一种针对rsv粘附g蛋白表面抗原的全人源单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及全人源抗体，特别是全人源的抗呼吸道合胞病毒(RSV)G表面糖蛋白的 单克隆抗体。
【背景技术】
[0002] 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起婴幼儿、青少年急 性下呼吸道感染的主要病原，也是引起小儿毛细支气管炎、流行性喘憋性肺炎的主要病毒 性抗原，同时RSV感染也会在老年人、患有慢性肺部疾病的成年个体以及免疫功能低下的成 人(例如骨髓移植病人)身上爆发。据世界卫生组织估计全球6400万呼吸道疾病中有16-100 万死亡病例是由RSV感染导致。
[0003] RSV疫苗的研制已有40多年的历史，历经灭活/重组疫苗、抗病毒复合物、反义药 物、RNA干扰技术、抗体药物(例如免疫球蛋白、静脉注射单克隆抗体)等阶段。在中国据最新 研究报道，复旦大学王宾教授领导的团队发明了新型免疫耐受疫苗技术，采用抗原加免疫 调节剂的方法，该方法克服了常规RSV疫苗引发肺部病理性炎症反应以及中和抗体效价低 的不足。国际上，分离自供体的静脉注射免疫球蛋白（RSV-IGIV;Re、piGanr)和一种单克隆 抗体palivizumab(SYNAGIS?)，已经获得批准用于高危儿童RSV的预防，尚无获批用于成人 的预防药物。目前也没有一种商业化的治疗RSV的疫苗，只有利巴韦林被批准用于RSV感染 的治疗。为了有效的预防和治疗RSV感染，在应用RSV-IGIV和pal i vizumab时，鉴于二者的低 特异性，往往需要高剂量、频繁注射，而且还需要考虑供体的可用性。因此，需要寻找其他的 预防和治疗RSV感染的药剂。
[0004] 众所周知，RSV有两个主要的表面糖蛋白，融合蛋白F和粘附蛋白G。成熟型G负责将 病毒颗粒结合到靶细胞上;F蛋白则介导病毒被膜与细胞融合和合胞体形成。根据RSV G蛋 白末端碱基的不同，RSV可以分为A和B两个亚型。在过去的十年里，RSV诱导的病理学机制研 究越来越关注于RSV的G蛋白上，并且支持该糖蛋白治疗靶点的呼声不断涌现。一些关于RSV 感染动物模型的病理学研究关乎G蛋白介导的减少适当的抗病毒细胞反应的免疫反应失 调，并且已经鉴定出RSV G蛋白含有一个特殊的重要的CX3C趋化因子模序。抗体能够与之结 合，有效的阻断该模序的功能，降低病毒复制和减缓动物罹病程度。尽管抗G蛋白抗体的预 防功效已经在小鼠、棉鼠中初步建立，但是近期的感染后治疗模型也显示在减缓RSV发病和 增强病毒清除能力上抗G抗体优于抗F抗体。
[0005] RSV代表了一个主要的公共卫生问题，尤其是影响6个月以下的儿童。现场及时诊 断这种高传染性病毒加上早期干预治疗可以基本上减少与呼吸道合胞病毒感染有关的急 性和长期病态。一种特别有前途的靶点就是RSV G蛋白。在啮齿动物模型，针对RSV G蛋白的 抗体在降低病毒载量和改善病毒引起的免疫功能低下两方面均已经取得显著效果。由于 RSV感染啮齿类动物的时间进程毕竟与人类不同，抗G单克隆抗体疗法的效用评估等待临床 试验。为了达到这个目的，结合RSV G蛋白关键的蛋白基的高亲和性人源抗体已有报道。临 床数据显示可能会在未来2-3年内用于这一类感染疾病的治疗。目前上市的抗RSV单克隆抗 体只批准用于预防早产儿感染RSV，是抗F蛋白的抗体，抗G蛋白抗体仍处于研发阶段。本发 明涉及全人源抗体，特别是全人源的抗呼吸道合胞病毒(RSV)G表面糖蛋白的单克隆抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供具有较高亲和力的抗RSV G蛋白的全人源单克隆抗体。
[0007] 根据本发明的一个方面，提供全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体RSVG71或RSVG78。单 克隆抗体RSVG71的重链、轻链(KAPPA)的核酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示， 其相应的重链、轻链(KAPPA)的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。单克隆 抗体RSVG78的重链、轻链(KAPPA)的核酸序列分别如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，其相 应的重链、轻链(KAPPA)的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。
