一种提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法及应用与流程

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法及应用。

背景技术：

为了应对日益严重的能源危机，作为生物燃料的乙醇成为替代石油燃料的选择之一。由于异养发酵转化产生乙醇需要粮食农作物作为燃料，乙醇需求的增加会加剧粮食短缺问题。而利用可以进行光合作用的蓝藻作为生物反应器将CO₂转化成乙醇，是解决此问题的重要方案之一。集胞藻PCC6803易于进行转基因操作，是进行该研究良好的基因工程菌。例如将Zymomonas mobilis中的丙酮酸脱羧酶(pdc)基因和乙醇脱氢酶II(adh)基因导入集胞藻PCC6803中，并以psbAII启动子驱动这两个基因表达，可以使集胞藻PCC6803产生低浓度的乙醇。

但是目前转基因集胞藻PCC6803产生的乙醇含量还不能满足乙醇工业化生产的要求，其中的一个关键因素就是集胞藻PCC6803对乙醇的耐受能力差。在含有1.5％(v/v)乙醇的培养基中，集胞藻PCC6803细胞会发生聚集，生长速率降低50％以上。因此，研究提高集胞藻PCC6803耐受乙醇能力的方法对于利用光合作用工业化生产乙醇具有重要意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法。应用该方法得到了对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，该藻株可用于构建生产燃料乙醇的基因工程菌。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种提高集胞藻PCC6803乙醇耐受能力的方法，包括如下步骤：

(1)以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增得到sll0687基因上游序列sigI-up，如序列表中SEQ ID NO：7所示；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 为上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增得到sll0687基因下游序列sigI-down，如SEQ ID NO：8所示；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为上、下游引物，以pET-30b质粒为模板，通过PCR扩增得到包含卡那霉素基因及其上下游部分序列Km^r，如SEQ ID NO：9所示；

(2)以限制性内切酶EcoRI和KpnI处理pUC118载体和步骤(1)得到的sigI-up片段，将sigI-up插入到pUC118上得到pUC118-up质粒；以限制性内切酶BamHI和HindIII处理pUC118-up和步骤(1)得到的sigI-down片段，将sigI-down插入到pUC118-up上得到pUC118-up-down质粒；以限制性内切酶BamHI和KpnI处理pUC118-up-down和步骤(1)得到的Km^r片段，将Km^r插入到pUC118-up-down上得到pUC118-up-down-Km^r同源双交换质粒；

(3)将pUC118-up-down-Km^r质粒以自然转化的方式转入集胞藻PCC6803中，得到的转化子以不同浓度的卡那霉素进行筛选，并在DNA水平上进行鉴定，最终得到sll0687基因完全敲除的单克隆藻株，即对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名为IK2。

一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，通过上述方法得到。

通过上述方法构建的集胞藻PCC6803藻株IK2对乙醇的耐受能力显著提高，其在含1.5％(v/v)乙醇的BG11培养基中的生长状态明显优于野生型藻株。

所述的对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株可用于构建生产燃料乙醇的基因工程菌。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明的方法是通过同源重组将集胞藻PCC6803中的sll0687基因进行敲除，应用此方法得到的集胞藻PCC6803藻株IK2对乙醇的耐受能力显著提高。在1.5％(v/v)的乙醇胁迫下，该藻株的生长状态明显优于野生型藻株。本发明得到的乙醇耐受性藻株对构建生产燃料乙醇的基因工程菌具有重要的理论和实际意义，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是pUC118-up-down-Km^r质粒的结构示意图。

图2是以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3为引物对IK2藻株进行PCR鉴定的琼脂糖电泳图；图中泳道1是以野生型基因组为模板，泳道2是以IK2基因组为模板，M为marker，箭头指向的位置为2042bp。

图3是集胞藻PCC6803野生型WT和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下 的生长曲线图，图中E代表乙醇。

图4是集胞藻PCC6803野生型WT和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的藻液的颜色，图中藻为生长曲线中第4天的状态。

图5是集胞藻PCC6803野生型WT和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的全细胞吸收图；A图为野生型，B图为IK2和野生型WT乙醇胁迫下全细胞吸收图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实施例中使用的集胞藻PCC6803野生型藻株从ATCC27184中分离纯化得到，ATCC是美国菌种保藏中心的简称，27184是菌株编号。质粒pUC118购自Takara公司，pET-30b购自Novagen公司。

