动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶、其编码基因及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种动物粪便宏基因组来源的多功能木 聚糖降解酶、其编码基因及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 木聚糖是一个由β-1，4或β_1，3糖苷键连接的高度分支的异聚多糖，主链由木糖苷 键连接吡喃木糖基而成，侧枝包括乙酰基，L型阿拉伯糖基，葡萄糖醛酸基等。与木聚糖的结 构相适应，木聚糖降解酶种类丰富，完全降解木聚糖需要内切l，4-i3-D-木聚糖酶(endo-1， 4-0-D-xylanohydrolase，EC 3· 2 · 1 ·8)、β_木糖苷酶（β-D-xylosidase，EC 3· 2· 1 · 37)，a_L_ 阿拉伯咲喃糖苷酶(&-1^-&瓜13；[110;1^11瓜1108丨(1&86 40 3.2.1.55)、&-0葡萄糖酸酸苷酶(&-0-glucatronidase，EC 3.2.1.139)等多种酶的协同作用，通过这些酶的协同作用，木聚糖能 够有效地被水解(Collins et al.FEMS Microbiol Rev，2005,29:3-23)0
[0003] 植食性动物胃肠道中存在丰富的与木质纤维素降解有关的多种酶类，但不同动物 之间存在差异（Hess et al.Science，2011，331:463-467;Dai et al.PLoS 0ne，2012,7: e40430)。研究表明，不同环境及微生物来源的木聚糖酶酶学性质差异较大（Kimura et al.Biosci Biotechnol Biochem,2000,64:1230-1237；Gessesse et al.Appl Environ Microbiol ,1998,64:3533-3535)，因此研究鉴定不同来源的木聚糖降解酶对拓宽其应用领 域具有重要意义。
[0004] 胃肠道微生物群落是动物长期进化的结果，和动物的食性、机体的免疫功能、营养 需求等有着密切的关系。滇金丝猴(Rhinopithecus bieti)是典型的植食性灵长类动物，主 食粗纤维食物，研究发现其肠道中存在大量能分解纤维素、半纤维素的细菌，如纤维杆菌 属、密螺旋属、假单胞菌属以及瘤胃球菌属的细菌（Xu et al.BMC Genomics, 2015,16: 174)，但其与纤维素降解相关酶的研究工作很少。
[0005] 微生物是获取酶的主要来源，因此分离微生物是获取酶的首要步骤，一直以来研 究者多利用纯培养技术预先从环境样品中分离出能够利用纤维素的微生物，再从其体内提 取相关的酶。然而，传统的微生物纯培养技术使得占微生物种类99%以上的不可培养微生 物无法分离获得，因此通过分离培养微生物来筛选新型酶的传统方法大大限制了筛选的广 泛性和有效性。近年发展起来的宏基因组技术避开传统的微生物分离培养过程，直接研究 特定环境中的基因组DNA，借助新一代测序技术和生物信息学平台，挖掘利用大量过去无法 获得的新基因资源。
[0006] 宏基因组技术的应用拓宽了木聚糖降解酶的筛选与克隆的范围，Gong等从奶牛瘤 胃宏基因组文库中筛选得到高活性的GH10木聚糖酶(Gong et al，BMC Research Notes, 2012,1:566-576),该酶在4 °C时能保持25%的相对活性。Kim等从土壤宏基因组文库中筛选 得到一种新型双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶CelM2,可同时水解大麦葡聚糖及木聚糖(Kim et al,Biochem Biophy Res Commun,2009,383:183-186)〇
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶、其编 码基因及其制备方法，本发明提供的多功能木聚糖降解酶同时具有木聚糖酶、木糖苷酶和 阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低温活性。
[0008] 本发明的目的之一在于提供一种动物粪便宏基因组来源的多功能木聚糖降解酶， 其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，共402个氨基酸，其理论分子量为47.74kDa。本发明从滇 金丝猴粪便宏基因组中得到木聚糖降解酶基因 XynRBM，并将其转入大肠杆菌进行异源表达 和重组酶的酶学特性分析，发现获得的多功能木聚糖降解酶XynRBM同时具有木聚糖酶、木 糖苷酶和阿拉伯糖苷酶活性，且具有部分低温活性，在0°(：、10°(：、20°(：下分别具有13.5%、 46.9%、72.6%的酶活，可应用于低温产品加工，且本发明中的多功能木聚糖降解酶来源于 动物胃肠道，因此其性质具有进一步应用于饲料等领域的潜力。
