专利名称：生物硅-粘附蛋白纳米复合材料合成和在牙科中的应用的制作方法
生物硅-粘附蛋白纳米复合材料合成和在牙科中的应用
背景技术：
硅石作为分子筛的组分、作为食品添加剂、载体、稳定剂(如在牙膏 中)以及作为半导体装置的绝缘体，广泛用于工业和医药中，如用于制造 玻璃、陶瓷、涂料、胶粘剂以及催化剂。硅石在纳米(生物)技术中也是重 要的材料。硅石的生产工艺大多要求高温条件以及极端的pH。值得注意 的是，某些单细胞或多细胞有机体，包括硅藻、多孔动物以及高等植物， 在周围低温、低压以及近中性pH条件下，能形成它们的硅石骨架。另外， 这些有机体骨架元件的产生是高保真性的且拷贝数巨大，因此，使得这 些有机体以及解释它们的目的骨架形成的机制可用于制造具独特特性的
新生物^圭(biosilicas)。
海洋和淡水多孔动物具有酶促合成硅石(生物硅)的独特能力。这种能 力使得多孔动物受到(纳米)生物技术的高度关注。迄今，用于生产硅石(玻 璃)的方法需要高温、高压以及侵蚀性化学制品的存在。多孔动物能在生 物学的以及环境无害的条件下高精确度和高重复性地通过酶(生物催化剂) 合成;圭纳米结构。
硅质多孔动物骨架的主要元件是针样骨针，其由寻常海绵纲 (Demospongia)和六放海绵纲(Hexactinellida)内的无定形非晶体珪石组成。
骨针形态和骨针生物起源的现有技术描述于Uriz et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:163-193; Miiller et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:195-221。多孔动物骨针的蛋白石硅石(opal sinica)含有6-13%的水， 对应于式(Si02)2 H20 (Schwab & Shore (1971) Nature 232:501-502)。寻常 海绵纲类生物骨针的形成开始于轴丝周围，硅石在轴丝的周围酶促沉积。
已经描述了在形成硅石的有机体中与Si02骨架的合成和/或降解有关 的两种酶以及它们的4支术应用。
第一种酶是存在于多孔动物骨针(针)轴丝中的Q!-硅酸盐蛋白(silicatein-a)(也称为A主酸盐蛋白)(PCT/US99/30601: Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spatially direct the polycondensation of silicon alkoxides， metal alkoxides, and their organic conjugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly(silicon/ metallo)oxane materials under environmentally benign conditions(在环境无害的条{牛下，用于催化和在空 间上指导硅醇盐(silicon alkoxides)、金属醇盐(metal alkoxides)和它们的有 机共扼物的缩聚以制备硅石、聚硅氧烷(polysiloxanes)、聚金属氧烷 (polymetallo-oxanes)以及混合的聚(硅/金属)氧烷材料的方法、组合物和 仿生催化剂，如硅酸盐蛋白和嵌段共聚多肽)。发明人/申请人Morse DE, Stucky GD， Deming， TD， Cha J, Shimizu K, Zhou Y; DE 10037270 A 1。 Silicatein-vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung.发明人/申i奮人Mtiller WEQ Lorenz B， Krasko A, Schr6der HC; European Patent No. 1320624(欧洲专利号1320624)。 Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof(硅酸盐蛋白介导的无定形硅酸盐和硅氧烷的合成及其用途)。发明 人/申i青人Mtiller WEQ Lorenz B， Krasko A， Schr6der HC;国家阶段 US2003134391;第20030407号；日本第2002-516336号；中国第1460110T 号；加拿大第2,414,602号；澳大利亚第2001289713号)。已经从海洋硅 质多孔动物寄居蟹皮海绵OS"Z^n'tes ^mw"cw/fl)克隆了这种酶(Krasko et al. (2000) Eur J Biochem 267:4878-4887)。硅酸盐蛋白能由有机硅化合物(烷 氧基硅烷)合成无定形石圭石(聚石圭酸和聚硅酸盐)(Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:361-365)。