实施例1

同源重组双交换质粒pUC118-up-down-Km^r的构建：

(1)插入片段的扩增：

以序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增得到sll0687基因上游序列sigI-up，如序列表中SEQ ID NO：7所示；以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为上、下游引物，以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，通过PCR扩增得到sll0687基因下游序列sigI-down，如SEQ ID NO：8所示；以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为上、下游引物，以pET-30b质粒为模板，通过PCR扩增得到包含卡那霉素基因及其上下游部分序列Km^r，如SEQ ID NO：9所示。本发明中集胞藻PCC6803的基因组提取采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(广州东胜生物科技有限公司，货号N1191)，质粒提取采用高纯度质粒小量提取试剂盒(广州东胜生物科技有限公司，货号N1011)。

PCR反应采用20μL体系：模板1μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2μL，dNTP Mixture(各2.5mM)1.6μL，上游引物1μL(10μM)，下游引物1μL(10μM)，rTaq酶0.2μL，ddH₂O 13.2μL。向PCR管中加入各反应组分，短暂离心后，置于PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度一般比引物Tm值低5～10℃，时间为15s；延伸， 72℃，每扩增1kb DNA需1min；循环，变性-退火-延伸的循环38个；72℃，5min；16℃，10min。

PCR产物大小经琼脂糖电泳验证，与理论长度一致。在进行后续实验前，各PCR产物还需胶回收纯化。

(2)插入片段与质粒的酶切连接

以限制性内切酶EcoRI和KpnI对步骤(1)得到的sigI-up片段和pUC118载体进行双酶切。插入片段的双酶切采用30μL体系：DNA 10μL，10×Buffer 3μL，两种快速酶切酶各1μL，ddH₂O 15μL。质粒的双酶切采用20μL体系：DNA10μL，10×Buffer 2μL，两种快速酶切酶各1μL，ddH₂O 6μL。酶切反应温度为37℃，时间为1h。反应结束后，80℃温浴5min，灭活酶。酶切产物经胶回收纯化后，以T4DNA连接酶进行连接反应。连接反应采用20μL体系：插入片段DNA 12μL，质粒DNA 5μL，10×Buffer 2μL，酶1μL。连接反应温度为16℃，反应8h后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中。对长出的转化子进行鉴定是否连接成功，连接成功的质粒经Sanger测序确认，从而得到质粒pUC118-up。以相同的酶切反应和连接反应条件，将sigI-down片段和pUC118-up质粒连接，酶切位点为BamHI和HindIII。对连接成功的质粒进行验证，从而得到pUC118-up-down质粒。最后，将Km^r片段和pUC118-up-down质粒连接，酶切位点为BamHI和KpnI，最终得到同源重组双交换质粒pUC118-up-down-Km^r。

得到同源重组双交换质粒pUC118-up-down-Km^r中sigI-up、sigI-down和Km^r的连接顺序如图1所示。

实施例2

对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株的获得：

(1)质粒转化

将pUC118-up-down-Km^r质粒用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，装入2mL无菌离心管中。向其中加入一定量BG11培养基(已加入HEPES缓冲液)，使质粒终浓度约为10ng/μL。取30mL处于对数期的野生型PCC6803，6000rpm离心7min，去上清。用20mL新鲜BG11培养基重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清。用含质粒的培养基把藻泥重悬。将重悬的藻液在29℃，150rpm，1400Lux连续光照培养6h。将藻液涂于铺有混合纤维滤膜的固体培养基中光照培养1天(正置培养)后，将膜转移至含有10μg/mL卡那霉素的固体培养基中，光照培养数天至膜表面长出单藻落。最后，将长出的藻落转移至含有相同浓度卡那 霉素的20mL BG11小瓶培养基中培养，待长至对数期后转接。

