专利名称：快速检测谷丙转氨酶的测试条及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种测试条，特别涉及一种利用胶体金免疫层析技术检测全血、 血清或血浆中谷丙转氨酶的试纸条及制备方法。
背景技术：
谷丙转氨酶(ALT)是一种非血浆特异酶，游离存在于细胞浆中，尤其是肝 细胞中最丰富，在细胞内外浓度差很大；当肝细胞内外离子差改变，细胞膜肿胀， 细胞孔隙增大或细胞坏死时，谷丙转氨酶可自细胞内释放入血液中，致血清或血 浆谷丙转氨酶显著增高。因此被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的一种检 测指标。从临床用血的安全性来讲，谷丙转氨酶活力浓度检测弥补了肝炎病毒感 染"窗口期"抗体检测的漏检问题，因此对降低输血风险，预防肝炎传播具有积 极的意义。《中国输血技术操作规程》1997年版规定，血清谷丙转氨酶(ALT)为 血液初复检项目。而且，血清ALT的诊断在《中华人民共和国献血法》中也被列 为必测项目。
在本发明之前，谷丙转氨酶酶活性的检测从方法学上主要分为赖氏法、速率 法和微板丙酮酸氧化酶法，结果判定方法可目测但多数使用仪器，如分光光度计、 酶标仪、生化分析仪。较普遍使用的方法有赖氏法和速率法。赖氏法是该项目检 测的经典方法，但须手工操作，由分光光度计进行定量分析并手工记录实验结果， 较为繁瑣，结果易受人为因素影响。而且测定受标本质量的影响较大,如脂血、 溶血等都会造成谷丙转氨酶不同程度的升高，使标本结果出现假阳性。而速率法 虽准确性较高，但受内源性丙酮酸干扰较大，且需要特殊的设备(全自动或半自 动生化仪)，由于生化仪属精密仪器不宜经常挪动，故不能在流动献血车上使用， 而且生化仪价格昂贵，非基层血站所能承担，不易普及。微板丙酮酸氧化酶法 有操作简单、测量速度快及用酶标仪比色的优点，但易受血液中及容器和加样器 具中的还原物质的影响而消耗部分过氧化氢，使结果偏低；同时对反应时间的要 求较严格，加入酶工作液的时间应准确及时，否则过氧化氢会分解，也会使结果 变低；另外，检测结果受黄疰的影响亦较大。
发明内容
本发明的目的就是要克服上述缺陷，设计、研制一种测试条及制备方法。 本发明的技术方案是
快速检测谷丙转氨酶的测试条，其主要技术特征在于在底衬的一端粘贴玻璃 纤维膜，玻璃纤维膜上有金标抗ALT抗体A，玻璃纤维膜上粘贴样品垫，在底衬 的另一端粘贴吸水纸，在底衬的中间粘贴包被膜，在包被膜上分隔为检测区、控 制区，检测区包被抗ALT抗体B，控制区包被抗I gG抗体。
本发明的另一技术方案是
快速检测谷丙转氨酶的测试条制备方法，其主要技术步骤为
(1) 取抗ALT抗体一对，即针对ALT表面两个不同抗原决定簇的一对抗体 ——抗ALT抗体A和抗ALT抗体B;
(2) 包被膜緩冲液稀释抗ALT抗体B及抗IgG抗体至浓度为20-lOO^g/mL,分别在包被膜上划线，晾干后于25。C-37'C条件下在封闭液中浸泡，取出后于25'C-37'C烘干； (3 )柠檬酸三钠还原法得金颗粒直径为20nm的胶体金溶液； (4 )用0. 1M碳酸钎调节胶体金溶液pH值至7. 5 ~ 8. 5,按照每毫升胶体金 加入10—25pg抗体的量加入抗ALT抗体A，再依次加入5°/。的BSA lmL 和1%的PEG2画lmL，稳定后离心，弃上清，沉淀溶于10mL含1%BSA 和0. 05%线的pH8. 2的TBS中，得金标抗ALT抗体A; (5 )将金标抗ALT抗体A均匀地加在玻璃纤维膜上；