除了 a-硅酸盐蛋白外，发明人从淡水多孔动物中还克隆了其他的硅 酸盐蛋白包括/5-硅酸盐蛋白(专利申请DE10352433.9. Enzym- und Template-gesteuerte Synthese von Silica aus nicht-organischen Siliciumverbindungen sowie Aminosilanen und Silazanen und Verwendung. 申请人:University of Mainz(美因兹大学)。发明人Schwertner H, Mtiller WEG, Schr6der HC)以及4种硅酸盐蛋白同种型(硅酸盐蛋白-al-4; DEI 02006001759.5.KontrollierteHerstellungvonSilber- undGold-Nanopartikeln und Nanokristallen definierter Gr6Be und Form durch chirale Induktion mittels Silicatein.申i貪人/发明人Tremel W, Tahir MN, Miiller WEG. Schr6der HC)。硅酸盐蛋白在与表面结合后保留了其催化活 性(Tahir et al. (2004) Chem Commun 2004:2848-2849)。
第二种酶是属于碳酸酐酶(carbonic anhydrase)群组的硅酶(silicase)(德 国专利第10246186号。In vitro and in vivo degradation or synthesis of silicon dioxide and silicones, usefUl e.g. for treating silicosis or to prepare prosthetic materials, using a new silicase enzyme (可用于利用i斤石圭酶治疗石圭 肺或制备修复术材料的二氧化硅和硅树脂的体外和体内降解或合成)。申 请人University of Mainz(美因兹大学)。发明人Miiller WEQ Krasko A， Schr6der HC; PCT/EP03/10983. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. 申请人: University of Mainz(美因兹大学)。发明人Mtiller WEQ Krasko A, Schr6der HC)。这种酶是在海洋多孔动物寄居蟹皮海绵中首次发现的，能在游离硅 酸形成的过程中溶解硅(Schr6der et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33:250-268)。另外，硅酶，在可逆反应中，也可介导多聚体的合成 (DE10352433.9. Enzymatische Synthese, Modifikation und Abbau von Silicium(IV)- und anderer Metall(IV)-Verbindungen. 申请人:University of Mainz(美因兹大学)。发明人Miiller WEQ Schwertner H， Schr6der HC)。 同硅酸盐蛋白一样，硅酶也受到纳米技术的关注，例如在医药和微电子 中用于硅基质的修饰。
硅石是用作组织工程骨和软骨中的包括生物活性玻璃和合成材料的 支架材料的重要成分(Hench and Wilson (1984) Science 226:630-636; Yamamuro et al. (1990) Handbook on Bioactive Ceramics, Vol I: Bioactive Glasses and Glass-Ceramics (生物活性制陶术手册第一巻生物活性玻璃 和玻璃制陶术)，CRC Press, Boca Raton, FL)。生物相容性和稳定性是决定 这些材料适用性的关^:特征，改进用于手术(如骨替换)和牙科的这些材料 的需求日益增加。多聚体硅和其他基于硅氧烷的材料的化学合成通常需 要剧烈的条件，如高温和高压，以及使用腐蚀性化学品，这可损害用作 合成材料的组分的有机分子。然而，硅质多孔动物在环境条件(低温和低
9压)下，利用硅酸盐蛋白的生物催化活性，能合成它们的硅骨架。
本发明人证明，当培养于用硅酸盐蛋白和I型胶原蛋白预包被并随后
利用硅酸盐蛋白底物TEOS通过用生物硅进行包被而受到修饰的培养平 板上时，人类骨肉瘤SaOS-2细胞的矿化(磷酸钙的形成)显著增加 (Schr6der et al. (2005) J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 75B:387-392; DE102004021229.5. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung bioaktiver, Osteoblasten-stimulierender Oberflachen und Verwendung. 申请 人University of Mainz(美因兹大学)。发明人Schwertner H, Miiller WEQ Schr6derHC)。这些结果表明，生物硅修饰的表面是生物活性的并可用于 提高成骨细胞的功能。
重组的石圭合成酶(silica-synthesizing enzyme)(石圭酸盐蛋白)的可用性为
段。本发明人也解决了以可持续的方式产生新的生物材料即多孔动物生 物义圭的才支术其是通过建立多孔动物细胞团培养物(primmorph culture，多 孔动物细胞培养的特殊形式；专利/专利申请DE19824384.7、 PCT/EP99/ 03121和EP99955288.8)而实现的。细胞团的硅石产生可通过某些添加剂 而i曾力口(EP05012162.3. Selenium-enriched liquid media for the cultivation of siliceous sponges and for biogenic silica production(用于培养石圭质多孑L动物 以及用于产生生物来源的硅的竭富集液体培养基)。申请人University of Mainz(美因兹大学)。发明人Mtiller WEQ Schr6der HC， Osinga R, Schwertner H》