[0009] 本发明的目的之二在于提供一种编码上述技术方案所述的多功能木聚糖降解酶 的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本发明从滇金丝猴的粪便中制备微生物宏基因组DNA，通过Hiseq基因组测序仪测 序宏基因组DNA，经功能注释发现木聚糖降解酶的编码基因 XynRBM，通过PCR的方法分离克 隆该基因，其全长为1209bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。经NCBI网站的BLASTP比对发 现，该木聚糖降解酶基因编码的氨基酸序列与GenBank中Treponema 1^5^]11:;[;[来源的匕6七&-1，4_xylanase(WP_022931984· 1)具有最高的一致性，为55%，但该Treponema bryantii来 源的蛋白活性并未研究，说明该木聚糖降解酶XynRBM是一种新的糖苷水解酶。
[0011] 本发明的目的之三在于提供一种包含上述技术方案所述的基因的重组表达载体， 优选为pEasy-E2-XynRBM。将本发明的基因 XynRBM插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表 达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明基因和表达载体 pEasy-E2通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E2_XynRBM。
[0012] 本发明的目的之四在于提供一种利用上述技术方案所述的重组表达载体转化宿 主细胞所得的重组菌株，所述菌株包括但不限于大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌， 优选为重组菌株BL21(DE3)/XynRBM。
[0013] 本发明的目的之五在于提供一种上述技术方案所述的多功能木聚糖降解酶的制 备方法，包括以下步骤：
[0014] 将木聚糖降解酶的重组表达载体转化宿主细胞得到重组菌株，培养重组菌株，诱 导重组木聚糖降解酶的表达；
[0015] 回收并纯化所表达的重组木聚糖降解酶，得到多功能木聚糖降解酶。
[0016] 其中，所述木聚糖降解酶基因按照以下方法获得：
[0017]以SEQ ID N0.3所示的上游引物和SEQ ID N0.4所示的下游引物为引物对，以滇金 丝猴粪便微生物宏基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到木聚糖降解酶基因；
[0018] 其中，上游引物的序列为:5 ' ATGAACGGAAGAACTTTAAAAAC3 ' ；下游引物的序列为:5 ' AATTATAATTTCAAGCAGTTTATC3'。
[0019] 具体而言，所述木聚糖降解酶按照以下方法获得：
[0020] 首先按照以下方法提取滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA:
[0021] 1)取出粪便样品，采用灭菌水清洗2次，称取0.2g粪便，置于5mL灭菌的离心管中。 [0022] 2)加 ASL buffer 1.4mL，震荡涡旋至充分混匀，70°C孵育5min后震荡15s。
[0023] 3)12 OOOrpm离心lmin，转移上清液到干净的离心管中。
[0024] 4)加入1片Inhibit EX Tablet，充分混匀后室温静止2min，确保Inhibit EX基质 吸附完抑制剂，12 000r pm离心5m i η。
[0025] 5)转移上清至新的离心管，12 OOOrpm离心5min。
[0026] 6)转移上清至新的离心管，加入15μ1蛋白酶K，和200μ1的buffer AL，混匀后70°C 孵育lOmin。
[0027] 7)加200μ1的无水乙醇，混匀后将液体转移到QIAamp吸附柱，12000g离心2min。
[0028] 8)用500μ1 的AW1 buffer清洗柱子，12 OOOrpm离心2min。
[0029] 9)加入500μ1的AW2 buffer，12 OOOrpm离心2min后，转移柱子到新的离心管。
[0030] 10)加30μ1 buffer AE，室温放置5min，12 OOOrpm离心2min。
[0031]获得的微生物宏基因组DNA置于-20°C保存备用。
[0032] 用超声打断仪Biorupter将5yg上述提取的微生物宏基因组DNA打断为400~600bp 的片段，用Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DN