(2)藻株筛选

将(1)中得到的藻液进行转接培养，培养条件为29℃，150rpm，1400Lux连续光照。转接时，将BG11培养基中抗生素浓度提高到20μg/mL。待长至对数期再进行转接，以后每次转接培养基中抗生素的浓度提高10μg/mL。当培养基中的抗生素浓度达到50μg/mL时，将藻液平板划线。待平板上长出单藻落后，挑取单藻落至含有相应抗生素浓度的BG11培养基中培养。当藻长至对数期后，提取该藻的基因组。以此基因组为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3为引物进行PCR，同时以野生型基因组作为对照。本发明中PCR反应体系和程序与实施例1中相同。将PCR产物进行琼脂糖电泳，鉴定该藻基因组中的sll0687基因是否完全被Km^r替换掉。以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3为引物，在野生型中扩增得到的片段是sll0687基因及其上下游序列，长度为2042bp；在目标藻株中，扩增得到的片段是Km^r基因及sll0687基因的上下游序列，长度为3059bp。若完全替换，藻株筛选完成。否则，继续提高抗生素浓度进行筛选鉴定。筛选得到的sll0687基因完全被Km^r替换掉的藻株即为对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株，命名为IK2。

图2是以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3为引物对IK2藻株进行PCR鉴定的琼脂糖电泳图，图中泳道1是以野生型基因组为模板，泳道2是以IK2基因组为模板。从图中可以看出，野生型的片段在2000bp左右，与理论计算的2042bp长度接近；IK2的扩增片段长度比野生型的大，位置与理论计算的3059bp的位置接近，同时在2042bp处没有条带。除此之外，野生型和IK2的PCR产物的序列均已Sanger测序验证，与理论一致。这说明，IK2中的sll0687基因已被Km^r替换掉。

本发明中所用BG11培养基配方：1L培养基中含有NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，EDTA 0.001g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，Na₂CO₃ 0.02g，H₃BO₃ 0.00286g，MnCl₂·4H₂O 0.00181g，ZnSO₄·7H₂O 0.000222g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.00039g，CuSO₄·5H₂O 0.000079g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0000494g。使用时，每50mL培养基中加入1mL 1mol/L的HEPES缓冲液(pH＝7.5)。配制固体培养基时，再加入2％的琼脂。

实施例3

IK2藻株在乙醇胁迫下的生长状态分析：

测定集胞藻PCC6803野生型和实施例2中得到的IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的生长曲线：将生长至对数期的藻作为种子液，接种至含有50mL BG11培养基中，每瓶藻的起始OD₇₃₀＝0.1。连续培养4天，每天取样测OD₇₃₀值，绘制生长曲线。培养条件为29℃，150rpm，1400Lux连续光照。开始培养时，在野生型和IK2实验组的培养基中加入乙醇至终浓度为1.5％(v/v)。实验组和对照组各三个平行。

集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的全细胞吸收光谱测定：取2mL生长曲线测定中培养至第4天的藻液，用UV-2300紫外分光光度计进行波长扫描，扫描范围为400～800nm，扫描速度为400nm/min。测量前，先用BG11培养基进行基线校正。以波长为横坐标，以对应的OD值为纵坐标作图绘制全细胞吸收光谱图。各样品的全细胞吸收光谱图以730nm处的OD值进行归一化处理。

图3为集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的生长曲线图，图中WT代表野生型，E代表乙醇。从图中可以看出，在乙醇胁迫下IK2的生长曲线明显高于野生型。

图4为集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的藻液的颜色，图中藻为生长曲线中第4天的状态。从图中可以看出，乙醇胁迫的野生型颜色与正常培养的野生型颜色差别较大，乙醇胁迫的野生型的藻的颜色发黄，颜色淡。而乙醇胁迫的IK2的藻颜色与没有乙醇处理的IK2藻的颜色接近，无明显差别。

图5为集胞藻PCC6803野生型和IK2藻株在1.5％(v/v)乙醇胁迫下的全细胞吸收图，A图为野生型，B图为IK2，B图中的点状虚线为乙醇胁迫下的野生型。从A图中可以看出，在乙醇胁迫下，野生型的叶绿素峰和藻蓝蛋白峰显著降低。在B图中，乙醇胁迫的IK2的叶绿素峰和藻蓝蛋白峰与正常藻相比也有所降低，但比乙醇胁迫的野生型的峰高，说明乙醇对IK2光合作用的影响比野生型小。

综合图3、图4和图5的数据可以说明，IK2对乙醇胁迫的耐受性明显优于野生型。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。