粘附蛋白
已知粘附蛋白来自贻贝(贻贝粘附蛋白MAPs (mussel adhesive proteins),如足蛋白1和Mefp-l)。贻贝能经由由粘附蛋白组成的粘附斑 (adhesive plaques)将自身附着于金属、陶瓷以及玻璃的表面。这些粘附蛋 白含有高百分比的3，4-二羟苯丙氨酸(DOPA)。紫贻贝(M,7w e^/fc)的 Mefp-l具有序列为Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-DHP-Hyp-Thr-DOPA-Lys的串联 样重复的十肽(tandem-like repeating decapeptide)。对表面的粘附受邻苯二 酚氧(catechol oxygens)介导。粘附蛋白也存在于其他的海洋生物体中，如海参属(Holothuria)种类。 本发明人已经研究并首次描述了海参属Z/o/^Awn'a/orac幼'的顾维尔氏器 官(Cuvier organs)的生化粘附机制(Miiller et al. (1972) Cytobiologie 5:335; Mtiller et al. (1976) Biochim Biophys Acta 433:684);
图1 。另夕卜，本发明人 还证明，多孔动物也含有将一元酚(monophenols)转变为二元酚的酪氨酸 酶(Miiller et al. (2004) Micron 35:87)(图2)。
发明概述
本发明涉及合成无定形二氧化硅(硅石)、硅氧烷和这些化合物的修饰 物的方法、用于合成无定形二氧化硅(硅石)、硅氧烷和这些化合物的修饰 物的重组的；圭酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白(recombinant silicatein-silk fibroin fUsion proteins)的用途以及它们在牙科中的医药用途。
发明的详细描述
描述了含有硅酸盐蛋白(硅石形成序列)序列以及丝心蛋白序列的融 合蛋白以及编码此融合蛋白的cDNA。硅酸盐蛋白用于(生物)硅石的生物 催化形成，而生物硅可以单独地或作为纳米复合材料(nanocomposite)的组 分用作牙齿填充材料。丝心蛋白可用作粘附蛋白("水下胶粘 剂"("underwaterglue"))，将硅酸盐蛋白和由硅酸盐蛋白形成的硅石纳米颗 粒附着于牙齿的牙釉质或包括金属、塑料和复合材料的其他固体材料的 表面。几种类型和同种型的硅酸盐蛋白可用于构建融合蛋白，例如使用 PCR方法，分离自寄居蟹皮海绵的编码o:-硅酸盐蛋白多肽的cDNAs。相 关的cDNAs可分离自其他的海洋多孔动物，如GeoAa Q^om'wm,或分离 自淡水多孔动物，如繁茂膜海绵(Z^wm'raha 6a/ca/e"w》。融合蛋白，或 其部分，可与人类牙釉质来源的肽或含DOPA的肽/蛋白结合，因而可设 计基于硅石/肽的纳米复合材料。
本发明的另 一方面是用于体外或体内合成硅石(硅酸和/或硅酸盐的 浓缩产物)、硅氧烷和其他的金属氧化物以及这些化合物的混合多聚体的 方法，其中所用的融合蛋白含有显示了与SEQ ID NO.l所示的序列至少 25%的序列同源性优选同一性的a-硅酸盐蛋白结构域。对于合成而言，使用方法，其中诸如下列的化合物可以用作底物
硅酸，单烷氧基硅烷三元醇(monoalkoxysilanetriols)，单烷氧基硅烷二元 醇(monoalkoxysilanediols),单》克氧基石圭义克酉f"(monoalkoxysilanols)， 二步克氧 基石圭烷二元醇(dialkoxysilane-diols), 二烷氧基石圭烷醇(dialkoxysilanols)， 三烷氧基硅烷醇(trialkoxysilanols)，四烷氧基娃烷(tetraalkoxysilanes)，烷 基-、芳基-或金属-硅烷三元醇，烷基-、芳基-或金属-硅烷二元醇，烷基-、 芳基-或金属-硅烷醇，烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅烷二元醇，烷基-、 芳基-或金属-单烷氧基硅烷醇，烷基-、芳基-或金属-二烷氧基硅烷醇，烷 基-、芳-基或金属-三烷氧基硅烷。通过使用这些化合物的限定混合物， 可以制备混合的多聚物。
根据本发明另外优选的方面，通过将融合蛋白结合于其他分子或玻 璃、金属、金属氧化物、塑料、生物多聚体或其他的材料表面作为模板， 可形成限定的2维或三维结构。
根据本发明另外优选的方面，提供了修饰含有表面结构的羟基磷灰 石(实例牙釉质)、硅石或金属氧化物的方法，其中融合蛋白用于进行修 饰，其含有与SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示的序列具有至少25。/。的 序列同源性优选同一性的硅酸盐蛋白和/或丝心蛋白结构域。
含硅石结构或含硅石表面。
本发明另外优选的方面涉及根据SEQIDNO. 1的来自寄居蟹皮海绵 的a-硅酸盐蛋白或同源多肽的融合蛋白，所述同源多肽具有与SEQ ID NO.l所示的序列具至少25%的序列同源性优选同一性的的a-硅酸盐蛋白 结构域的氨基酸序列或其部分。