[0008] 所述RSVG71或RSVG78抗体序列可以是全长DNA序列，也可以是其片段，所述片段包 括Fab、Fab '、F(ab '）2、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv等，优选的，所述抗体是全人源的。
[0009] 本发明还涉及所述抗RSV G全人源抗体的衍生物，包括通过对上述RSVG71或 RSVG78抗体的重链和/或轻链氨基酸序列的插入、取代和/或缺失形成的并具有相同功能的 抗体，涉及含有上述RSVG71或RSVG78的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗 体-因子融合蛋白、抗体_化学偶联物等，也应涉及全人源抗体的片段，所述片段为Fab、 Fab '、F(ab '）2、单链Fv (scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd '片段。本发明还涉及上述RSVG71或 RSVG78抗体的抗原结合片段，特别是选自上述片段的抗原结合片段。
[0010] 根据本发明的第二个方面，提供编码本发明的抗RSV G单克隆抗体或其抗原结合 片段的核酸序列。在优选的实施方案中，所述核酸序列包含SEQ ID NO: 1和/或SEQ ID N0:2 的序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸序列包含SEQ ID N0:5和/或SEQ ID N0:6的 序列。
[0011] 根据本发明的第三个方面，提供制备全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体的制备方法， 包括如下步骤：
[0012] (1)提供表达载体，所述表达载体含有编码本发明的全人源抗RSV G蛋白单克隆抗 体的DNA分子，含有表达RSV G蛋白的DNA序列，以及与所述DNA分子可操作相连的表达调控 序列；
[0013] (2)用所述表达载体转化宿主细胞；
[0014] (3)在适合所述全人源抗RSV G单克隆抗体表达的条件下培养所述宿主细胞；
[0015] (4)分离纯化获得所述的全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体。
[0016] 所述表达载体指本领域熟知的细菌质粒，优选的是重组表达载体，选自PCDNA3.1-Zeo( + )或者pHLXIOl中的一种或者多种的组合。
[0017] 所述宿主细胞可以是293T细胞系、293F细胞系、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、NS0、 SP2/0细胞系、HeLa细胞系、幼仓鼠肾(BHK)细胞系、猴肾细胞(COS)系、人肝癌细胞系、549A 细胞系、3T3细胞系、以及转化的B-细胞中的一种或多种组合。
[0018] 根据本发明的第五方面，提供本发明的全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体、核酸、载 体或宿主细胞在制备用于预防或治疗RSV相关疾病的治疗剂中的应用。
[0019] 根据本发明的第六方面，提供用于治疗RSV相关疾病的药物组合物，药物组合物中 包含治疗有效量的本发明的单克隆抗体、核酸、载体或宿主细胞，和一种或多种药学上可接 受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂是本领域技术人员熟知的，包括生理相 容的水性和非水性载体、稳定剂、防腐剂、增溶剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、缓冲 液、血清蛋白等。
[0020] 所述RSV相关疾病选自由病毒性肺炎、间质性肺炎、毛细支气管炎组成的组。
[0021] 根据本发明的第七方面，涉及本发明的全人源抗RSV G蛋白单克隆抗体、核酸、载 体或宿主细胞在制备用于检测RSV的检测试剂中的应用。