(6) 将包被膜、加有金标抗ALT抗体A的玻璃纤维膜、吸水纸粘贴在底衬 上，样品垫粘贴在加有金标抗ALT抗体A的玻璃纤维膜上；
(7) 包被膜上分隔成检测区和控制区，检测区包被抗ALT抗体B,控制区 包被抗IgG抗体。
本发明采用免疫学方法取代传统生化方法检测血液中的谷丙转氨酶，其优点 和效果在于
(1) 与现有ALT检测方法的原理截然不同，首次采用转氨酶的质量测定取 代转氨酶的活力测定。这样可以避免在酶活力测定中诸多因素的千扰，如标本的 质量、内源性丙酮酸和操作条件的不规范等造成的假阴性或假阳性结果。
(2) 大大简化了 ALT的检测步骤，操作简便，只需一步即可完成整个检测 过程，并且在检测时不需要特殊的仪器设备，肉眼即可观察结果。因此能广泛应 用于医院、血站、防疫站、卫生检疫部门、大专院校和科研机构的疾病诊断、流 行病学调查和科学研究，特别适用于现场、农村和基层单位使用。
本发明的其他优点和效果将在下面继续说明。
图1—一本发明结构原理示意图。 图2__本发明的检测结果示意图。
(a)是阳性结果示意图；(b)是阴性结果示意图。 图3—一本发明中胶体金层析法与速率法检测100份血清的试验结果示意 图。
图4——本发明胶体金层析法与速率法检测结果的统计分析示意图。
具体实施方式
如图1所示
试纸条是在底衬1上一端粘贴样品垫2,在样品垫2粘贴玻璃纤维膜3,玻 璃纤维膜3上均匀地加有金标抗ALT抗体A，在底衬1上另 一端粘贴吸水纸5, 底衬1的中间粘贴包被膜4,包被膜4分别设置有检测区6和控制区7 ，检测区 6包被抗ALT抗体B，控制区7包被抗IgG抗体。
试纸条的制备方法
1. 取(购买商品化)抗ALT抗体一对，即针对ALT表面两个不同抗原决定簇的一 对抗体——抗ALT抗体A和抗ALT抗体B，且这两个抗体与其相应抗原决定簇反 应时相互无空间位阻。
2. 抗体包被膜的制备
用包被膜緩沖液(0. 05M pH9. 6的碳酸盐緩冲液，0."拜膜过滤后，置2°C -8'C备用，有效期6个月淋释抗ALT抗体B及抗IgG抗体至浓度为20 ~ 100ng/mL, 分别在包被膜上划线，两条线之间的距离为0. 5cm。在室温晾干30min后，于25 °C ~ 37'C条件下，在封闭液(含1. 0%脱脂奶粉的0. 01M pH7. 4的磷酸盐緩冲液， 用0. 22nm膜过滤后，置2°C ~ 8'C备用，有效期5天)中浸泡60分钟，取出后
4于~ 37'C烘干4小时，封袋备试纸板贴板用。
3. 金标抗ALT抗体A的制备 3-1:胶体金的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备金颗粒直径为20nm的胶体金溶液。取0. 01%的 氯金酸水溶液100mL，加热煮沸，然后快速加入1%的柠檬酸三钠溶液2.5 mL， 继续煮沸5min，待恢复至室温后补水至原体积。 3-2:金标抗ALT抗体A的制备
用0. 1M碳酸钾调节胶体金pH值至7. 5 ~ 8. 5，按照每毫升胶体金加入10— 25pg抗体的量加入抗ALT抗体A,稳定10min后，再依次加入5%的BSA lmL和 1%的PEG扁lmL，稳定30min后于12000rpm离心40min,弃上清，沉淀溶于lOmL pH8. 2的TBS (含1%BSA和0. 05麵3)中,4C保存备用。
