttgtgUccggg720
atccgtg缚aagatgtttgaggaggagctg卿tgcgstggtgagatcac780
3犯g缚ctcg3gac3ttgtacattgaatcctatgagc缚3840
8cgatcgggccaatgtgcctctgccaccga幼cagc幼c3gaacggccgc900
肪ggcgtcaatgg3tg鄉Cacagtgcttgcaatggcttgattc3agg朋960
gtgatctttgtgagttttggaagcctcgcttgcactacacctcaacaact1020
ggactgggacttgaagcctccaagaaaccatttgtUgggtgattaaagc1080
cttccagaagtcgagg犯tggctcgcagatgggttcgaggagegegtcaa1140
ctgatwtaaggggttgggcaccacagctcatgatcctgcagcacc肪gc1200
ttcgtfacgc3CtgCgggtggaactcaacaait卿gggcatctgtgc鄉1260
atcacatggccacwtttggggagcagtttttgaatgagaagetgettgt1320
caaatcgggatggaggttggagtgaaaggagtt3cacagtggggaagtga1380
gttatggttaccagagatgcgcagtgaacaccctgatggg1440
gCt3C卿ggagttgagaatgagagcagaagactgcgccattaaggcaag1500
gacgaggaaggttcttcttacaacaacgtaaggctgttaattcaagaaat1560
acgaatgcatgtggttgatagagattacctaagctcgctttttcagtgta1620
gaaacatcctagagtacatatatcatcatatagaattttgtaccaggctc1680
atttagagattatagatgatccaaatgaagggaatatc幼ttatcctctc1740
31771
2
496 PRT
小麦
(Triticum asetiv咖)
<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <幼0>
Met Thr Phe Ala Gly Ser Gly Asp Gly Gin Ser 1 5 10
His Phe Val Leu Val Pro Met Met Ala Gin Gly 20 25
ORF框氨基酸序列 (l).. (496)
2
Gly Ser Ala Arg Ala 15
Arg Thr lie Pro Met 30Thr
lie
Val
65
Ser
Gin
His
Ser
Arg 145
Ser
Val
ILeu
Met
Gly 225 Ser
Cys
Ala
Pro
Pro 305 Pro
Glu
lie
Val
lie 385 Phe
Val
Met
Glu
lie 465 Val
Asp
Thr
50
Glu
Val
Ser
Glu
Cys 130 Glu
Ser
Thr
Glu
Glu 210 Glu
Tyr
Leu
Ser
Gly 290 Gin
Phe
Trp
lie
Gly 370 Cys
Leu
Gly
Val
Gly 450 Lys
Arg
Met
35 Thr
Ala
Glu
Lys
Pro 115 lie
Leu
Leu
Asp
!>eu 195 Gin
lie
Glu
Cys
Met 275 Ser
Gin
Val
Leu
Arg 355 Gly
Ala
Asn
Val
Thr 435 Glu
Ala
Leu
Ala
Pro
Ala
Phe
Asn 100 Leu
lie
Gly
Val
Asp 180 Thr
lie
Thr
Gin
His 260 Asp
Val
Leu
Trp
Ala 340 Gly
Phe
Gly
Glu
Lys 420 Arg
Ala
Arg
Leu
Cys
Val
Gly
Gly
85
Leu
Met
Ser
lie
Arg 165 Asn
Lys
Arg
Asn
lie 245 Arg
Glu
lie
Val
Val 325 Asp
Trp
Val
Val
Lys 405 Gly
Asp
Thr
Arg
lie 485
Leu
Asn
Leu
70
Leu
Phe
Ala
Asp
Pro 150 Tyr
Glu
Ala
Glu
Ser 230 Thr
Asn
Ala
Phe
Glu 310 lie
Gly
Ala
Thr
Pro 390 Leu
Val
Ala
Glu
Ala 470 Gin
Leu
Ala
55
Val
Pro
Phe
Tyr
Met 135 Arg
lie
Leu
Lys
Lys 215 Phe
Arg
Ser
Gin
Val 295 Leu
Lys
Phe
Pro
His 375 Met
Leu
Thr
Val
Glu 455 Phe
Glu
Ala
40
Ala
Val
Asp
Asn
Leu 120 Ala
Leu
Val
lie
Leu 200 Met
Lys
Lys
Asn
Cys 280 Ser
Gly
Ala
Glu
Gin 360 Cys
lie
Val
Gin
Glu 440 Leu
Asp
Met
Glu
