专利名称：一种高温碱性木聚糖酶xyn10a及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性木聚糖酶XYNlOA及其基因和应用。
背景技术：
木质纤维素主要是由纤维素，半纤维素以及木质素这三大主要类多糖构成的高分子复合物，其中，纤维素是主骨架，木质素与半纤维素分散在纤维素之中及其周围，相互之间靠共价键连结，同时也存在一定程度的化学键(Martinez AT, Ruiz-DuenasFJ, Martinez MJ, et al. Enzymatic delignification of plant cell wall :from nature to mill. Curr Opin Biotechnol，2009，20 :348-357.)。半纤维素占到 20-30%，是由 D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖或D-半乳糖以直链或支链聚合而成的多糖。自然界中，木聚糖是半纤维素的主要组成成分，是半纤维素中最丰富的一种；其主链由吡喃木糖以β_1，4糖苷键连接而成(Saha BC. Hemicellulose bioconversion. J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30 279二91.)。根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要归类于6!110、11、39、43、52、62和67家族
(Henrissat BiBairoch A. New families in the classification ofglycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J，1993，293 :781-788.)0在饲料工业中，酸性木聚糖酶是一种饲料添加剂，其功能可消除抗营养因子的作用，提高饲料利用率，并且可降低食糜的粘稠度，可增大食糜和小肠粘膜的接触面积，从而提高营养物质的吸收率；还可减少畜禽粪便量，降低氮的排出率；并且可以提高动物体的抗病性(马玉龙.饲用酶制剂的研究进展及应用前景.粮食与饲料工业，1998，4 :29-31. )0 在制浆造纸工业中，碱性木聚糖酶用于纸浆漂白，降低漂白过程中化学药品的消耗和漂白废液中有害成分的含量，有效减轻造纸工业对环境的污染(杨桂花，陈嘉川，陈克复新型木聚糖酶辅助漂白杨木KP浆的研究，华东纸业，2011，42 :11-13.)。在纺织工业中，碱性木聚糖酶被用于棉及其混纺的纤维的生物复合酶精炼加工，能有效地去除纺织印染产品上残留杂质，达到可靠的润湿性。在食品工业中，木聚糖酶可以和β-葡聚糖酶协同作用，从而解决啤酒黏度问题，可提高酒液的澄清度，降低酿酒成本。木聚糖酶在工业中有着广阔的应用前景。近几年，研究发现天然来源的木聚糖酶难以满足工业实际需求，因此优良性质的天然酶的异源表达成为获得工业用酶一种有效途径。已报道的真菌木聚糖酶多数在酸性ρΗ条件下稳定，而在ρΗ超过10. 0后几乎丧失其活力，其不能适应造纸、纺织工业中的碱性环境。另外，细菌产的木聚糖酶虽能在碱性条件下有活力，但其表达量过低限制了其工业生产前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种高温碱性木聚糖酶ΧΥΝ10Α。本发明的再一目的是提供编码上述高温碱性木聚糖酶的基因xynlOA。本发明的另一目的是提供包含上述高温碱性木聚糖酶基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述高温碱性木聚糖酶基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述高温碱性木聚糖酶的方法。本发明的另一目的是提供上述高温碱性木聚糖酶的应用。本发明提供了一种高温碱性木聚糖酶XYN10A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示MRFSASLLLA LTGSAAASPI RAEEEIRVYD LPISLFDDLQ GLDAAMKAAGREYIGTSLTV60RNDFQEQNII RTEFGSITPE NAQKffDATEP NRGQFTFGSA DQHMDffARQNGKHVRCHTLV120WYSQLPGffVS NSGFNNATLQ QVMQNHINQV MGRYRGRCNHWDVVNEAPRL MAMRLQIGEA180YIPIAFRMAA QADPSAKLYY NDYNLEYLGP KVEGAARIVR LVKQYGARIDGVGYQAHLVT240EPTPTQSTPT PSEEDLIKAL RITADLGVDV AYTEIDIRMR TPSNAQKLQQLADAYYRVAR300SCMKVPRCVG MTIffGVTDRY SffVPNTFRGE GDALLffDSNYQRKAAYNAFL RGIQEPVN358其中，该酶基因编码358个氨基酸，N端17个氨基酸为其预测的信号肽序列如SEQ ID NO. 3 所示MRFSASLLLA LTGSAAA17因此，成熟的高温碱性木聚糖酶XYNlOA的理论分子量为38. 7kDa,其氨基酸序列
如SEQID NO. 2所示
SPIRAEEEIRVYDLPISLFDDLQGLDAAMKAAGREYIGTSLTVRNDFQEQ
NIIRTEFGSI60
TPENAQKffDATEPNRGQFTFGSADQHMDffARQNGKHVRCH
TLVffYSQLPGWVSNSGFNNA120
TLQQVMQNHINQVMGRYRGRCNHWD WNEAPRLMAMRLQI
GEAYIPIAFRMAAQADPSAK180
LYYNDYNLEYLGPKVEGAARIVRLVKQYGARIDGVGYQAHLVTEPTPTQS
TPTPSEEDLI240
KALRITADLGVDVAYTEIDIRMRTPSNAQKLQQLADAYYRVARSCMKVPR
CVGMTIffGVT300
DRYSffVPNTFRGEGDALLWDSNYQRKAAYNAFLRGIQEPVN 341本发明的木聚糖酶XYNlOA同时具有优良的pH稳定性，在中温和高温范围内均具有高活性。本发明的木聚糖酶，其最适PH值为7.0，在pH 5.0-10.0的范围内维持75%以上的酶活性；在PH 4. 0-12. 0之间，酶活很稳定；最适温度为70°C。本发明提供了编码上述高温碱性木聚糖酶基因xynlOA。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO. 4所示atgcgtttct ccgcctccct gctccttgcc ctgacgggct ccgctgccgc cagccctatc 60
cgggctgaggaagagatccgggtgtacgacttgcccatctcactgttcgatgatctgcag120
