用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为201180048967. 1，申请日为2011年9月2日，发明名称为"用 于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于细胞的生物反应器放大的细胞培养系统，尤其涉及用于体外培养 分离的干细胞的无血清且无异种蛋白成分的细胞培养系统。
【背景技术】
[0003] 多能（pluripotent)干细胞，比如间充质干细胞（MSC)，是治疗多种人类疾病的理 想候选者，所述疾病包括心肌梗塞、缺血性中风、各种自身免疫疾病等。示例性的干细胞，包 括但不限于，ES或ESC(胚胎干细胞）、ADSC(脂肪细胞干细胞）、神经干细胞、iPSC(诱导性 多能干细胞）、人类胚胎干细胞（hESC)、非人类灵长类ES细胞等，可用于下游的治疗应用， 比如细胞疗法。有效的细胞疗法可能潜在地需要大量的这些细胞。随着通过临床的开发的 细胞疗法的进展，制造规模和成本成为迫在眉睫的问题。对于MSC细胞类型，如脂肪来源的 干细胞（ADSC)等，大多数临床试验已在小规模下进行，其中所需的细胞数是通过传统细胞 培养技术获得的，传统细胞培养技术中细胞以二维方式在处理过的组织培养表面上贴附生 长。然而，这些标准的二维培养方法过于劳动密集，且不足以满足多种细胞疗法应用的潜在 大规模需求。展望未来的规模化和商品化，很有可能是需要源自一个同种异体供体的大约 10 12-1014或更多的细胞以用于有效的治疗用途，尤其是在需要多剂量的治疗期间。这个量 的MSC细胞远远超过使用现有生产规程所能交付的量。更重要的是，为了用于人类细胞疗 法，对于遵守监管的终产品而言，MSC细胞培养系统需要在培养期间完全排除动物血清。
[0004] 到目前为止，MSC已经生长于各种系统，包括二维培养，二维培养是小规模的且 微载体的、其使用血清或减量的（reduced)血清（DosSantosF等人，JCellPhysiol 223:27-35,（2010))。在本申请提交之时，据信，MSC是不会附着至微载体上的，除非介质包 含至少一些血清，和/或，至少在预先包被有血清的微载体上。然而，MSC培养过程中即使 是微量血清的存在都是不遵守GMP的。这些MSC在血清中培养过程中产生的另一个重要问 题是，这种MSC能否保持多能（或维持其干性（sternness))，因为不同血清批次的血清含有 可变的分化因子，其可能会导致培养物的分化。
[0005] 因此，尽管存在用于在培养物中培养MSC的系统，在获得遵守GMP的、维持MSC干 性并可有效用于动物治疗用途的MSC生长的大规模系统中仍然存在着许多障碍。
【发明内容】
[0006] 在一个方面中，本发明涉及用于培养干细胞（SC)的细胞培养系统，包括：在其中 可培养SC的无血清（SF)细胞培养基；以及预先包被有无异种蛋白成分（exno-free) (XF) 干细胞附着基质（substrate)的微载体珠。在某些实施方式中，SC是间充质干细胞（MSC)， 细胞附着基质是CELLStart?，或MSC是脂肪细胞来源的干细胞（ADSC)，或MSC源自自体或 同种异体供体，或在一个具体方面中，系统进一步包括能够在受控条件下培养所述sc的生 物反应器，以及在一些方面中，SC是IPSC。
[0007] 在另一个方面中，本发明涉及组合物，该组合物包括：i)SF间充质细胞培养基； ii)微载体珠；iii)XF细胞附着基质；以及iv)MSC。在某些实施方式中，细胞附着基质是 CELLStart?，或MSC是脂肪细胞来源的干细胞（ADSC)，或MSC源自自体或同种异体供体。
[0008] 在另一个方面中，本发明涉及培养MSC的方法，其包括：在适宜所述MSC生长和扩 增的受控条件下、在SF间充质细胞培养基中的包被有XF细胞附着基质的微载体珠上培养 MSC〇
[0009] 在另一方面中，本发明涉及生产蛋白质的方法，其包括上面描述的方法，其中在培 养之后从MSC中回收蛋白质。在某些实施方式中，细胞附着基质是CELLStart?，或MSC是 脂肪细胞来源的干细胞（ADSC)，或MSC源自自体或同种异体供体，或MSC获自骨髓、血液、皮 肤、脐带血或软骨膜；以及涉及上述方法，其中蛋白质是重组蛋白质，且MSC经工程化改造 来生产重组蛋白质。
[0010] 在又一个方面中，本发明涉及在悬浮培养物中将MSC培养至高密度的方法，其包 括：将MSC附着至包被有无异种蛋白成分的细胞附着基质的微载体上；并在适宜所述MSC 细胞生长和扩增的条件下、在支持所述细胞生长的无血清培养基中培养MSC。
[0011] 本发明还涉及用于在悬浮液中体外大规模培养干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括 一个或多个容器，其中第一容器包含可在其中培养干细胞的无血清介质；第二容器包含无 异种蛋白成分的细胞附着基质；和干细胞。
