引起对抗黄病毒的免疫应答的抗原及其应用方法
【专利说明】
[0001] 本申请是以下申请的分案申请：申请日：2009年11月17日；【申请号】 200980145447. 5 ;发明名称：同上。
技术领域
[0002] 本发明涉及引起对抗黄病毒的免疫应答的抗原及其应用方法。
【背景技术】
[0003] 日本脑炎病毒（JEV)血清复合组（serocomplex-group)由包含西尼罗河病毒 (WNV)和JEV的蚊传播黄病毒组成，这两种病毒均可引起人类的严重脑炎。自从1999年WNV 进入美国以来，其迅速传遍美国，其在西半球的地理分布预计将进一步扩大，而JEV是东南 亚、中国和印度的病毒脑炎的最常见原因。目前，尽管在努力开发针对这两种病毒的疫苗， 但对二者还没有FDA批准的特定治疗。
[0004] 黄病毒西尼罗河病毒（WNV)和日本脑炎病毒（JEV)是引起人类大部分病毒性脑炎 的原因。WNV感染广泛的禽类和包括人在内的哺乳动物物种。已显示，WNV可通过输血、器 官移植和哺乳来传播。西尼罗河脑炎（WNV)病毒覆盖了包括南欧、非洲、中亚以及最近的北 美的广大地理区域。该病毒在以色列、埃及、印度和巴基斯坦通常造成脑膜脑炎的症状。在 埃及，该病毒是所有脑膜炎和无菌性脑炎中3%的原因。JEV是亚洲的病毒性脑炎的最重要 的单种原因，病死率平均为30 %。JEV是东南亚、印度和中国的主要问题，该病毒是这些地 区的地方病。近年来，JEV已传播到其他地理区域，例如澳大利亚和巴基斯坦，并且因此造 成这些地区的重要新兴病毒感染。
[0005] 日本脑炎（JE)是包括大脑、小脑和脊髓在内的中枢神经系统的炎症。已显示，利 用来源于小鼠脑的灭活疫苗进行针对JEV的接种非常有效并减少了疾病负担。然而，对该 疫苗的免疫原性和安全性还有担忧。我们由原代仓鼠肾（PHK)细胞产生的活减毒的基于细 胞培养的JEV疫苗在中国已经获得批准，该疫苗显示安全有效。然而，由于PHK不是经证实 可产生人疫苗的细胞系，许多国家不使用这种JEV疫苗。
[0006] JEV感染被看作是脑炎的最严重病毒性原因之一，死亡率达到30-50%，并且幸存 者中有高百分比的神经后遗症[8]。因此，地区和国内公共卫生机构（包括WHO)通常推荐 病区的居民进行针对日本脑炎的大规模免疫程序。在发达的非病区国家，JE被看作是罕见 的外来疾病。但近几十年来，来自非病区的游客和其他旅行者中的感染病例报告几乎每年 都有报道。然而，有危险的国际旅游者人群中疫苗覆盖率非常低，这不仅是因为部分旅行 者及其旅行健康顾问缺乏对该病的认识，还因为惧怕与目前批准的小鼠脑来源的JEV疫苗 JE-VAXR相关的潜在有害反应[33]。
[0007] JE-VAXR是由小鼠脑产生的福尔马林灭活的疫苗，在日本批准用于儿童，在美国和 一些欧洲国家批准用于旅行者和军人。对多剂量方案的需要和与反应原性相关的问题使其 应用复杂化。在发展中国家，需要无需频繁加强即可引起持续免疫的可负担的疫苗来控制 JE。小鼠脑来源的JEV疫苗几十年来已广泛用于亚洲各国和一些发达国家。在澳大利亚、 欧洲和北美接受免疫的成人中，已报道了严重的副反应，所述副反应由风疹或血管性水肿 构成，在某些情况中还有呼吸困难。这些副反应的出现率不一，为每10000次注射中小于1 至104次，其中过敏反应是所涉及的主要原因之一。
[0008] 黄病毒的E蛋白最具有免疫原性，适于疫苗开发。蛋白E由3个结构域（DI、DII 和Dili)组成，其中DIII主要含有亚复合体和类型特异性表位。数种基于DIII的疫苗在 某些情况下已显示出具有免疫原性和有效性。
[0009] DIII蛋白在若干WNV和JEV株之间高度保守。WNV的DIII与JEV的DIII的整体 氨基酸同一性和相似性的值分别大约为81 %和94%。DIII充当受体结合域，形成可独立折 叠的连续多肽部分。当然，DIII内的突变已显示出影响黄病毒的毒力和趋向性。rDIII是 较稳定的蛋白，因此可成为具有吸引力的抗原。由于天然DIII也不被糖基化，因此在原核 细胞中细菌表达过程中蛋白糖基化的缺乏很可能不影响其抗原性。在受各毒力病毒侵染的 小鼠中，JEV和登革热病毒的重组DIII已显示了免疫原性和保护性，表明DIII基疫苗制剂 抗黄病毒的适合性。然而，在前期尝试中，可以清楚看到需要相对高浓度的rDIII来诱导中 和抗体应答，表明rDIII免疫原性较差。
