专利名称：乙肝病毒前s的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫诊断试剂，具体涉及一种乙肝病毒前S1(Pre-S1)抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法。
长期以来，临床医生是根据“二对半”试剂盒检验结果判断乙肝患者的病情。但是“二对半”试剂查的是与乙型肝炎病毒(HBV)相关的表面和核内抗原和抗体，不是直接查HBV。因此该方法不能确定患者有无HBV。此外，用“二对半”试剂盒检查结果表明全世界约有3亿人为乙肝表面抗原(HbsAg)携带者，我国约有1.3亿，已成为世界之最，但实际上其中的部分人既无临床症状，转氨酶也不高，因此，并非所有HBsAg阳性者都携带HBV。
本发明的目在于克服现有检测HBV的缺陷，研制一种特异性强、简便、灵敏的检测试剂。
本发明提供了一种乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒。该试剂盒是由主要成份为预包被反应条、酶标记前S1抗体、次要成份为阳性对照液1支、阴性对照液1支，20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶和终止液1瓶组成。
本发明的试剂盒中所述预包被反应条为48～96孔；阳性对照液为HBV-DNA和HBeAg均阳性血清；阴性对照液为正常人血清；底物缓冲液甲为H2O2；底物缓冲乙为3,3’.5.5’-四甲基联苯胺(TMB)和终止液为4NH2SO4。
本发明的乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒的临床结果如下1993年9月至1994年3月，新华医院、第一人民医院、长海医院、长征医院、海军411医院和北京佑安医院等单位，使用上海新新医学生物工程公司研制、生产的乙型肝炎病毒前S1(Pre-S1)蛋白双抗体夹心ELISA试剂盒，检测各种急、慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后的血清标本，并与常规乙肝病毒免疫标志物(HBV-M)和乙肝病毒DNA(HBV-DNA)进行比较。现将结果总结报告如下。
Ⅰ材料与方法一、临床血清标本各医院临床收集血清标本总数为1244份，包括HBV-M有一项以上的阳性标本900份，HBV-M阴性196份，(其中长海48份，市一82份，411医院66份)。
二、实验方法1、Pre-S1蛋白检测按“乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒”说明书进行操作。即取已包被Pre-S1蛋白单抗条排酶标板，孔内加血清标本50μl，同时设阳性和阴性标准孔；37℃温育30min，弃血清并洗涤三遍后加稀释后的酶标抗Pre-S1蛋白单抗50μl，置酶标板于37℃温育30min后，弃液并充分洗涤5遍。用TMB底物显色、终止反应，在酶标仪上读波长为450nm处的吸光度值(OD值)。测定孔OD值大于阴性标准孔8倍为阳性。其中LAK细胞治疗前后的阳性配对标本尚计算不同稀释度的P/N比值。
2、HBV-M检测均采用国产或进口EIA试剂盒检测。
3、HBV-DNA:PCR法。
Ⅱ结果一、Pre-S1与HBeAg阳生符合率以HBeAg为比较参项，219份HBeAg阳性血清中有195份为Pre-S1阳性，其阳性符合率为89.0％(见表1)。
二、Pre-S1与HBV-DNA(PCR法)符合率以HBV-DNA(PCR法)为比较参项，219份HBV-DNA(PCR法)阳性血清中有200份为Pre-S1阳性，其阳性符合率为91.3％(见表2)。
三、各类HBV感染者Pre-S1蛋白和HBV-DNA测定结果海军411医院选择的200份血清标本分为急性乙型肝炎、慢性活动性肝炎、慢性迁延性肝炎和无症状携带者4类。测定结果表明，在急性乙型肝炎，Pre-S1阳性率达93.3％,HBV-DNA阳性率为96.6％；在慢性活动性肝炎的阳性率分别为33.3％和38.1％。四组之间阳性率比较相差显著(p＜0.01)，急性乙肝和慢活肝组Pre-S1阳性率分别高于慢迁肝和无症状携带者组(p＜0.01)，而急性乙肝组Pre-S1阳性率又高于慢活肝组(p＜0.01)。见表3。
四、LAK细胞治疗前后Pre-S1滴度和HBV-DNA比较长征医院测定了26对慢活肝LAK细胞治疗前后血清Pre-S滴度，见表4。结果表明LAK细胞治疗后HBV-DNA阴转率26.3％,Pre-S1阴转率29.4％。两者的阴转率比较相差不显著(P＞0.05)。
五、Pre-S1阳性样品重复性结果(CV％)在10％以内，见北京佑安医院的结果，见表五。