"同源性"定义为比对候选氨基酸序列和参考氨基酸序列即a-硅酸 盐蛋白结构域，如有必要，引入空位，以获得最大百分比同源性后，候 选氨基酸序列中与参考氨基酸残基即a-硅酸盐蛋白结构域中的残基相同 的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。可用 来或适合测定候选序列是否落入此定义内的一种计算机程序是由 Genentech Inc.创4乍的"Aling2"。
本发明另一优选的方面涉及核酸，特别是根据SEQ ID NO. 3以及
12SEQ ID NO. 4的核酸，其中，该核酸编码本专利申请所示的多肽。所述 核酸可以是DNA、 cDAN、 RNA或起混合物。核酸的序列含有至少一个 内含子和/或polyA序列。
本发明的另 一优选方面涉及(a)融合蛋白(嵌合蛋白)构建体(construct) 形式的核酸或(b)具有分别蛋白表达(蛋白酶切割位点)的构建体形式的核 酸。核酸也可以合成的方式产生。必要的方法是现有技术。
本发明另一优选的方面涉及载体，优选下列形式的载体质粒、穿 梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或颗 粒、纳米颗粒或脂质体，其中载体含有本发明的核酸。此外，这些载体 优选含有本发明融合蛋白的纳米颗粒或脂质体形式，可用于蛋白的转运。
本发明另 一优选方面是用本发明的载体转染宿主细胞或用本发明的 颗粒感染或转导宿主细胞。这种宿主细胞可表达权利要求1或7的多肽 或其部分。可以使用任何已知的宿主细胞有机体，诸如酵母、真菌、多 孔动物、细菌、CHO细胞或昆虫细胞。
本文请求保护的融合蛋白可以以合成的方式产生或存在于原核或真 核细胞或细胞提取物或裂解物中。细胞提取物或裂解物可以由来自体内 (ex Wvo)或来自体夕卜Ojc v"ra)的细胞如重组细菌细胞制备。
本文请求保护的融合蛋白可利用现有技术的方法进行纯化，因而基 本上不含其他的蛋白。
融合蛋白中的粘附蛋白可用于调控硅酸盐蛋白和生物硅构造区 (biosilica building blocks)只十表面的附着。
此外，本发明的融合蛋白或核酸也可用于调节硅和硅移植物的代谢 和再吸收。硅酸盐蛋白可以由单体硅前体合成多聚体硅，因此可用于移 除体细胞吸收的单体。最后，本文所述的本发明可应用于用本文所述的 核酸转染细胞，用于调节硅和硅移植物的代谢和再吸收。用于上文提到 的实际应用的方法是现有技术，可很容易地适应于具体的要求。
此外，已知含联苯酚的蛋白/肽，特别是含DOPA(3，4-dihydroxy phenylalanine， 3,4-二羟基苯丙氨酸)的蛋白/肽可作为水性环境中的胶粘 剂。本发明人克隆了多孔动物酪氨酸酶并表达了重组蛋白。这种酶利用 一元酚化合物合成联苯酚。通过利用重组多孔动物酶制备的含DOPA的蛋白和肽可用于在表面上结合硅酸盐蛋白/生物硅构造区。
经由特别修饰的含DOPA的蛋白和肽的粘附，可以在不同材料(金属、
玻璃、塑料等)的表面上通过用含DOPA的蛋白和肽进行包被产生图案。 可以使用金属(钬、钬合金或CoCr)表面和所选塑料和复合物材料的
表面两者。邻苯二酚氧特别是对Fe(in)和其他的离子具有强烈的亲和性，
因而其对含DOPA的肽和蛋白在表面上的结合很重要。
在骨和移植物(如由钛、钛合金或CoCr制成的金属移植物)之间产生
稳定的连接是主要的问题。金属移植物"生物组织化(biologisation)"的
一种方式是用含DOPA的蛋白和肽包被表面。
重纟且的石圭酸盐蛋白-丝心蛋白融4、蛋白的表达和《、离
重组的硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白的制备优选在大肠杆菌(E co/z〕 中进行。在酵母细胞和哺乳动物细胞中制备所述重组的蛋白也是可能的， 并且已经成功进行。将cDNA克隆至适宜的载体，如/;7h:历W-r(9尸0 (Invitrogen)。 在大肠杆菌转化后，通过 IPTG (isopropyl画/5-D-thiogalactopyranoside，异丙基画/3-D-碌b代半乳糖苷)诱导石圭 酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白的表达(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行实'验方案).John Wiley and Sons, New York)。可利用如存在于重组蛋白中的组氨酸标签，在适宜的亲 和性基质如Ni-NTA基质(Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519) 上，进行硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白的表达和重组蛋白的纯化。
使用两种可选构建体进行a-硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白的表达。
1.无蛋白酶切割位点的融合蛋白的制备
为了用a-硅酸盐蛋白多肽和丝心蛋白制备融合蛋白，使用适宜的表 达载体(如p7Vc/似2-:TOPO载体；Invitrogen)。制备在5'端和3'端两端都 具有例如7VcoI限制位点的a-硅酸盐蛋白cDNA。移除a-硅酸盐蛋白cDNA 中的终止密码子。使用PCR技术(PCR-Technik)且扩增所用的引物具有各 自的限制位点。因此制备编码第二蛋白的cDNA，借此在5'末端使用与a-^i酸盐蛋白cDNA的3'端相同的限制位点(在本实施例中为iVcoI)，且在3， 端，也有iVcoI限制位点。