ggtctggatgctgccatgaaggctgccggaagggagtacatcggcacctccctcaccgtg180
aggaacgacttccaggagcagaacatcatccgcactgagttcggctcgatcacgcccgag240
aacgcccagaagtgggacgccaccgagcccaaccgcggccagtttaccttcggctctgcc300
gaccagcacatggactgggcccgccagaacgggaagcacgtccgctgccacacccttgtc360
tggtactcccagctccccggctgggtgtccaacagcggcttcaacaacgccaccttgcag420
caggtgatgcagaatcacatcaaccaagtgatgggccggtaccgtggccgctgcaaccac480
tgggatgtcgtcaatgaggctcccaggctgatggccatgcgattgcagatcggagaggcg540
tatatcccgattgctttcaggatggccgcccaggccgatccctcggccaagctctactac600
aatgactacaacctcgagtatctcggacccaaggttgagggtgctgcccgcatcgtgcgc660
cttgtcaagcagtacggcgctcgcatcgacggtgtcggctatcaggctcaccttgtcacc720
gagcccaccccgactcagtccaccccgactccgtctgaggaggacctcatcaaggctctg780
cgtatcaccgctgacctcggtgtcgatgtcgcctacaccgagattgatatccgcatgcgc840
accccgtcgaacgcccagaagctccagcagcttgcggatgcttactaccgcgtggctcgc900
tcgtgcatgaaggttccgcgCtgCgtCggCatgaccatttggggcgtcactgaccggtac960
tcgtgggttcccaacaccttccgcggtgagggtgatgcgctcctttgggacagcaactac1020
cagaggaaggccgcttacaacgctttcctccgcggcatccaggagcccgt1077
本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xynlOA，cDNA全序列分
果表明，木聚糖酶XYNlOA基因xynlOA全长1077bp。其中，信号肽的碱基序列如SEQ ID NO. 6
所示
atgcgtttct ccgcctccct gctccttgcc ctgacgggct ccgctgccgc c51
因此，成熟的木聚糖酶XYNlOA的基因序列如SEQ ID NO. 5所示
agccctatccgggctgaggaagagatccgggtgtacgacttgcccatctcactgttcgat60
gatctgcagggtctggatgctgccatgaaggctgccggaagggagtacatcggcacctcc120
ctcaccgtgaggaacgacttccaggagcagaacatcatccgcactgagttcggctcgatc180
acgcccgagaacgcccagaagtgggacgccaccgagcccaaccgcggccagtttaccttc240
ggctctgccgaccagcacatggactgggcccgccagaacgggaagcacgtccgctgccac300
acccttgtctggtactcccagctccccggctgggtgtccaacagcggcttcaacaacgcc360
accttgcagcaggtgatgcagaatcacatc aaccaagtgatgggccggtaCCgtggCCgC420
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ctctactacaatgactacaacctcgagtatctcggacccaaggttgagggtgctgcccgc600
atcgtgcgccttgtcaagcagtacggcgctcgcatcgacggtgtcggctatcaggctcac660
cttgtcaccgagcccaccccgactcagtccaccccgactccgtctgaggaggacctcatc720
aaggctctgcgtatcaccgctgacctcggtgtcgatgtcgcctacaccgagattgatatc780
cgcatgcgcaccccgtcgaacgcccagaagctccagcagcttgcggatgcttactaccgc840
gtggctcgctcgtgcatgaaggttccgcgctgcgtcggcatgaccatttggggcgtcact900
gaccggtactcgtgggttcccaacaccttccgcggtgagggtgatgcgctcctttgggac960
agcaactaccagaggaaggccgcttacaacgctttcctccgcggcatccaggagcccgtc1020
aactaa1026成熟蛋白理论分子量为38.7kDa，将木聚糖酶基因xynlOA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Chaetomium globosum CBS148. 51 假设的第十家族木聚糖酶氨基酸序列一致性为71%，与发表的来源于Penicillium funiculosum的木聚糖酶氨基酸序列一致性为46%。说明木聚糖酶基因xynlOA是一种新的木聚糖酶基因。本发明还提供了包含上述高温碱性木聚糖酶基因xynlOA的重组载体，优选为 pPIC9-xynlOA。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 pPIC9-xynlOA。本发明还提供了包含上述高温碱性木聚糖酶基因xynlOA的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/XynlOA。本发明还提供了一种制备上述高温碱性木聚糖酶XYNlOA的方法，包括以下步骤1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYNlOA的表达；以及3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10A。其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia past0ris)GS115，得到重组菌株GS115/ xynlOAο本发明还提供了上述高温碱性木聚糖酶XYN10A的应用，优选其在水解木聚糖及其在造纸、纺织工业中的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在造纸、纺织工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适PH 7.0，并在pH 5. 0-10.0范围内具有75%以上的酶活力，而且在pH 12.0仍具有50%以上的酶活力；具有很好的PH稳定性，37°C下作用Ih后，在pH 4. 0-12.0之间，剩余酶活性均在95%以上；最适温度70°C。此外，木聚糖酶XYN10A可有效降解各种不同类型的木聚糖，而不降解纤维素， 可以有效降解漂白纸浆中的木聚糖部分而不影响纤维素。因此，本发明的木聚糖酶将在造纸、纺织工业的应用中显示出其巨大的潜力。