Ⅲ讨论Pre-S1蛋白是HBVS区基因编码产物，它和Pre-S2蛋白一起在HBV附着和侵入肝细胞的机制中起重要作用。Pre-S1蛋白主要存在于Dane颗粒中，HBsAg球形颗粒中亦有少量Pre-S1蛋白。已证实HBV的前S1的P21-47肽是吸附于靶细胞受体的配体。
目前，通过血清学检查以判断HBV感染状态的常用手段是检测HBV-M，即所谓“两对半”HBsAg-HBsAb,HbeAg-HBeAb和HBcAb，其中HBeAg和HBcAb阳性，表明HBV在肝内复制。然而，常规HBV-M检测方法繁琐、耗时，且结果分析比较复杂。PCR法测定HBV-DNA亦已在一些大、中型医疗机构开展，但是尽管该方法有敏感性高、特异性强等特点，亦因其操作步骤繁琐、技术要求高、消耗性试剂昂贵等不能被普遍应用。Theilman等首先报告用western blot技术检测了HBsAg阳性病人血清Pre-S1蛋白，认为该蛋白与HBeAg和HBV-DNA有良好的相关性，是HBV在体内复制的标志。Pre-S1蛋白单克隆抗体的制备，使该蛋白的酶联免疫测定技术的建立成为可能”，上海新新医学生物工程公司成功制备了抗Pre-S1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，并建立了Pre-S1的双抗体夹心ELISA技术。经过临床应用结果表明，Pre-S1检测在下述几个方面具有重要价值一、Pre-S1-蛋白是很好的HBV复制标志本文各医院219份HBeAg阳性血清标本，195份检出Pre-S1蛋白，阳性率达89.0％。各医院219份HBV-DNA(PCR法)阳性血清标本，200份检出Pre-S1蛋白，阳性符合率为91.3％，显示出本试剂盒检出的Pre-S1蛋白与HBeAg和HBV-DNA(PCR法)有良好的相关性，HBsAb和HBeAb均阳性标本未检出Pre-S1蛋白和HBV-DNA，提示机体建立了清除HBV机制后，HBV-DNA和Pre-S1蛋白均消失。HBV-M和HBV-DNA阴性的健康人血清标本也未检出Pre-S1蛋白，因而本Pre-S1蛋白试剂盒能很好判断病人是否有乙肝病毒复制。
二、Pre-S1蛋白的检测结果与乙型肝炎活动程度有关表3结果提示，在乙型肝炎的急性期，Pre-S1-蛋白多为阳性(92.5％)，与本型肝炎HBV的高度复制状态相吻合；在慢性活动性肝炎组，Pre-S1蛋白的阳性率(35.1％)明显高于慢性迁延性肝炎(4.4％)和无症状携带者(2.0％)。据此，我们认为，对于Pre-S1蛋白阳性，同时合并其他肝功能异常或伴临床症状者，应高度怀疑慢性活动性肝炎或急性乙型肝炎。
三、Pre-S1蛋白可以作为药物或其他生物疗法，治疗乙型肝炎的疗效判定指标最近，Haruna等对35例HBeAg携带者干扰素治疗前后Pre-S1、S2蛋白水平进行动态定量观察，结果发现，治疗有效者Pre-S1、S2蛋白水平明显低于无效者。认为临床上有可能以Pre-S1蛋白的消长作为干扰素或其他抗病毒制剂的疗效判定指标。本组初步观察了LAK细胞治疗后Pre-S1蛋白的消长与HBV-DNA转阴之间的关系，结果表明，LAK细胞治疗后，随着HBV-DNA的阴转，Pre-S1蛋白亦转阴或滴度下降，说明Pre-S1蛋白的消长与HBV的清除相关。
我们认为，该试剂盒具有操作简便、迅速、经济、可靠等特点，更因Pre-S1蛋白与HBV-DNA和HBV-M之间良好的相关性，该检测项目可以补充或替代常规“两对半”和PCR检测法，深为临床检验工作者欢迎。
表1各医院HBeAg阳性血清中Pre-S1阳性符合率结果医院检测 总例数 HbeAg(+) PreS1(+) PreS1和HbeAg长海 236 4034 85.0％(34/40)长征 118 8682 95.3％(82/36)新华 174 1210 83.3％(10/12)市一 200 2018 90.0％(18/20)411298 6151 83.6％(51/61)合计 1096 219 195 87.4％(195/219)表2 各医院HBV-DNA(PCR法)阳性血清中Pre-S1阳性符合率结果医院检测总例数HBV-DNA PreS1PreS1和HBV-DNA(PCR法)长海 236 39 36 92.3长征 188 114 98 86.0新华 174 16 12 75.0市一 200 20 16 80.0411298 40 38 95.0北京佑安 148 61 54 88.5合计 1244 280 254 86.1(254/280)表3 各型肝炎前S1蛋白与HBV-DNA的关系临床类型 N 前S1-前S1+DNA- DNA+急性乙型肝炎 40 3 37 238慢性活动性肝炎94 6133 57 37慢性迁延性肝炎113 108 5 103 10无症状带抗体者51 483 48 3正常对照组66 660 66 0本发明的另一目的是提供了乙肝病毒前S1抗原酶免测定试剂盒的制备方法。该方法包括下列步骤