Arg
Gin
Gly
Phe 105 Arg
His
Thr
Phe
Thr 185 Pro
Phe
Glu
Lys
Arg 265 Leu
Phe
Leu
Gly
Glu 345 Leu
Gly
Thr
Asp
Trp 425 Thr
Arg
Glu
Gly
His
Leu
Leu
Cys
90
Met
Glu
Trp
Phe
His 170 lie
Gly
Glu
Leu
Val 250 Thr
Gin
Gly
Gly
Ala 330 Arg
Met
Trp
Trp
Val 410 Gly
Ala
Met
Glu
Asn 490
Gly
Glu
Val
75
Glu
Lys
Gin
Trp
Ser 155 Asn
Pro
Thr
Glu
Glu 235 Trp
Ala
Trp
Ser
Leu 315 Lys
Val
lie
Asn
Pro 395 Leu
Ser
Val
Arg
Gly 475 Lys
Ala
Gly
60
Glu
Asn
Ala
Gin
Thr 140 Gly
Asn
Gly
Leu
Glu 220 Thr
Thr
Ala
Leu
Leu 300 Glu
Leu
Lys
Leu
Ser 380 His
Gin
Glu
Asn
Ala 460 Ser
Thr
Gin
45
Phe
Leu
Leu
Cys
Arg 125 Gly
Phe
Val
Phe
Cys 205 Leu
Leu
lie
Arg
Asp 285 Ala
Ala
Pro
Asp
Gin 365 Thr
Phe
lie
Asn
Thr 445 Glu
Ser
Asn
Val
Ala
His
Asp
Ala 110
Ser
Asp
Cys
Leu
Pro 190 Val
Arg
Tyr
Gly
Gly 270 Ser
Cys
Ser
Glu
Arg 350 His
lie
Gly
Gly
Gin 430 Leu
Asp
Tyr
Ala
Ser
Ala
Phe
Met
95
Ala
Pro
lie
Gly
Glu 175 Thr
Pro
Cys
lie
Pro 255 Asn
Arg
Thr
Lys
Val 335 Gly
Gin
Glu
Glu
Met 415 Glu
Met
Cys
Asn
Cys 495
Phe
Lys
Pro
80
lie
Leu
Pro
Ala
Phe 160 Asn
Pro
Gly
Asp
Glu 240 Met
Lys
Lys
Thr
Lys 320 Glu
Leu
Ala
Gly
Gin 400 Glu
Val
Gly
Ala
Asn 480 Gly
<210〉 3 <211> 28<212> ■ <213>人工合成 <220>
<221> 引物Ta-UGT-B <222> (l)..咖 <223> <柳> 3
ctggatcccc agcctgacag actccact
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213>人工合成
<220>
<221> .引物Ta-UGT-K <222〉 (l)..咖 <223> <400〉 4
Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys 1 5 Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly 20
Cys Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly
10 15 Gly Thr Ala Cys Ala 2权利要求
1、二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因Ta-UGT，来自小麦(Triticum asetivumL.)望水白品种，命名为Ta-UGT基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2、 权利要求1所述二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因rfl-f/Gr编码的蛋白质，命名 为Ta-UGT蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
全文摘要
本发明公开了一个二磷酸尿核甘葡萄糖基转移酶基因(Ta-UGT)及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域。二磷酸尿核甘葡萄糖基因(Ta-UGT)的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，该基因来自小麦(Triticum asetivum L.)望水白，为小麦中首次报道，受deoxynivalenol(DON)诱导增强表达。试验证明，该基因的过量表达可以提高植物对DON的抗性。Ta-UGT导入易感赤霉病小麦品种，有望降低小麦籽粒中DON的含量。
文档编号C12N15/54GK101314776SQ20081002241
公开日2008年12月3日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者亓增军, 刘大钧, 曹爱忠, 王秀娥, 邢莉萍, 陈佩度, 马璐琳 申请人:南京农业大学