14采用标准的步骤，连接两种cDNAs，将其纯化并与/ 7)r历W-rO尸(9 载体连接。靠近组氨酸标签进行连接。使用例如存在于重组蛋白中的组 氨酸标签的融合蛋白的表达和纯化，可利用适宜的亲和基质如Ni-NTA基 质(Skorokhod et al. (1997) Cell Mol Biol 43:509-519)进行。
2.分别表达(蛋白酶切割位点)
可选地，对于l中的步骤，在编码a-硅酸盐蛋白多肽的cDNA和编 码丝心蛋白的cDNA之间克隆蛋白酶切割位点(如肠激酶位点)。在表达和 纯化后，以蛋白水解的方式切割融合蛋白。随后分离两种蛋白。
在下面的实施例中描述了含有来自寄居蟹皮海绵的a-硅酸盐蛋白基 因和来自地中海贻贝(M;;"/ms ga〃o/ rav/"c^fo)的丝心蛋白基因的融合蛋 白在大肠杆菌中的表达。在这个实施例中，使用仅含有催化活性结构域 的硅酸盐蛋白插入片段(短硅酸盐蛋白形式)；使用含有该蛋白的完整氨基 酸序列的插入片段也是可能的。
用于构建编码融合蛋白的cDNAs的硅酸盐蛋白cDNAs已有描述。
编码来自寄居蟹皮海绵的a-硅酸盐蛋白和/3-硅酸盐蛋白的cDNAs 是，a-硅酸盐蛋白AJ272013 (Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267:4878-4887); /3-硅酸盐蛋白AJ547635和AJ784227 (Schr6der et al. (2004) Cell Tissue Res 316:271-280)。编码a-硅酸盐蛋白的寄居蟹皮海绵 cDNA的核苷S臾序列，显示于图3中。编码a-硅酸盐蛋白的寄居蟹皮海 绵cDNA的推导的氨基酸序列，显示于图4中。
编码来自繁茂膜海绵的硅酸盐蛋白al-4的cDNA是a硅酸盐蛋白 AJ872183;石圭酸盐蛋白a2: AJ968945;硅酸盐蛋白a3: AJ968946;硅酸盐 蛋白a4: AJ968947 (Wiens et al. (2006) Dev Genes Evol 216:229-242)。
编码前胶原蛋白D的地中海贻贝cDNA的核苷酸序列显示于图5中。 编码前胶原蛋白D的地中海贻贝cDNA的推导的核香酸序列显示于图6 中。
编码丝心蛋白的地中海贻贝cDNA的核苷S吏序列和推导的氨基S吏序 列，显示于图7和图8中。
载体； 7>r/fe2-rOPO (Invitrogen)用于产生融合蛋白；； 7h:州W-:rO尸0 的核苷酸序列，请参考图9。其他的表达载体也已证明是合适的。使用限制酶iVcol (C山CATGG)。这种限制酶 在丝心蛋白cDNA上无限制位点 在a-石圭酸盐蛋白cDNA上无限制位点 在one restriction site inp7h://^2载体上有一个卩艮制^f立点。 含有用Wcol消化的突出端(overhangs)的下列引物用于硅酸盐蛋白 cDNA:
iSV/zTVoc—For/
CCA TGG TTC TTG TCA CAG TGG TAG TAC TG (SEQ ID No. 10)。
在第一步中，使用下列特异性引物，从; w-0)/Z) cDNA中分离编码 丝心蛋白的序列 皿F
5' GGT GGA CTC GGA GGA GC 3、 (SEQ ID No. 12)。
5、 ATA TCC TGG TTT GTG ATA GC 3、 (SEQ ID No. 13)。 随后将丝心蛋白cDNA克隆(T/A克隆)至栽体； 7Vc/^^-rOPO
(Invitrogen)。随后用所得的质粒转染细菌菌4朱BL121 。
对于a-硅酸盐蛋白序列，构建含有突出端的下述的反向引物，以便
用这种突出端作为蛋白酶(肠激酶)结合位点
5, ATC GTC ATC TAG GGT GGG ATA AG 3' (SEQ ID No.
14) 。
在下一步骤中，构建含有突出端的下列引物 础TVoc一For/
5、 CCA TGG TTC TTG TCA CAG TGG TAG TAC TG 3、 (SEQ ID No.
15) 。
5、 CCA TGG ACT TGT CAT CGT CAT CTA GG 3、 (SEQ ID No. 16)。 这些突出端用来作为限制酶TVcoI的限制位点。p7h^fo2载体也具有这种限制酶的限制位点。这允许用载体和扩增的硅酸盐蛋白进行双消化。 所述消化后，将硅酸盐蛋白克隆至丝心蛋白的前方。
用于从丝心蛋白中切割硅酸盐蛋白的蛋白酶结合位点(肠激酶识别位 点)显示于图10中。
在用A^coI消化后，将具有蛋白酶结合位点的硅酸盐蛋白cDNA克隆 至丝心蛋白cDNA前方的； 7 ci^2载体(图11)。
大肠杆菌转化后，通常用IPTG诱导硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白 的表达，并在37。C进行4或6小时(Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行实验方案).John Wiley and Sons, New York)。例如在Ni-NTA基质上通过亲和层析，纯化所得的融合蛋白。 为了从丝心蛋白中分离硅酸盐蛋白，用肠激酶切割融合蛋白。随后在2-巯基乙醇存在的情况下，将该蛋白进行凝胶电泳。凝胶电泳可在具有0.1% NaDodS04的10%聚丙烯酰胺凝胶中进行(聚丙烯酰胺凝胶电泳， polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE)。用考马斯亮兰染色凝月交。切割、 纯化合和随后的PAGE后，获得短形式的重组硅酸盐蛋白和丝心蛋白。