[0010] 最近对来自亚洲的JEV株的分子分析将该株分为4个不同基因型群[37]。由于现 有的JEV疫苗只是基于JE的一个株，因此这种高度的序列多样性带来了对抗循环株JEV的 JEV疫苗的交叉保护效果的问题和担心[12, 13]。
[0011] 与例如免疫疗法中的活减毒病毒和基于重组蛋白的疫苗等传统疫苗相比，DNA疫 苗具有若干优势[24-26]。人体中DNA疫苗表现出极好的耐受性。临床前安全性研究表明， 没有质粒整合的证据，并且由于质粒载体的功效不受预先存在的中和抗体的影响，DNA疫苗 还可用于反复施用。此外，DNA疫苗似乎非常稳定并且制备简单。然而，最初研究报告DNA 疫苗在大型动物和人中显示了较低效价。
[0012] 使疫苗开发的问题复杂化的是，虽然通常认为循环中的所有株都属于由中和限定 的单一血清型[37]，但黄病毒RNA基因组具有较高突变率，因此亚洲和澳大利亚人群中循 环的JEV具有遗传多样性[35, 36]。
[0013] 仍然需要安全有效的JEV疫苗来保护哺乳动物对抗多种JEV和WNV血清型。还仍 然需要可有效增强DNA疫苗的免疫应答的有效佐剂。
【发明内容】
[0014] 本发明的一个方面包括编码蛋白E的共有DIII域的分离核酸。这些核酸可以包括 核苷酸序列 ：（a)SEQIDN0:12、13或14;(b)编码氨基酸序列SEQIDN0 :9、10或ll的核苷 酸序列；或（c) (a)或（b)的互补物。在本发明的另一方面，提供了包含本文提供的分离核 酸的遗传构建体。在一些实施方式中，遗传构建体可包括Kozak序列GGT ACC GCC ACC(SEQ ID NO. 15)和/或选自IgG或IgE的一部分的前导序列。
[0015] 在本发明的另一方面，提供了包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列含有：（a) SEQ ID N0:9、10 或 11 ;或（b) (a)的片段。
[0016] 还有下述的本发明的方面，即能够在宿主中产生对抗多种WNV和JEV血清型的免 疫应答的DNA疫苗，所述疫苗包含：（a)包含启动子的遗传构建体，所述启动子与含有本文 提供的分离核酸的编码序列可操纵连接；和（b)药学上可接受的赋形剂；其中，所述遗传构 建体能够在宿主细胞中以效引起免疫应答的量表达蛋白E抗原的共有Dili域。
[0017] 在本发明的一个方面，提供了在宿主中引起对抗多种黄病毒的病毒血清型的免疫 应答的方法，所述方法包括：(a)将本文提供的疫苗递送到宿主的组织中；和（b)利用递送 能量脉冲的电穿孔设备将组织的细胞电穿孔，所述能量脉冲有效地使疫苗的遗传构建体进 入细胞。
【附图说明】
[0018] 本领域技术人员参考附图可以更好理解本发明的多个目标和优势，在附图中：
[0019] 图1A-E:图1A，具有由病毒和宿主细胞蛋白酶催化的切割位点的黄病毒多蛋白的 组织结构。黄病毒的E的三维构象显示具有3个不同域，即域I、II和III。右侧，质粒图 谱揭示了该研究中所用的疫苗构建体的各种元件。图1B，给出了 DV-U的共有氨基酸序列。 对使分泌过程最大化的IgE-前导序列下划线。图1C，JEV DIII、嵌合JE/WNV DIII和WNV Dili JE/WNV DIII片段的限制性消化表明了 DIII编码区的长度（435bp)。泳道左端，显示 了 DNA梯形带。图1D，DNA疫苗构建体的体外表达。DNA疫苗构建体产生的35S-标记的基 因产物在SDS凝胶中进行解析，如"材料与方法"中所述。蛋白产物对应于质量约16. 5kDa 的迀移率。缺乏对应于pVAX空载体的蛋白产物表明该反应的特异性。图1E，RD细胞中 DIII-疫苗构建体的表达分析。以疫苗构建体转染细胞，在转染后2天，通过RT-PCR分析细 胞中是否存在DIII-特异性mRNA转录物。假转染细胞不能出现适当的扩增产物。利用适 当的引物，在DIII-构建体转染的细胞中观察到约435-bp的产物，这证实了相应DIII-编 码转录物的存在。
[0020] 图2A-C:图2A. 3种不同IL 15同种型的定位。将HeLa细胞转染表达SSP或LSP 或OPT IL 15同种型的质粒，并在转染36小时后通过免疫荧光测试进行分析。将细胞固定、 与单克隆抗-IL15抗体温育，然后与抗小鼠 FITC-偶联二抗温育。用DAPI对细胞的核内容 物进行复染色。将空载体用作负对照，假转染细胞未产生任何特异性染色（a-c)。IL15-SSP 同种型不分泌，而是储存在细胞内并出现在核组分中（d-f)，但IL15-LSP同种型（g-i)和人 密码子优化的IL 15(j-l)与分泌的IL 15关联，清楚显示在细胞质区域中。图2B，IL15同 种型的分泌水平。RD细胞以IL15表达构建体（1 μ g/孔）转染，两天后通过ELISA分析上 清中是否存在分泌的IL15蛋白。IL15ECR0表达构建体产生最高水平的IL15分泌。图2C， 为了比较分泌水平，将IL15LSP和OPT构建体分泌的量显示为相对于SSP形式的增长倍数。