4. 金标抗ALT抗体A的干燥
将金标抗ALT抗体A均匀地加在玻璃纤维膜上，每毫升铺3 ~ 6平方厘米， 25'C ~ 37。C干燥24小时，封袋，置2°C ~ 8'C保存备用。
5. 试纸条的组装
加有金标抗ALT抗体A的玻璃纤维膜3的裁切
将加有金标抗ALT抗体A的玻璃纤维膜按要求进行裁切，置干燥房间备用。 吸水纸5的裁切
用裁纸机将吸水纸5切成35厘米长，4.2厘米宽，置干燥房间备用。 样品垫2的裁切
将玻璃纤维膜3切成35厘米，宽2厘米的长条，置干燥房间备用。 试纸条组装
按要求把包被膜4、样品垫2、加有金标抗ALT抗体A的玻璃纤维膜3、吸 水纸5粘贴在底衬1上，底衬1采用白色塑料制成。
6. 切条
用切条机将试纸条板切成单人份，每人份宽度2. 5mm~ 3. 5mra。
7. 试剂盒的包装与贮存
将本发明所述的试纸条固定在试剂外盒的底板上，上下盖密合，使上盖的加 样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，就成为可检测ALT 的胶体金免疫层析法试剂盒。试剂盒于4一8'C避光保存，不得冻存。
实际应用的梯:作步骤
A. 测试前应将试剂盒和待测样本恢复至室温。
B. 在加样窗中加入待测4本100pL。反应3—5min后肉眼即可观察结果，注 意》见测时间不纟寻超过1 Omin。
C. 结果判断
阴性(谷丙转氨酶水平正常)只有一条紫红色色带出现。 阳性(谷丙转氨酶水平异常)有两条紫红色色带出现。 失效无紫红色条带出现。 利用双抗体夹心法原理检测血清中ALT的含量。当待测样本中ALT含量大于 参考值(cutoff值)时，ALT先和金标抗ALT抗体A结合，由于层析作用反应复 合物沿包被膜向前移动，当遇到包被的抗ALT抗体B时，形成金标抗ALT抗体A 一ALT—包被抗ALT抗体B复合物而富集在包被线上，形成紫红色沉淀线，为阳 性结果，从而快速诊断出ALT异常升高的患者。 如图2所示加样后，反应3—5分钟即可看到检测区(T区)6和控制区(C区)7相应的位 置上出现紫红色条带。图2(a)的控制区7和检测区6均出现紫红色条带，结果 为阳性，说明样本中ALT含量异常；图2(b)中控制区7出现紫红色条带，而检 测区6不出现紫红色条带，结果为阴性，说明样本中ALT含量在正常值范围内。 如果控制区7不出现紫红色条带，说明试纸条失效。
针对谷丙转氛酶(ALT)测试方法的不足，向临床提供一种稳定可靠、反应迅 速、内源性干扰小、测试结果准确的优于常规检测方法且与常规方法有较高相关 性的测试试剂，从而建立一种方便快速的谷丙转氨酶现场检测方法，可用于血站、 基层医疗单位及健康体检中心。
为达到以上目的，本发明的技术解决方案是提供一种利用胶体金免疫层析法 检测谷丙转氨酶的试纸条，能实现一步操作即可快速、简便的检测谷丙转氨酶含 量。
本发明一改现有的测定酶活力的生化方法，而利用免疫学双抗体夹心法原理 检测酶的质量，并找到谷丙转氨酶质量与酶活力之间的关系。使得临床上不依赖 专业的仪器也能直接定性检测人体内ALT的水平。
本发明与速率法两种方法检测ALT的比较
如图3所示(速率法的正常值范围为0-—40U/L),两种方法的检测结果基 本一致。以速率法为对照，本发明在IOO份样本中有2份异常样本未能检出，但 本发明比速率法多检出5份异常样本，这7份检测结果不一致的样本其速率法检 测值均在临界值附近。本发明与速率法相比敏感度略高正符合初筛检测方法的需 要。