使用抗体分离和纯化硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白 可在亲和性基质上进一步纯化a-硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白。亲 和性基质可例如通过将a-硅酸盐蛋白特异性抗体固定于固相(CNBr-激活 的琼脂糖或其他适宜的载体)来制备。可使用针对a-硅酸盐蛋白的单克隆 抗体或多克隆抗体，其采用标准的方法(Osterman (1984) Methods of Protein and Nucleic Acid Research Vol. 2 (蛋白和核酸研究的方法第二巻); Springer-Verlag [Berlin])制备。根据制造商(Pharmacia)的使用说明书，将 抗体与基质偶联。通过pH变化或离子强度变化，进行纯a-硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白的洗脱。
也可以使用其他的亲和性基质。
硅酸盐蛋白活性和硅石合成的检测
为了测定重组硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白的酶活性，进行测定实 验，该测定基于水解以及随后的四乙氧基硅烷(TEOS)的聚合后测量聚合通常如下进行重组硅酸盐蛋白的酶活性的测量。将融合蛋白用适合酶促反应的緩冲液如pH 6.8的50 mM MOPS [pH变动范围为4.5到10.5 的其他缓冲液，也是合适的]透析过夜。将融合蛋白(1-50吗)溶解于lml的适宜緩冲液，诸如补充了 1 ml 1-4.5 mM TEOS溶液的50 mM MOPS (pH 6.8)。酶促反应可在室温下进 行。60分钟孵育后，通常每100 pg硅酸盐蛋白合成200nmol无定形硅石。 通过离心(12 000xg; 15分钟；十4。C)收集硅石产物，用乙醇洗涤并空气 千燥。随后将沉淀溶解于1 M NaOH中。使用基于钼酸盐的测定如硅测 定(Merck),定量测定溶解的硅酸盐。可以使用下述底物四烷氧基硅烷，三烷氧基硅烷醇 (trialkoxysilanols)， 二烷氧基硅烷二元醇(dialkoxysilanediols)，单坑氧基珪 》克三元酉享(monoalkoxysilanetriols)， 二》克氧基石圭》克酉孚(dialkoxysilanols)， 单 烷氧基硅烷二元醇(monoalkoxysilanediols)， 单烷氧基硅烷醇 (monoalkoxysilanols)，烷基-、芳基-或金属-三烷氧基硅烷，烷基-、芳基 -或金属-硅烷醇，烷基-、芳基-或金属-硅烷二元醇，烷基-、芳基-或金 属-硅烷三元醇，烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅烷二元醇，烷基-、芳 基-或金属-二烷氧基硅烷醇，或其他的金属氧化物前体(镓、锆或钛的烷 氧基化合物)。因此，可以产生混合的多聚体。反应可在温和的条件下进行。因此，本发明介绍了节省能量、环境 友好的方法。使用硅石而不是羟磷灰石(其是真正的再生)的另 一个原因是，因为硅 石更抗酸，而羟》寿灰石和"天然，，牙釉质一样是龋#文感的。硅酸盐蛋白-粘附蛋白融合蛋白的结合硅酸盐蛋白丝心蛋白融合蛋白和由硅酸盐蛋白产生的(生物)硅石可 以与下列物质结合使用a)人牙釉质来源的肽。这些肽允许设计基于硅石/肽的纳米复合材 料。它们是生物相容的，无需滤去潜在地引起副作用的树脂单体或添加 剂。18b)含DOPA的多肽/蛋白。使用多孔动物酪氨酸酶，可制备这些多肽 /蛋白。它们用作硅酸盐蛋白/生物硅表面结合的胶粘剂(生物)硅石与牙釉质来源的肽/蛋白的结合使用来自牙釉质的肽的理由是因为它们在牙釉质中递送内聚力，并 将在硅石复合材料中产生最佳的可能的粘合，以及产生基于硅石的纳米复合材料向龋齿引起的龋洞的牙釉质边缘粘附。在树脂胶(resin adhesives) 的下侧，它们是"能感知水的"并倾向于水解降解。(生物)硅石与含DOPA的蛋白和肽的结合从海洋多孔动物中克隆的重组酪氨酸酶(Mtiller et al. (2004) Micron 35:87)用于合成含有3,4-二羟基苯基丙氨酸(DOPA)单位的粘附多肽或蛋 白。采用所述的方法(Marumo and M&ite (1986) Biochim Biophys Acta 872:98; Akemi Ooka and Garrell (2000) Biopolymers 57:92)，进行所用的含 酪氨酸蛋白和肽的酶促羟基化作用。由于酪氨酸酶介导的酪氨酸羟基化 后形成的DOPA到其它产物特别是多巴醌的氧化，在蛋白或肽中的酪氨 酸残基到DOPA的酶促羟基化作用可能存在一个问题。多巴醌能与赖氨 酸残基形成交联。为了减少来自DOPA的氧化产物的形成，在羟基化过 程中加入抗坏血酸；抗坏血酸将形成的多巴醌和其他氧化产物还原为邻 苯二酚。在低分子量肽羟基化过程中，通过离心/过滤(微孔过滤膜)除去 酶。通过反相HPLC，将抗坏血酸从产物中分离。使用"GST融合"系统("GST Fusions" system, Amersham)制备重组多 孔动物酪氨酸酶。所得的GST融合蛋白通过在谷胱甘肽-琼脂糖4B上的 亲和层析来纯化。为了从重组多孔动物酶中分离谷胱甘肽-S-转移酶，用 凝血酶切割融合蛋白。使用作为L-酪氨酸底物，在磷酸盐緩冲液中进行 酪氨酸酶酶促活性的测定。