专利名称：巨细胞病毒特异性细胞免疫应答体外检测模型的制作方法
巨细胞病毒特异性细胞免疫应答体外检测模型技术领域 该发明涉及一种能在体外检测巨细胞病毒(CMV)特异性细胞免疫 应答的模型，该模型不仅可以方便地在体外检测患者的巨细胞病毒特异性细胞 免疫应答，而且可以筛选新型药物。
背景技术：
近年来，科学家们纷纷致力于开发新的抗CMV药物，以期抑制病 毒引起的免疫病理损伤。新药疗效的检测，首先需要建立一 CMV特异性免疫应 答体外检测模型，但目前国内外就此尚未见相关报道。将经典的CMV实验室株 感染人成纤维母细胞为抗原递呈细胞，流式细胞仪检测细胞因子及HLA分子表 达的方法，分析该病毒株感染的细胞诱导免疫应答的能力，研究发现感染细胞 表面MHC I类分子表达明显降低，未能检测到病毒特异性的细胞免疫应答，因此 并不适宜作为检測模型。发明内容为排除MHC I类分子表达降低而对抗原递呈的影响，本发明建立一 种以CMV突变株感染人成纤维母细胞为抗原递呈细胞，刺激淋巴细胞，釆用流 式细胞仪检测细胞内IFN- Y表达的方法，建立一在体外检测CMV特异性细胞免 疫应答的模型；该突变体基因组缺失了一段抑制主要组织相容性复合体I类分 子表达的基因序列USll、 US12，不影响MHC I类分子的表达，故不影响细胞对 病毒特异性抗原的递呈。
具体实施例方式-.CMV感染人,锥母细胞剌激外周血淋巴细胞将人成纤维母细胞接种于 24孔细胞培养板中，每孔加入2mlDMEM培养基，细胞长成单层，铺满全孔， 按照l: l的比例(数量比)，加入CMV突变株病毒液，37。C感染l小时，弃 掉游离的病毒液，加入2ml DMEM细胞培养基，在37。C 、 5% C02的孵箱中孵育48小时，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，之后加入2乂106外周血淋巴细 胞，孵育2小时后，加入10 ng/ml高尔基体抑制剂Brefeldin A，继续培养 4h。二 细胞内细胞因子标记法检测IFN-y:培养结束后，收集细胞，PBS洗涤 一次，将细胞重悬于含0. 02% EDTA的PBS溶液中，37°C孵育15分钟，离心， PBS洗涤一次，将细胞重悬于红细胞裂解液中室温避光孵育10分钟，洗涤、 重悬细胞；加入破膜剂室温避光反应20分钟，PBS洗涤一次，加入鼠抗人 CD8-APC、 CD3-PerCP和IFN- y -FITC抗体4。C避光标记30分钟，PBS洗涤一 次后，重悬细胞，在流式细胞仪上进行检测，分析受到CMV感染细胞的刺激 时，淋巴细胞产生IFN- y作为CMV特异性免疫应答的指标。本发明的有益效果是，能在体外检测患者的巨细胞病毒特异性的细胞免疫应答；若在该体系中加入待检的新药，即可检测其对细胞免疫应答的影响，从而筛选新药。
权利要求
1. 一种巨细胞病毒特异性细胞免疫应答体外检测模型，由三部分组成重组巨细胞病毒感染人成纤维母细胞，刺激淋巴细胞，流式细胞仪检测细胞内细胞因子，其特征在于重组巨细胞病毒突变体缺失了一段抑制主要组织相容性复合体I类分子表达的基因序列US11、US12，将该重组病毒以1∶1(数量比)感染人成纤维母细胞48小时，加入淋巴细胞共同孵育6小时，然后流式细胞仪检测细胞内细胞因子IFN-γ的表达，作为病毒特异性细胞免疫应答的指标。
全文摘要
抗巨细胞病毒新药疗效的检测，需要建立一巨细胞病毒特异性免疫应答的体外检测模型，但目前国内外就此尚未见相关报道。以传统的巨细胞病毒实验室株感染细胞建立的模型，因病毒抑制主要组织相容性复合体I类分子的表达，影响抗原递呈，而不能检测到病毒特异性免疫应答。本发明采用巨细胞病毒突变株感染人成纤维母细胞为抗原递呈细胞，刺激淋巴细胞，流式细胞仪检测细胞因子γ-干扰素的表达作为指标，建立一巨细胞病毒特异性细胞免疫应答的体外检测模型。在此模型中加入待检药物，即可以检测该药对病毒特异性细胞免疫应答的影响。
文档编号G01N33/569GK101246166SQ200710063900
公开日2008年8月20日 申请日期2007年2月15日 优先权日2007年2月15日
发明者斌 孙, 武志明, 王延军 申请人:王延军;孙 斌;武志明