如图4所示，经统计学分析两种方法总的符合率为93% X2=0. 57 P>0. 05 两种方法无显著性差异。由以上结果可以看出金标层析试纸条法与速率法两种 方法之间的符合率高，表明酶的活力与酶质量之间成正比例相关。可以用胶体金 层析法取代速率法作为ALT初筛的检测方法。
权利要求
1. 快速检测谷丙转氨酶的测试条，其特征在于在底衬的一端粘贴玻璃纤维膜，玻璃纤维膜上有金标抗ALT抗体A，玻璃纤维膜上粘贴样品垫，在底衬的另一端粘贴吸水纸，在底衬的中间粘贴包被膜，在包被膜上分隔为检测区、控制区，检测区包被抗ALT抗体B，控制区包被抗IgG抗体。
2. 根据权利要求1所述的快速检测谷丙转氨酶的测试条，其特征在于样品垫、 玻璃纤维膜、包被膜和吸水纸组成膜条。
3. 根据权利要求1所述的快速检测谷丙转氨酶的测试条制备方法，其特征在于 底村采用塑料制成。
4. 快速检测谷丙转氨酶的测试条制备方法，其步骤为(1)取抗ALT抗体一对，即针对ALT表面两个不同抗原决定簇的一对抗体一_抗ALT抗体A和抗ALT抗体B; (2 )包被膜緩冲液稀释抗ALT抗体B及抗IgG抗体至浓度为20 - 100ng/mL，分别在包被膜上划线，晾干后于25°C ~37匸条件下在封闭液中浸泡，取出后于25'C-37'C烘干； (3 )柠檬酸三钠还原法得金颗粒直径为2Onm的胶体金溶液； (4 )用0.1M碳酸钾调节胶体金溶液pH值至7. 5 ~ 8. 5，按照每毫升胶体金加入10—25pg抗体的量加入抗ALT抗体A,再依次加入5%的BSA lmL和1%的PEG画。lmL，稳定后离心，弃上清，沉淀溶于10mL含1%BSA和0. 05%NaN3的pH8. 2的TBS中，得金标抗ALT抗体A; (5 )将金标抗ALT抗体A均勻地加在玻璃纤维膜上；(6) 将包被膜、加有金标抗ALT抗体A的玻璃纤维膜、吸水纸粘贴在底衬上， 样品垫fe贴在加有金标抗ALT抗体A的玻璃纤维膜上；(7) 包被膜上分隔成检测区和控制区，检测区包被抗ALT抗体B,控制区包被 抗IgG抗体。
5. 根据权利要求4所述的快速检测谷丙转氨酶的测试条制备方法，其特征在于 检测区包被的抗ALT抗体B与加在玻璃纤维膜上的金标抗ALT抗体A是针对 ALT表面两个不同抗原决定簇的 一对抗体。
全文摘要
本发明涉及检测谷丙转氨酶的试纸条及制备方法。本发明方案是底衬上粘贴玻璃纤维膜，玻璃纤维膜上有金标抗ALT抗体A，玻璃纤维膜上粘贴样品垫，在底衬另一端粘贴吸水纸，底衬中间粘贴包被膜，包被膜上有检测区、控制区，检测区包被抗ALT抗体B，控制区包被抗IgG抗体。本发明解决了赖氏法、速率法和微板丙酮酸氧化酶法各自存在的手工操作、人为因素影响结果、易出现假阳性，受内源性丙酮酸干扰较大及需要特殊的设备，和易受血液中还原物质的影响而消耗部分过氧化氢、检测结果受黄疸的影响亦较大等缺陷。本发明采用转氨酶的质量测定，避免在酶活力测定中诸多因素的干扰，简化了ALT的检测步骤，操作简便，可适用于现场使用。
文档编号C12Q1/52GK101424687SQ20081002195
公开日2009年5月6日 申请日期2008年8月20日 优先权日2008年8月20日
发明者童明庆, 顾芳红 申请人:南京大渊生物技术工程有限责任公司