一种融合蛋白sacp、编码基因、工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白类生物高分子融合（SACP)及其应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 近年来多种性能优异的生物来源多肽、长肽和蛋白质被研究人员所发现。硅沉积 肽、钙结合肽段、壳聚糖结合肽段、蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝粘蛋白、节肢动物弹性蛋白以及贝壳 粘附蛋白等大量性能优异的新型蛋白类材料受到材料学研究的重视。由于化学合成法的限 制，当前蛋白类生物材料研究，多采用先合成小肽，而后通过小肽多级自组装形成较大药物 负载复合体的研究思路。基因工程法是进行蛋白质外源表达的常用方法，其所产目标蛋白 为单一长度产物，不存在化学合成所带来的副产物，且产物长度可达到数千氨基酸残基，合 成能力远超化学合成，同时生产成本也远低于化学合成。因此采用基因工程法制备蛋白类 生物材料的最佳选择，当前相关研究还较少。
[0003] 本发明选取具有pH响应自组装性能的蜘蛛丝蛋白氮端序列（Nt)，具有高弹性能 的果蝇弹性蛋白（Res)部分序列和具有高粘附性能的贻贝黏附蛋白（Ma)部分序列为目标 功能肽段，借助基因融合技术，形成由蜘蛛丝蛋白氮端序列（Ntl)、果蝇弹性蛋白（Resl)、 贻贝粘附蛋白（Mal)、果蝇弹性蛋白（Res2)、贻贝粘附蛋白（Ma2)、果蝇弹性蛋白（Res3)和 蜘蛛丝蛋白氮端序列（Nt2)等7个嵌段顺次连接构成的新型生物高分子SACP，其长度为 964个氨基酸残基。SACP为人工将3个远源物种（蜘蛛、果蝇和贻贝）来源的功能肽段融 合形成的全新生物高分子。由于自然生殖隔离的存在，没有理论支持本发明SACP蛋白可能 存在于任何已知生物体中的可能性。该7嵌段SACP具有优异的粘附性能、弹性和pH响应 自组装性能，可体外形成形式多样的生物医用材料，在诸多生物医用领域，尤其是医学缝合 和伤口外敷方面具有突出的应用潜力，在生物医药领域具有广阔的应用前景。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种性能优异的生物医用高分子，具体为蛋白类生物高分 子-融合蛋白（SACP)，以及其在制备医学缝合和伤口外敷药物中的应用。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种融合蛋白SACP，所述融合蛋白SACP为人工设计制备的跨物种融 合蛋白，来源物种为蜘蛛、果蝇和贻贝，具体本发明所述SACP蛋白是由蜘蛛丝蛋白氮端序 列（Ntl)、果蝇弹性蛋白（Resl)、贻贝粘附蛋白（Mal)、果蝇弹性蛋白（Res2)、贻贝粘附蛋白 (Ma2)、果蝇弹性蛋白（Res3)和蜘蛛丝蛋白氮端序列（Nt2)共7个嵌段顺次连接构成，长度 为964个氨基酸残基，所述SACP蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 本发明由于蜘蛛、果蝇和贻贝间存在自然条件下不可能逾越的生殖隔离，因此没 有理论依据支持可能存在天然的本发明所述融合蛋白SACP。
[0008] 本发明还提供一种所述融合蛋白SACP的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列 为SEQ ID N0. 2所示。所述融合蛋白SACP的编码基因序列为非天然基因序列，是经过密码 子改造并由人工合成的全新基因序列。由于构成融合蛋白SACP的7个天然肽段存在大量 大肠杆菌稀有密码子，且具有较高的甘氨酸和丙氨酸比例，不适合直接在大肠杆菌中表达。 因此，本发明对融合蛋白SACP的基因密码子进行了优化，移除了所有稀有密码子，并对甘 氨酸和丙氨酸密码子进行了均衡分配，最后通过全基因合成法获得新型人造蛋白类高分子 融合蛋白SACP的基因。同样由于生殖隔离的存在，没有理论依据支持可能存在天然的本发 明所述编码SACP的基因。
[0009] 本发明涉及一种由所述编码基因构建的重组载体，所述融合蛋白SACP表达载体 的构建方法为：将SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列插入质粒PUC57的EcoRV位点，表达元件为 Lac启动子、Lac操纵子、Lac核糖体结合位点（RBS)和T7终止子，全表达框长度为3182bp， 对应的核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示。