在280nm处，测量转化为L-DOPA(3，4-二羟 基苯基丙氨酸)的酪氨酸。也可以使用重组的多孔动物酪氨酸酶《奮饰,圭酸盐蛋白，该酶将一元 酚(如酪氨酸残基)转化联苯酚。所得的胶粘剂蛋白可用于连接由生物硅(由硅酸盐蛋白合成)制成的形成高阶结构(higher-ordered structures)的构造区。 ce-硅酸盐蛋白丝心蛋白融合蛋白的应用本发明的另外方面是oc-硅酸盐蛋白丝心蛋白融合蛋白的下列应用。1. )牙齿材料表面修饰的应用(与目前所用的材料相比，改进生物相 容性、更高的稳定性和更高的多孔性)。2. )制备新牙齿材料(复合材料)的应用，如牙齿替换材料。3. )制备用于由金属、金属氧化物、塑料和其他材料制成的牙齿材料 的包被的应用；特别是制备这些材料上的单分子层(生物组织化；在骨和 牙齿材料间形成稳定连接)。4. )融合蛋白中存在的粘附蛋白("水下胶粘剂")将硅酸盐蛋白和生 物硅构造区(由硅酸盐合成的生物硅颗粒)粘附于表面(金属、玻璃等)以连 接形成高阶结构的生物硅构造区的用途。5. )生物硅作为牙科中填充颗粒(filler particles)的用途。与常规材料相 比，生物硅具有两种优势1.其合成是环境友好的，因为它利用重组酶^圭 酸盐蛋白)或生物反应器(细胞团)酶促产生的。2.用硅酶，可实现表面修_ 饰，不需要高能或侵蚀性化学品。以下是图例说明和序列方案图1.海参属生化粘附机制的首次描述。左两种顾维尔氏管(Cuvier tubuli)。 A, 内圆筒(inner cylinder); B，夕卜圆筒(outer cylinder)。右附着 于石蜡的顾维尔氏管(Mtiller and Zahn (1972) Cytobiologie 3: 335-351)。图2.通过多孔动物酪氨酸酶将一元酚向联苯酚的转化(以及进一步 向醌的氧化)。图3.编码a-硅酸盐蛋白的寄居蟹皮海绵cDNA的核苷Sl^列。用于 构建引物的序列加了下划线并以粗体标记。ATG起始密码子加有双下划 线(SEQ ID No,5)。图4.编码a-硅酸盐蛋白的寄居蟹皮海绵cDNA的推导的氨基酸序列。图5.编码前胶原蛋白D的地中海贻贝cDNA的核苷酸序列。用于构20建引物的序列加有下划线并以粗体标记(SEQ ID No. 6)。图6.编码前胶原蛋白D的地中海贻贝cDNA的推导的氨基酸序列 (SEQ ID No. 7)。图7.编码丝心蛋白的地中海贻贝cDNA的推导的氨基酸序列(SEQ ID No. 8)。图8.编码丝心蛋白的地中海贻贝cDNA的核苷酸序列和推导的氨基 酸序列。用于构建正向引物和反相引物的序列加了下划线并以粗体标记 (SEQ ID No. 9)。图9.载体；77)r/^2-r(9尸(9(Invitrogen)的核香酸序列。图10.用于通过肠激酶从丝心蛋白切割硅酸盐蛋白的蛋白酶结合位 点(肠激酶识别位点)。图11.用Wco/消化后，将具有蛋白酶结合位点的硅酸盐蛋白基因克 隆至丝心蛋白cDNA前方的； 7 c//^2载体。SEQ ID No. 1:来自寄居蟹皮海绵的a-硅酸盐蛋白多肽的氨基酸序列 (rSILICAa—SUBDO)，SEQ ID No. 2:来自地中海贻贝丝心蛋白多肽的氨基酸序列 (rSILKFIB—MYTGA),SEQ ID No. 3:编码来自寄居蟹皮海绵的a-硅酸盐蛋白多肽的cDNA 的核酸序列。SEQ ID No. 4:编码来自地中海贻贝的丝心蛋白的cDNA的核酸序列。
权利要求
1. 融合蛋白，其含有硅石形成酶和粘附蛋白。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其含有介于所述硅酸盐蛋白形 成酶和所述粘附蛋白之间的蛋白酶切割位点。
3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述硅石形成酶是硅酸盐 蛋白。
4. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述硅石形成酶是Q!-硅酸 盐蛋白。
5. 如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述粘附蛋白是丝心蛋白。
6. 如权利要求3、 4或5中任一项所述的融合蛋白，其含有介于Sf X去处容紘4n 6fr ;A :i't 疋■> lVTI AA 电l V^r上 /, i "^"-^'「j" h入_nu a h , 乂 ,1〃 j j^《u ,i j H , —J w 'j w ' j工,r;、。
7. 如权利要求2、 3、 4、 5或6中任一项所述的融合蛋白，其中 所述蛋白酶切割位点是肠激酶切割位点。
8. cDNA，其编码权利要求1-7中4壬一项所述的融合蛋白。
9. 合成权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白的方法。
10. 纳米复合材料，其含有权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白。
11. 纳米复合材料，其含有权利要求1-7中任一项所述的化合物以 及适宜的添加剂和补充剂。
12. 如权利要求10或11所述的纳米复合材料，其中一种或几种组分以储存化合物的形式或作为前体与适宜稀释液或载体物质共存。
13. 如权利要求10-12中任一项所述的纳米复合材料，其中这种 复合物具有其他的生物学活性，即与其他的化合物正相互作用并调节 磷酸钙(羟基磷灰石)沉淀、牙釉质细胞更新以及显示抗菌活性。