[0012] 本发明还涉及上述方法获得的MSC的用途，或获自MSC的重组蛋白质的用途；或获 自干细胞的有益因子的用途，其均用于治疗特定疾病病症。
【附图说明】
[0013] 图1A-图1E:使用无血清和无异种蛋白成分（SF和XF)系统的微载体上的细胞生 长动力学。基于无血清（SF)微载体的MSC扩增通过使用StemPro:KMSCSFM无异种蛋白 成分（XF)介质进行（见实施例）。图1A和1B显示了在含有10%FBS的介质中培养的MSC， 以及图1C和1D显示在StemPi-〇K'MSCSFM无异种蛋白成分（XF)介质中培养的MSC。在 l〇〇ml转瓶中，在StemPr〇KMSCSFM无异种蛋白成分（XF)介质中观察到约15倍的MSC细胞扩增（也见图1E的图）。
[0014] 图2A-图2D:来自用St_lPro〃:MSCSFM无异种蛋白成分（XF)介质运行的 DasGIP生物反应器的结果。MSC细胞以37, 500个细胞/ml接种在400ml体积的SFM/XF介 质中，在购自Invitrogen的包被有CELLStart?的SoloHill125微米塑料珠上生长。每隔 一天进行50%的介质更换。图2A显示第1天的珠上的细胞，和图2B显示第9天的珠上的 细胞。对于DasGIP(DG珠）生物反应器的运行，细胞生长显示于图2C中。如图2D可见，第 5天（120小时）的细胞数目倍增是显著的，到第7天（168小时）是急剧的6000倍增，并在 第12天（288小时）继续增加。
[0015] 图3A-图3B:生长在StemPro?MSCSFM无异种蛋白成分（XF)介质中的微载体 上的骨髓MSC的介质消耗分析。图3A显示在5-11天之间葡萄糖被迅速消耗。每2-3天更 换50%介质。图3B显示在3-11天之间乳酸相应迅速积累。
[0016] 图4A-图4F:采用细胞染色方法的生物反应器扩增后的MSC细胞的功能分析。图 4A-C:用于脂肪细胞染色的60%异丙醇中的0. 5%油红0溶液染色。4A:在微载体培养之 前，生长在含有10 %MSC级FBS的DMEM介质中的MSC;4B:在微载体培养之后，含有10 % MSC级FBS的DMEM介质；4C:StemPr〇'KMSCSFM无异种蛋白成分介质微载体生长培养显 示出可比较的脂肪形成分化。图4D-F:对于骨生成，用茜素红染料对细胞进行染色。4D:在 微载体培养之前，生长在含有10 %MSC级FBS的DMEM介质中的MSC;4E:在微载体培养之 后，含有10%MSC级FBS的DMEM介质；4F:StemPr(VKMSCSFM无异种蛋白成分介质微载 体生长培养显示出可比较的骨生成分化。
[0017] 图5A-图? :如图1A-图1E中所示的使用含血清的介质（含有10%FBS的DMEM) 在微载体上的细胞生长动力学的比较数据。
[0018] 图6 :采用流式细胞术的来自二维组织培养板和微载体培养的MSC的部分特征。这 里显示的是二维和微载体培养中阳性MSC细胞表面标志物⑶90的表达（克隆5E10)。
[0019] 图7A-图7E:二维培养中人骨髓MSC细胞培养的比较。图A和C:生长于 SternPro'KMSCSFM无异种蛋白成分（XF)介质中的细胞（分别为传代1次和传代9次）。 图B和D:生长在含有10 %MSC级FBS的DMEM介质中的细胞（分别为传代1次和传代9 次）。图7E显示在含有FBS或在XF条件下生长于二维和微载体培养中的细胞的可比较的 群体倍增。
【具体实施方式】
[0020] 本发明涉及用于在无血清和无异种蛋白成分条件下在大规模培养中培养干细胞， 如MSC，的组合物和方法。本申请中的大多实施方式和实施例涉及使用MSC细胞培养用于细 胞培养中大规模、无血清和无异种蛋白成分的扩增。然而，如本领域技术人员可以认识到， 本发明的教导可被应用到多种细胞，包括其它已知的干细胞和干细胞系。本领域技术人员 知道如何通过使用相应的无血清和无异种蛋白成分培养基来实施本发明，或培养特定的干 细胞（包括MSCS、ESC等）。因此，除了MSC，本发明的组合物和方法可适用于其它干细胞， 包括但不限于ES或ESC(胚胎干细胞）、ADSC(脂肪细胞干细胞）、神经干细胞、iPSC(诱导 性多能干细胞）、人胚胎干细胞（hESC)、非人类灵长类ES细胞等。
[0021] 间充质干细胞（MSC)是示例性的干细胞，其是多能中胚层衍生的祖细胞。它们有 分化成多种细胞类型的能力，包括但不限于，脂肪或脂肪细胞（脂肪细胞）、骨（骨细胞）、 软骨（软骨细胞）、肌腱（肌腱细胞）或肌肉组织（成肌细胞）等，其呈现出开发基于细胞 的疗法的宽广潜能。成人间充质干细胞可以从骨髓间质（stroma)中分离，或从其它来源分 离，包括但不