[0010] 本发明涉及一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，所述重组基因工程 菌的构建方法为：将SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列导入宿主菌内（优选大肠杆菌DH5 a菌 株），经表达纯化，获得重组基因工程菌。
[0011] 本发明所述融合蛋白SACP的制备方法为：将含融合蛋白SACP基因的重组基因 工程菌接种至自诱导培养基，培养温度为16~40°C，培养时间为12~24h，将培养液离 心，收集菌体，并重悬于细胞破碎缓冲溶液（50mM磷酸二氢钠，100mM氯化钠，pH5. 5,溶剂 为去离子水）中，超声破碎（130W的功率，超声4s，停歇6s的工作方式，超声破碎30min)， 然后再次离心，收集上清液，最后将上清液过阳离子柱并以含终浓度0. 5~3. 0M尿素和 300~lOOOrnM氯化钠的细胞破碎缓冲液为洗脱剂进行梯度洗脱，经目标洗脱峰粘附试验收 集SACP洗出液，经透析（优选排阻分子量为14kDa的透析袋）和冷冻干燥，获得融合蛋白 SACP ;自诱导培养基配方为：酵母抽提物2. 0~6. 0g/L，胰蛋白胨5. 0~10. 0g/L，酪蛋白胨 5. 0~10. 0g/L，葡萄糖0? 1~2. 0g/L，磷酸氢二钾4. 0~8. 0g/L，磷酸二氢钾3. 0~9. 0g/ L，磷酸铵2. 0~5. 0g/L，硫酸镁0? 2~1. 5g/L，氯化钙2. 0~6. 0mg/L，氯化钴0? 5~4. Omg/ L，氯化铜0? 5~2. 0mg/L，硫酸猛1. 0~8. 0mg/L，钼酸钠3. 0~7. 0mg/L，硼酸0? 1~0? 6mg/ L，氯化铁1. 0~7. 0mg/L，氯化锌0? 5~2. 5mg/L，甘油1. 0~10. 0g/L，丝氨酸0? 5~2. 0g/ L，甘氨酸2. 0~8. 0g/L，丙基硫代-0 -D-半乳糖苷24-320mg/L，溶剂为去离子水，pH7. 0。 目标洗脱峰粘附试验做法为：取洗脱峰流出液20 y L与20 y L浓度为1M，pH为7. 5的Tris 溶液混合均匀，并滴于载玻片表面，于25°C下密封保湿孵育12h，然后以蒸馏水冲洗5次，并 以考马斯亮兰染液进行染色，着染蓝色的洗脱峰样品即为SACP目标洗脱峰。
[0012] 本发明还提供一种所述融合蛋白SACP在制备伤口敷料药物中的应用，具体所述 的伤口敷料药物为：将融合蛋白SACP、壳聚糖和甘油共混，溶解于体积浓度为2%的醋酸水 溶液中，将混合溶液倒于圆皿中（优选将20mL混合溶液倒于直径90mm的圆皿中），干燥（优 选60°C下烘干）制成薄膜，获得伤口敷料药物；将该薄膜以碘酒浸润后覆盖于伤口表面，并 进行固定后即可实现伤口包扎；所述融合蛋白SACP与壳聚糖、甘油质量比为1 :0. 25~4 : 0? 25 ~1，优选 1 :1 :0? 5。
[0013] 本发明所述融合蛋白SACP具有光催化交联、尚弹、pH响应自组装和未水尚粘特 性，在钌和可见光催化下可形成分子内和分子间酪氨酸二聚体交联；融合蛋白SACP交联体 具有高弹性能，弹性伸长可达到300%以上；融合蛋白SACP在pH6. 7~8. 0间能够发生自 组装，自组装胶体包括顺式有序胶体、单分子环、多分子环和混合组装胶体。
[0014] 本发明所有的百分比含量，没有特备指明，都属于质量百分比含量。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0016] 本发明新型生物高分子-融合蛋白SACP，集成了蜘蛛丝蛋白的自组装性能、果蝇 弹性蛋白高弹性能和贻贝粘附蛋白的高粘性能，综合性能优异，且长度均一，可完全生物降 解，微生物法制备产量高、不存在化工污染。以融合蛋白SACP制成的伤口敷料药物能够高 效粘附皮肤和伤口，同时具备优良延展性，在伤口包扎方面应用性能突出。 (四）
【附图说明】
[0017] 图1生物高分子融合蛋白SACP的结构示意图，Ntl-蜘蛛丝蛋白氮端序列， Resl-果蝇弹性蛋白，Mai-贻贝粘附蛋白，Res2_果蝇弹性蛋白，Ma2_贻贝粘附蛋白， Res3-果蝇弹性蛋白，Nt2-蜘蛛丝蛋白氮端序列。
[0018] 图2生物高分子融合蛋白SACP组装交联结构示意图。
[0019] 图3为质粒PUC57图谱。