(一)前S1抗原基因重组成前S1基因片断的21-47aa及10-199aa；(二)免疫Balb/c小鼠，得前S1抗体阳性鼠；(三)细胞融合，Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤胞株；(四)筛选阳性克隆后，进行杂交瘤细胞扩增，得腹水；(五)抗前s1单抗制备，腹水除去细胞及其他杂质得纯化前s1单抗；(六)HRP-抗前S1单抗制备，辣根过氧化物酶(HRP)与前S1单抗偶联；(七)包被前S1抗体成为予包被反应条；(八)分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；(九)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；(十)组装成为成品。
本发明的试剂盒在使用时可以如下操作1．取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落。
2．每孔加待检血清50ul，各板设阳性对照1孔(50ul)阴性对照1孔(50ul)，空白对照1孔(加蒸馏水50ld)，然后除空白对照孔外各孔加酶标记液1滴(50ul)，置37℃中反应20分钟。
3．取出反应板甩去孔内液体后在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次条孔加满洗涤液后停留30秒钟，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底。(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸镏水即为工作洗涤液)4．各孔滴加底物缓冲液甲、乙各1滴，室温避光10～15分钟后再每孔滴加终止液1滴，置酶标仪中450nm波长读数。
结果判定阴性对照(A值)×2.5=临界值(cut off值)，阴性对照高于0.05时按实际OD值计算，阴性对照小于0.05按0.05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。
本发明的试剂盒能非常专一地检测患者血清中HBsAg-preSl蛋白的浓度。它具有简便，灵敏和稳定等特点。且本试剂盒操作简便快速，采用酶标一步检测法可在1小时内获得实验结果，比PCR检测法省时60％以上(PCR法最快需3小时完成实验)，经临床试用preSl蛋白检测阳性与PCR检测的HBV-DNA阳性有很好的符合率，药盒的临床阴阳性预示值为90％。因而本药盒对判断病人是否有病毒复制，确定乙肝感染病程具有十分重要的参考意义，与PCR操作相比它没有苛刻的技术和条件的限制，整个实验中无需贵重意仪器设备，凭肉眼可判断实验结果，能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查。PreS1，抗原检测试剂盒，具有简便、灵敏、重复性好的优点，能检出完整HBV，将可被普遍使用，做为HBV感染，复制和乙肝病人诊断、治疗和预后的一个新的标志，与其PreS1抗体合成新的乙肝检测系统。
实例制备乙肝病毒前S1蛋白酶免试剂盒的生产(一)纯化包被抗体(HBsAb)抗HBs单抗(SOH3)腹水，离心除去细胞，加等体积的饱和(NH4)2SO4沉淀，经DE-52柱纯化，收集蛋白峰，加(NH4)2SO4沉淀，PBS透析得单抗SOH3。SDS-PAGE鉴定上样蛋白浓度为5-10ug/ml，基本为均一的染色条带。纯度＞80％，效价＞10万。
(二)酶标记抗体制备1．单抗制备细胞株复苏扩增，注射Balb/c小鼠腹腔中，取腹水，效价＞10万，腹水用50％饱和(NH4)2SO4沉淀粗提，再经DE-52柱纯化，得抗preS1单抗。效价＞10万，SDS-PAGE鉴定。2．酶标记抗体制备抗preS1单抗用过碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。效价》20003．酶标记抗体浓度选定采用方阵滴定法选择酶标记抗体的工作浓度大于1∶2000。
preS1合成抗原从10ng/ml倍半稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体测定，以确定最适稀释度。(三)预包被抗体板的制备1．包被Na2CO30.6gNaHCO31.58g重蒸水500ml加入适量Anti-S抗体，调整PH至9.5，加入微孔板各孔中，置湿盒中加盖，4℃过液后甩干。2．洗涤Na2HPO4·12H2O2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4g20％Tween-20 2.5mlNaCL8.2g重蒸水 100ml调整PH至7.2,1∶10稀释后，加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，以除去剩余抗体。3．封闭明胶 1.1g微波炉加温 注入酶标BSA5.0g至呈透明溶液板各孔中