14. 使用这些融合蛋白和纳米复合材料，体外或非人类体内合成 二氧化硅(硅酸或硅酸盐的浓缩产物；也称为硅石)、硅和包括钛氧化 物(二氧化钬)、4告氧化物(氧化锆)、氧化4夹和4凡氧化物的其他金属氧4匕 物以及混合的多聚体的方法。
15. 使用这些融合蛋白和纳米复合材料，体外或非人类体内合成 二氧化硅(硅酸或硅酸盐的浓缩产物；也称为硅石)、硅和包括钛氧化 物(二氧化钛)、锆氧化物(氧化锆)、氧化铁和钒氧化物的其他金属氧化 物以及混合的多聚体的方法。
16. 体外或非人类体内合成二氧化硅(硅酸或硅酸盐的浓缩产物； 也称为硅石)、硅和包括钛氧化物(二氧化钛)、锆氧化物(氧化锆)、氧 化铁和钒氧化物的其他金属氧化物以及混合的多聚体的方法，其中所 用的融合蛋白含有粘附蛋白结构域，所述粘附蛋白结构域显示了与 SEQ ID NO. 1所示的序列的至少25%的序列相似性。
17.体外或体内合成二氧化硅(硅酸或硅酸盐的浓缩产物；也称为 硅石)、硅和包括钛氧化物(二氧化钛)、锆氧化物(氧化锆)、氧化铁和 钒氧化物的其他金属氧化物以及混合的多聚体的方法，其中所用的融 合蛋白含有硅酸盐蛋白结构域，所述硅酸盐蛋白结构域显示了与SEQ ID NO. 1所示的序列的至少25%的序列相似性。17. 如权利要求14-16所述的方法，其中，硅酸，硅酸盐，单烷 氧基硅烷三元醇，单烷氧基硅烷二元醇，单烷氧基硅烷醇，二烷氧基 硅烷二元醇，二烷氧基硅烷醇，三烷氧基硅烷醇，四烷氧基硅烷醇， 烷基-、芳基-或金属-硅烷三元醇，烷基-、芳基-或金属-硅烷二元醇， 烷基-、芳基-或金属-硅烷醇，烷基-、芳基-或金属-烷氧基硅烷二元醇， 烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅烷醇，烷基-、芳基-或金属-二烷氧基 硅烷醇，烷基-、芳基-或金属-三烷氧基硅烷或其他金属氧化物前体化 合物，用作合成的底物。
18. 如权利要求17所述的方法，其中限定复合物的混合的多聚体 是使用所述化合物的限定的混合物产生的。
19. 如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中通过融合蛋白 在用作模板的玻璃、金属、金属氧化物、塑料、生物多聚体或其他的 材料上的表面结合，产生限定的2维或3维空间结构。
20. 使用重组的多孔动物酪暴.酸酶制备含DOPA的蛋白和肽的方法。
21. 使用含DOPA的多肽，将硅酸盐蛋白/生物硅构造区结合于表 面(金属表面、塑料表面或复合材料的表面)的方法。
22. 牙齿填充材料，其通过利用上述权利要求所述方法获得。
23. 如权利要求8所述的核酸，其为(a)融合蛋白(嵌合蛋白)构建体 的形式或(b)具有分别蛋白表达(蛋白酶切割位点)的构建体的形式。
24. 如权利要求23所述的核酸，其中所述核酸是DNA、 cDNA、 RNA或其混合物。
25. 如权利要求8、 23或24中任一项所述的核酸，其中所述核酸 的序列含有至少 一个内含子和/或poly A序列。
26. 如权利要求8和权利要求23-25中任一项所述的核酸，其中 所述核酸是以合成的方式产生的。
27. 载体，其优选为下列形式质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、 表达载体、反转录病毒载体、腺病毒载体或颗粒、纳米颗粒或脂质体， 所述载体含有权利要求8和权利要求23-25中任一项所述的核酸。
28. 载体，其优选为纳米颗粒或脂质体形式，含有权利要求1-7 中任一项所述的多肽。
29. 宿主细胞，其用权利要求8和权利要求23-28中任一项所述 的载体转染或用权利要求8和权利要求23-28中任一项所述的颗粒感 染或转导。
30. 如权利要求29所述的宿主细胞，其中权利要求1-7所述的多 肽或其部分得以表达。
31. 如权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述多肽是以合 成的方式产生的。
32. 如权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述多肽存在于 原核或真核细胞提取物或裂解物中。
33. 如权利要求1-7中任一项所述的多肽，其中所述多肽得到纯 化且基本上不含其他蛋白。
34. 上述权利要求所述的多肽、核酸或纳米复合材料用于调节硅移植物中硅和硅单体的再吸收的用途。
35. 上述权利要求所述的核酸用于转染细胞以调节硅移植物中硅 和珪单体的再吸收的用途。
36. 由硅酸盐蛋白酶促产生的硅石或其他金属氧化物和粘附蛋白作为金属、金属氧化物、塑料和其他材料的包被的用途，特别是在这 些材料上产生单分子层的用途。
37. 硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白与生物相容的人类牙釉质来 源的肽/蛋白的结合物(基于硅石/肽的纳米复合材料)的用途。
38. 硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白与含DOPA的蛋白和肽的结合 物的用途。
39. 使用硅酸盐蛋白产生的(生物)硅石作为牙科的填充颗粒的用途。
全文摘要
本发明涉及牙科的硅酸盐蛋白-丝心蛋白融合蛋白合成用作填充材料的含硅的纳米复合材料的用途。
文档编号C12N15/62GK101506365SQ200780031255
公开日2009年8月12日 申请日期2007年8月21日 优先权日2006年8月23日
发明者海因茨·C.·施罗德, 维尔讷·E·G·米勒, 维尔讷·K·戈特森 申请人:海洋纳米技术有限公司