[0021] 图3 :DIII蛋白片段的细菌生产和纯化。将DIII-编码区克隆到pQE30-表达载体， 按照"材料与方法"中所述从细菌裂解物中纯化蛋白样品。对PAGE的考马斯染色显示了在 细菌表达体系中纯化过程的不同阶段收集的样品。与Ni-柱结合之后，含有20mM-咪唑的 洗脱缓冲液不能将DIII片段释放，250mM的咪唑有效地选择性洗脱了组氨酸标记-DIII片 段。标出了具有合适分子量（16. 5kDa)的纯化DIII片段的明显条带。
[0022] 图4A-B:图1A.显示了接种和免疫的流程计划。通过CELLECTRA?电穿孔仪 (VGX Pharmaceuticals，Blue Bell PA)对BALB/c小鼠以20Xg疫苗构建体或pVAX空载体相 隔2周进行免疫，并在一周后处死。图1B，抗-DIII血清与纯化DIII片段特异性反应。将 Dili DNA-接种的小鼠的血清在37°C在96-孔Ni-螯合板上与1 μ g/孔的纯化DIII蛋白 样品温育1小时。利用抗小鼠 IgG HRP通过常规显色程序检测适当抗体的生成。在450nm 读取平板。值表示3个重复孔的平均值（±}S. D)。
[0023] 图5A-B :用DNA-接种的小鼠的血清对DIII-转染细胞进行染色。以表达疫苗构 建体的PVAX或pWNV DIII (图5A中的片）或pJEV DIII (图5B中的片）转染HeLa细胞。 转染后2天，将细胞固定，并以用这些DNA疫苗构建体免疫的BALB/c小鼠的血清进行温育。 然后将细胞与FITC-偶联的抗小鼠二抗以及将细胞核内容物复染色的DAPI进行温育。各 组下方给出了缺乏适当染色的PVAX-血清样品。
[0024] 图6:EDIIIELISpot。用20μgpVAX载体或DIII-表达构建体对BALB/c小鼠免 疫3次，每次相隔2周，1周后处死。收集脾细胞，在RlO (阴性对照）或2μg/ml的3种纯 化DIII蛋白样品中的任何一种的存在下过夜培养。利用自动ELISP0T读板器对点形成单 位（Spot forming unit)进行定量，并将原始值相对于每一百万个脾细胞的SFU进行标准 化。值表示3个重复孔的平均值（±}S. D.)。
[0025] 图 7 :显示了 DNA构建体pVAXl-WNV DIII、pVAXl-JEV DIII 和嵌合构建体pVAXl-JW Dili的质粒图谱。
【具体实施方式】
[0026] 给出以下简要或短小的定义来帮助理解本发明的优选实施方式。本文给出的简要 定义是非穷尽性的，并且不与本领域所理解的定义或工具书解释相抵触。本文给出的简要 定义是为了补充本领域已知定义或使本领域已知定义更清楚。
[0027] 定义
[0028] 本文所用的核苷酸和氨基酸的序列同源性可利用FASTA、BLAST和Gapped BLAST (Altschul等人，Nuc. Acids Res. ,1997, 25, 3389,通过参考将其整体并入本文）以 及 PAUP*4. OblO 软件（D.L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)确定。简而 言之，BLAST算法（表不Basic Local Alignment Search Tool)适合于确定序列相似性 (Altschul等人，J. Mol. Biol.，1990, 215, 403-410,通过参考将其整体并入本文）。用于进 行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information) (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)公开获得。BLAST 算法所提供的相似性的 一个度量是最小和值概率（P(N))，其表明了两个核苷酸序列之间偶然发生匹配的概率。例 如，如果测试核酸与另一核酸相比时最小和值概率小于约1，优选小于约0. 1，更优选小于 约0. 01，最优选小于约0. 001，则认为该核酸与另一核