0.1N PBS 20ml---→冷却至室温---→‘蒸馏水至100ml弃去液体，放入湿盒中(加盖) 吸水纸上拍干 重复一次，待干燥后，--------→37℃lhr-----→放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。
(四)阳性对照的制备HBeAg和HBV-DNA同时呈阳性的乙肝患者血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本药盒测定A值＞0.3，备用，分装。
(五)阴性对照的制备用本试剂万分之二硫柳汞盒测定A值--→0-0.40-------------→备用正常人血清---→ 用小牛血清 万分之二--→0.040-0.100----------→------→备用稀释0.040 硫柳汞 分装(六)酶标单抗配制10％小牛血清90％0.15MPBSAnti-preS1-HRP----------------→稀释20倍，分装。
(稀释度1∶2000)(七)标单抗稀释液BSA 0.5gNa2HPO4·12H2O 2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4gNacl 8.2g20％Tween-202.5ml重蒸水 100ml调整PH至7.2(八)底物液ANa2HPO4·12H2O 1.7g柠檬酸.H2O0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ml调整PH至5.0(九)底物液BNa2HPO4·12H2O 1.7g柠檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml调整PH至5.0后，加入IOmlDMSO含60mgTMB的溶液25ul(十)终止液浓H2SO410ml蒸馏水 80ml(十一)10x洗涤液Na2HPO4·12H2O2.6gNaH2PO4·2H2O 0.4g20％Tween-20 2.5ml重蒸水 100ml调整PH至 7.2(十二)半成品及成品的组成上述(一)→(十一)步骤所得产品装人小瓶及尖底离，b管中，即为半成品。抽出三份经过特异性、稳定性、灵敏度及精密度检定合格才能组装成preS1试剂盒。组装成盒后还需抽出三份同半成品一样经过检定合格才能出售。
权利要求
1.一种乙肝病毒preS1抗原酶联免疫测定试剂盒，其特征在于该试剂盒是由主要成份前S1抗体预包被反应条48～96孔、酶标记前S1抗体和次要成份阳性对照液1支、阴性对照液1支、20倍浓洗涤液1瓶、底部缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶及终止液(4NH2SO4)1瓶组成。
2.一种如权利要求1所述的一种乙肝病毒pre S1抗原酶联免疫测定试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(一)前S1抗原基因重组成前S1基因片断的21-47aa及10-199aa；(二)免疫Balb/c小鼠，得前S1抗体阳性鼠；(三)细胞融合，Balb/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤胞株；(四)筛选阳性克隆后，进行杂交瘤细胞扩增，得腹水；(五)抗前s1单抗制备，腹水除去细胞及其他杂质得纯化前s1单抗；(六)HRP-抗前S1单抗制备，辣根过氧化物酶(HRP)与前S1单抗偶联；(七)包被前S1抗体成为予包被反应条；(八)分装试剂盒其余7种成份，按试剂盒需要量分装在小瓶或尖底离心管中；(九)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度、稳定性合格；(十)组装成为成品。
3.根据权利要求1所述的一种乙肝病毒pre S1抗原酶联免疫测定试剂盒，其特征在于其中所述的阳性对照液为HBV-DNA和HbeAg均阳性血清、阴性对照液为正常人血清、浓洗涤液为磷酸-Tween-20、底物缓冲液甲为H2O2、底物缓冲液乙为3,3’.5.5’-四甲基联苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种乙肝病毒前S
文档编号G01N33/576GK1323988SQ00115678
公开日2001年11月28日 申请日期2000年5月15日 优先权日2000年5月15日
发明者杜凤鸣, 郭葆玉 申请人:上海新新医学生物工程公司, 杜凤鸣