生物反应器及其搅拌桨和使用其培养til细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培养 TIL细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL细胞)是一群存在于肿 瘤间质中的异质性淋巴细胞，TIL细胞对癌性胸、腹腔积液患者疗效显著。一般从肿瘤组织、 肿瘤引流淋巴结、癌性胸腹水中分离出的淋巴细胞经IL-2培养得到，其肿瘤杀伤活性为MHC 限制性，即为自体肿瘤特异性杀伤细胞，具有⑶3+⑶8+或⑶3+⑶4+表面标志。
[0003] 经测试TIL细胞的抗肿瘤效果是LAK的50~100倍，TIL细胞回输到体内血液及肿瘤 中可以存留达两个月之久，因此它有着巨大的潜在临床治疗价值。目前，TIL细胞治疗被广 泛应用于临床治疗，并取得良好效果。很多实验室开展的TIL细胞培养大多数为小规模培 养，把从癌性胸腹水离心得到的细胞用密度梯度离心法分离得到TIL细胞，用含10%FBS的 RPMI 1640培养基和IL-2接种到培养瓶中，通过添加 IL-2促进TIL细胞在体外大量扩增，中 分装到培养瓶中或者培养袋中扩增培养。
[0004] 现有TIL细胞的培养规模小，操作复杂，步骤繁琐，扩增倍数低，所扩增得到的数量 不够用于临床治疗，而且培养密度不能过高，浪费培养基，不利于节约成本和培养空间。此 外表面抗原表达量低，杀伤效果差。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种生物反应器及其搅拌桨和使用其培 养TIL细胞的方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种使用生物反应器培养TIL细胞的方法，搅拌桨外包裹有减小剪切力的材料。
[0008] 优选地，所述使用生物反应器培养TIL细胞的方法，包括以下步骤：
[0009] 用X-VIV0 15培养基将PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接种于培养瓶中，添加1% 培养基体积的TNF-α溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液，在37°C、5 %⑶2条件下培养，每2~3天 补充适量的培养基和IL-2，当培养体系达到一定体积后，转入生物反应器中继续培养至两 周；
[0010] 所述TNF-a溶液的浓度为50~500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100~1000U/ml，0KT-3 溶液的浓度为500~2000U/ml。
[0011] 优选地，所述TNF-a溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的浓度为300U/ml，0KT-3溶 液的浓度为500U/ml。
[0012]优选地，当培养体系大于500ml时，转入2L生物反应器中继续培养。
[0013]优选地，在生物反应器中培养TIL细胞的条件为：溶氧量为50%，pH7.2,搅拌速度 为45rpm〇
[0014] 优选地，所述PBMC通过以下方法获得：
[0015]外周血和生理盐水按体积比1:1进行稀释得到血液稀释液，将其加至二分之一倍 体积的淋巴细胞分离液上方，升降速调为0,800g离心30min，取单个核细胞层，用RPMI1640 培养基清洗两次，用X-VIV0-15培养基重悬细胞即得PBMC。
[0016] -种生物反应器搅拌桨，所述搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。
[0017] -种生物反应器，所述生物反应器的搅拌桨外包裹减小剪切力的材料。
[0018] 优选地，所述减小剪切力的材料为医用硅胶管或食用橡胶管。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0020] 1、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，在搅拌桨外包裹可以减小剪切力的材料， 可以降低细胞受到的剪切力伤害，有利于细胞大量扩增。
[0021 ] 2、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，在培养过程中不停的搅拌，为动态系统， 有利于细胞进行气体交换和为细胞提供均一的培养环境，有利于细胞大量扩增。
[0022] 3、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，在保证细胞质量的前提下，能够显著提高 细胞培养密度，有利于节约培养基和培养空间。
[0023] 4、本发明使用生物反应器培养TIL细胞，更接近人体内三维生长环境，与使用培养 瓶、培养袋等细胞贴壁生长的培养方式相比，更利于细胞大量扩增，可以大规模培养TIL细 胞，而且所得TIL细胞表面抗原表达量较高，对肿瘤细胞的杀伤活性较强。
【附图说明】
[0024]图1为各实施例和对比例培养的TIL细胞对HepG2细胞的杀伤活性结果。
【具体实施方式】
[0025]为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施例做进一步说明。本发明中所 用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。 [0026] TIL细胞是PBMC在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细 胞。PBMC可以使用现有任何方法获得。本发明中PBMC通过以下方法制备：
[0027]把60ml外周血转移至离心管中，用生理盐水按体积比1:1进行稀释，得到血液稀释 液;在一新离心管中加入淋巴细胞分离液，把血液稀释液缓慢添加至淋巴细胞液层上方，形 成明显的分界线，其中，淋巴细胞分离液与血液稀释液的体积比为1:2;升降速调为0,800g 离心30min，离心结束后，用巴氏吸管小心抽取单个核细胞层至另一新离心管中，往该离心 管中添加 RPMI1640培养基清洗细胞，300g离心5min，弃上清，再次添加 RPMI1640培养基清洗 细胞，300g离心5min，弃上清；用X-VIV0-15培养基重悬细胞得到PBMC悬液。取20μ1 PBMC悬 液用台盼蓝染色法(台盼蓝与PBMC悬液体积比为1:1)进行计数。
[0028] 实施例1
[0029]自2L生物反应器(购自北京元唐盛兴科技有限公司，美国BELLC0)中取出搅拌桨， 在搅拌桨外套上医用硅胶管，紫外照射灭菌后，重新将搅拌桨装回生物反应器内。使用该生 物反应器培养TIL的方法如下：
[0030] 取2 X 107个PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培养基接种于T75培养 瓶中，添加 TNF-α溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液培养，TNF-α溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液 的添加量为培养基体积的1 %。根据细胞的扩增情况，进行分瓶培养，当培养体系总量大于 500ml时，将其转入2L生物反应器中，按照温度37 °C，C02通气量为5 %，溶氧量为50 %，pH为 7.2，搅拌速度为45印111的条件继续培养至两周，培养基为含1~101]/111111^-2、0.5~5即/1111 TNF-α 和5 ~20U/ml0KT-3 的X-VIVO 15 培养基。
[0031] 所述TNF-a溶液的浓度为50~500ng/ml，IL-2溶液的浓度为100~1000U/ml，0KT-3 溶液的浓度为500~2000U/ml。本实施例中所述TNF-a溶液的浓度为200ng/ml，IL-2溶液的 浓度为300U/ml，0KT-3溶液的浓度为500U/ml。
[0032] 整个培养过程中观察并记录细胞生长情况，每2~3天进行细胞计数并补充适量的 培养基、TNF-a、IL-2和0KT-3，使细胞密度为1 X 106ce 11 s/ml，培养体系中IL-2的浓度为1~ 10U/ml，TNF-a 的浓度为0.5~5ng/ml