[0022] 本发明提供的抗RSV G蛋白单克隆抗体是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性） 的抗RSV抗体相比，因物种差异导致的免疫原性大大减少，且特异性好、亲和力高，如果用于 临床将大大降低副作用，而且抗G抗体在降低病毒载量和改善病毒引起的免疫功能低下较 抗F抗体更具有优势。此外，由于本发明中的单克隆抗体可以和RSV G抗原特异性结合，在 RSV的诊断和检测中也有很好的应用。应用于人时不会产生类似鼠抗体所产生的副作用。
【附图说明】
[0023] 图1是RSVG71和RSVG78蛋白纯化后的电泳图；
[0024] 图2是RSV G抗原纯化后的电泳图；
[0025]图3是ELISA实验检测单克隆抗体RSVG71和RSVG78与G抗原的结合力。
【具体实施方式】
[0026]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合【具体实施方式】并参 照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发 明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本 发明的概念。
[0027] 实施例1全人源抗RSV抗体RSVG71和RSVG78的制备 [0028] 1、人工合成RSVG71和RSVG78的重链和轻链
[0029] 按照序列如SEQ ID NO: 1所示的单克隆抗体RSVG71的重链、序列如SEQ ID NO: 2所 示的单克隆抗体RSVG71的轻链(KAPPA)的核酸序列；如SEQ ID NO: 3所示的单克隆抗体 RSVG78的重链、如SEQ ID N0:4所示的单克隆抗体RSVG78轻链(KAPPA)的核酸序列，送 GENEWIZ公司人工合成。
[0030] 将人工合成得到的RSVG71和RSVG78重链、轻链作为模板，分别加入Taq酶和dNTPs， 以及引物，进行PCR，得到PCR产物。
[0031] 2、重组抗体的表达载体的构建
[0032]利用快速DNA产物纯化试剂盒(购自康为世纪）回收PCR产物，得到40μ1 PCR产物待 用。
[0033] 分别对RSVG71和RSVG78的重链、轻链目的片段进行双酶切，双酶切体系为:NheI/ NotI各0·5μ1、10*FastDigest Green Reaction Buffer 3μ1 以及PCR产物26yl，37°C恒温 5h〇
[0034] 对载体进行双酶切，双酶切体系为:Nhel/Notl各0.5μ1、IO^FastDigest Green Reaction Buffer 3μ1、载体为pcDNA3· 1-Zeo( + )(Invitrogen公司）lug、用H2O补齐30μ1，37 °C恒温30min。然后加入2μ1碱性磷酸酶和3.5μ1 10补肚€奸(胍8)混匀，37°〇直温水浴211。
[0035] 上述目的片段和载体的双酶切体系中所使用的NheI、NotI、10*FastDigest Green Reaction buffer均贝勾自Thermo Scientific。
[0036]对将酶切后的RSVG71和RSVG78的重量、轻链目的片段分别进行I %琼脂糖凝胶电 泳，并通过紫外仪观察结果。用小刀将目的条带切下放入一个称量好重量的Ep管中，利用快 速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自康为世纪）回收各个目的片段。
[0037]将各个目的片段分别和载体进行连接，连接体系为：载体2μ1、目的片段15μ1、 T4DNA Ligase(购自NEB) ΙμL、缓冲液2μ1，混匀后16°C恒温水浴保持2h。
[0038]将每个目的片段的所有连接产物加入到E.coli DH5a感受态细胞中，轻轻混匀，冰 浴3〇11^11。42°(3热激90s后，迅速置于冰浴5min。然后加入800yL培养基，37°C振荡（100r/min) 温育lh。将培养菌液1000 Orpm离心15s，去除800ul上清，重悬沉淀，全部涂布于含氨苄青霉 素钠（l〇〇yg/mL)的LB固体培养基上，正向放入37°C培养箱中培养lh，再倒置培养过夜至菌 落清晰。挑取单菌落接种到5ml含氨苄青霉素钠(100yg/mL)的LB液体培养基中，37°C振荡培 养15h。利用高纯度质粒小提试剂盒(购自康为世纪)提取质粒，获得分别含有RSVG71的重链 (RH71)、RSVG71