图1重组木聚糖酶的最适pH。图2重组木聚糖酶的pH稳定性。图3重组木聚糖酶的最适温度。图4重组木聚糖酶的热稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂
1、菌株及载体毕赤酵母表达载体PPIC9及菌株GSl 15购自于hvitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Promega公司。底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(1)重组毕赤酵母菌培养基为马铃薯汁培养基1000mL马铃薯汁，IOg葡萄糖，25g 琼脂，PH 5.0。(2)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH 7.0)。(3) BMGY 培养基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(4)BMMY培养基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4. 0。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1木聚糖酶编码基因XynlOA的克隆提取腐殖霉Humicola sp. S8基因组DNA 培养3天后将菌丝体高速离心后取入研钵中，液氮冻制研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，加入2mL CTAB提取液，70°C水浴锅裂解池，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下12000rpm离心lOmin。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置IOmin后，4°C下12000rpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入0. 2mL TE溶解，置于-20°C备用。根据第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)序列设计合成了简并引物P1，P2 Pl 5' -TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3‘；P2 5' -TAYTCTATRTTRffARTCRTT-3‘。以Humicola sp. S8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94°C变性5min ； 然后94°C变性30sec，50°C降落45°C (每个循环降落0. 5°C )退火30sec，72°C延伸30s，十个循环；94°C变性30s，45°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环，72°C保温lOmin。得到一约 141bp片段，将该片段回收后与PEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各二条TAIL-PCR特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，第二条引物的位置设计在第一条引物的内侧。每两个引物之间的距离为50bp左右，引物长度一般22-30nt，退火温度在60°C。并将它们分别命名为uspl, usp2 (上游特异性引物)，dspl, dsp2 (下游特异性引物)见表1。表1.木聚糖酶XYNlOA TAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种高温碱性木聚糖酶XYN10A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或2所7J\ ο
2.一种高温碱性木聚糖酶基因xynlOA，其特征在于，编码权利要求1所述的高温碱性甘露聚糖酶XYN10A。
3.根据权利要求2所述的高温碱性木聚糖酶基因xynlOA，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或5所示。
4.包含权利要求2或3所述高温碱性木聚糖酶基因xynlOA的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-XynlOA。
6.包含权利要求2或3所述高温碱性木聚糖酶基因xynlOA的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。
8.一种制备高温碱性木聚糖酶XYNlOA的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYNlOA的表达；以及3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10A。
9.权利要求1所述高温碱性木聚糖酶XYN10A的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性木聚糖酶XYN10A及其基因和应用。本发明提供了一种新的高温碱性木聚糖酶XYN10A，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述高温碱性木聚糖酶XYN10A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的木聚糖酶最适pH 7.0，并在pH 5.0-10.0范围内具有75％以上的酶活力，而且在pH 12.0仍具有50％以上的酶活力，具有很好的pH稳定性；最适温度70℃。本发明的木聚糖酶XYN10A可有效降解各种不同类型的木聚糖，而不降解纤维素，将在造纸、纺织工业的应用中显示出其巨大的潜力。
文档编号D06M16/00GK102392007SQ20111039811
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者张菁, 詹志春 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司